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1、第六章 渔药安全性评价,渔用药物与其他医用、兽用药品、农药、饲料添加剂以及各种工业用及生活用化学药品一样，在推广应用以前，均需要检验其毒性和安全性，即进行毒理学方面的试验研究和安全性的毒理学评价，只有被试验证明是安全而有效的渔用药物，才能获准进入临床应用阶段。,第一节 渔药毒理学简介第二节 渔药的安全评价,第一节 渔药毒理学简介,毒理学（toxicology）：是研究化学、物理、生物等因素对生物机体负面效应的综合性学科。渔药毒理学：主要是研究渔用药物对水生动、植物体的有害影响，包括这些有害影响发生的程度、频率和发生的机制，以及如何应用毒理学资料预测渔药对人类和环境生态的潜在危害，从而达到控制和
2、预防这类危害发生的目的。,毒理学研究的范围很广，包括毒物的来源、化学结构、理化性质、毒性、影响毒性的因素、毒物代谢动力学、毒物的生物转化、作用机理、中毒的诊断症状、病理变化、组织病理、中毒的诊断、毒物的检测方法、中毒的治疗与预防等。此外毒理学还研究毒物的一些特殊作用，如“三致”作用、免疫抑制作用、行为异常、遗传异常、对生殖的影响、对生态的影响以及毒物及其他化学物质之间的联合作用和相互作用等。,现代毒理学的研究方法可概括为实验室方法、临床观察和现场调查、综合危险度评定等三大类。渔药毒理学的研究内容主要包括以下几个方面：即急性毒性试验、亚急性毒性试验和慢性毒性试验、致突变试验、生殖毒性试验、致癌试
3、验、临床毒性观察和其他毒性试验等。渔药毒理学试验又可大致分为两类：一般毒性试验和特殊毒性试验,一般毒性试验指那些不以观察和测定某种特定的毒性反应为目的而设计的毒性试验，所观察的毒性指标具有广谱性和不确定性等特点，如急性、亚急性、慢性（或终身）毒性试验等。,特殊毒性试验指以观察和测定药物能否引起某种或某些特定毒性反应为目的而设计的毒性试验，毒性指标明确。狭义的特殊毒性试验是指致畸、致突变、致癌等“三致”试验。广义的特殊毒性试验还包括过敏性试验、局部刺激试验、免疫毒性试验、光敏试验、眼毒试验、耳毒试验等。,在毒理学试验研究的设计中，都应该特别注意剂量、给药途径、动物种属和给药次数与观测期限等方面。
4、,毒性试验,一、急性毒性试验二、亚急性毒性试验三、慢性毒性试验四、特殊毒理学试验五、行为回避反应六、毒代动力学研究,一、急性毒性试验,急性毒性试验是在1d内单次或多次（23次）对实验动物给予药物后，在7d内，连续观察实验动物所产生的毒性反应和死亡情况，观察毒性反应过程中毒性的表现，分析毒性主要涉及何种组织和器官，毒性反应出现的时间、毒性损害的严重程度，是否可以逆转消失。如果实验动物中毒死亡应及时解剖，进行尸检，如果发现病变器官就应该进一步做病理学检查。,急性毒性试验的目的:1.确定受试药物的毒性强度；2.计算治疗指数（therapeutic index,TI），半数致死量LD50和半数有效量E
5、D50的比值即治疗指数；3.观察毒性症状为临床检测毒性提供参考依据，4.为亚急性、慢性毒性的试验设计提供参考资料。,药物急性毒性的测定，可分为静水式生物测试法和流水式生物测试法两种。常以开始致死浓度（ILL）、半数致死浓度LC50和半数有效量ED50或半数忍受限（TLm），并结合该渔药引起受试生物体中毒的症状和特点，评价被测试渔药毒性的强弱以及它对水环境的污染程度，为制定该渔药的最高用药量或环境中最大允许浓度（MATC）提供基本数据。,由于急性毒性试验的水生动物，常以小型个体为主，其中主要是各种鱼类。通常要选择敏感性高、来源广、易于饲养的品种，如鲢、草鱼，也可以选用金鱼、鲤鱼、黄鳝等。一般选用
6、的动物个体差异不应过大（同一批试验中，最大个体与最小个体规格差异应不超过1.5倍），以体重小于5.0g体长小于7.0cm的较好。,进行毒性试验之前，首先将受试动物在实验室内养殖7-10d，剔除有病或畸形个体后随机分组进行试验。试验时，要控制水温保持恒定：以温水性鱼类为25，冷水性鱼类为12为宜。溶解氧要稳定在5.0mg/L以上，pH控制在6.5-8.5之间。静水试验每日至少换一次试验溶液，流式试验每24h要换95%的新试液。试验期间，对照组受试动物的死亡率应低于5%。,在急性毒性试验期间，对受试动物一般不投喂饵料，从致毒开始，观察记录受试鱼类的中毒表现，生理、生化变化和死亡情况。并将观察结果采
7、用内插法或几率单位-对数图解法求出实验动物的开始致死浓度（开始致死水平，ILL）、全部死亡的最小浓度（LC100）和半数致死浓度LC50。,急性毒性的参数：半数致死剂量LD50,在测定药物毒性的实际工作中，往往要先做预备试验，大概了解药物引起受试动物全部死亡和不引起死亡的剂量范围，再将受试动物分为几组，各组给予不同的剂量，然后观察各组的死亡率。,各组动物的死亡率随着剂量增加而递升，但是两者不是直线关系，呈长尾的“S”型曲线。如果将剂量值变换成对数值，则死亡率的曲线成为一条对称的“S”型曲线，这条曲线的两端伸延平坦，即上升速度较缓慢。药物毒性性试验中，死亡率从开始上升阶段和邻近100%死亡的终了
8、阶段，剂量的增加所引起的死亡率上升是比较缓慢的，即在两端处的剂量稍有变动时，在死亡率上不宜表现出来。而在中间阶段，即在50%死亡率处，剂量稍有增减变动时，便立即会在死亡率上产生明显的差别。,由此可见，位于曲线两端的最小致死量和绝对致死量等指标都不够敏感，且稳定性较差，误差较大，若作为药物毒性测定的主要指标是不合适的。而位于曲线中段的半数致浓度最为敏感，同时也比较稳定，误差小，所以半数致死浓度是用来表示和衡量某药物（或毒性）大小较常用的指标。,LC50测定方法在许多统计学专著中都有详细的论述和应用举例。LC50测定方法虽然众多，其实影响LC50测定结果准确性的因素不是计算方法的不同，其关键是试验
9、设计应符合要求，药物剂量大小的确定，药物称量与配制，受试动物的种类、体重、性别、健康状态，给药操作的熟练程度。下面介绍两种简便的测定计算LC50的方法,1.目测概率单位法（绘图法、直线内插法）,将试验剂量换算成对数剂量，死亡率换算成概率（机率）单位，使剂量-死亡率曲线直线化。即按剂量与死亡百分数直接在图纸上绘出LC50。步骤如下：1）编制计算表将剂量换算成对数剂量（X）；将死亡率换算成概率单位（Y），死亡率为0或100%者不列入。计算表应含剂量、对数剂量、动物数、死亡动物数、死亡率、概率单位等项目。,2）用目测法求LC50依据计算表中数据，以图纸的横坐标为对数剂量（X），纵坐标为死亡率的概率单
10、位（Y），绘制散点图。然后顺着各点分布的趋势目测较适直线，可先执一条黑线在点图上移动，使点子大体上交错分布在直线的上下，各点至直线的纵向距离应尽量短些，并重点照顾Y=5附近的点子。黑线位置确定后，即用铅笔在图上定下两点，然后作一直线。从纵坐标概率单位为5处作一水平线，过水平线与直线的交点作垂直线与横坐标相交，此处的读数极为LC50的对数值。,3）求LC50的可限区间上面所求得的LC50是一个样本指标，只能作为总体LC50的点值估计，同时也可对总体LC50做范围估计，即求总体LC50的可信区间。A.按下式求各致死量对数值的标准差B.按下列公式求半数致死量对数值的标准误C.按下式求半数致死量的95
11、%可信区间,在实验设计上，本法要求剂量按等比数级排列，如出现相邻的重复0或100%，应将靠边的组弃去不计，是小剂量组只有1组0，大剂量组只有1组100%。算式如下：其中Xm最大剂量的对数i相邻两剂量比值（高剂量为分子）的对数p各组的死亡率，以小数表示。,2.改进寇氏（karber）法,急性毒性试验举例,急性毒性一般根据LC50的大小，参照急性毒性的标准进行评价。更多的则是采用渔药的安全浓度进行评价。,国内外关于药物安全浓度的评价方法，主要有以下几种：1.经验公式，即安全浓度=96h的半数致死浓度（96h LC50）0.12.律纳方法（Reineya），即试验生物10个或20个在不同的药液浓度中
12、养殖，10d能全部存活的药液浓度极为该渔药的安全浓度。3.特伦堡（Tumbell）公式 4.Pichering等方法 通过试验得出该渔药对实验动物的最高允许浓度（MATC），然后除以96h的LC50，得出其应用系数（AF），带入下公式求出安全浓度：,二、亚急性毒性试验,亚急性毒性试验：是为了观察受试动物在较长的时间内（一般在相当于1/10左右的生命时间内），少量多次地反复接触受试渔药所引起的损害作用或产生的中毒作用。亚急性毒性试验又称短期试验、亚慢性毒性试验。亚急性毒性试验是评价渔药毒性重要和有效方法之一。,进行亚急性毒性试验的目的：为了进一步了解受试渔药在受试动物体内有无蓄积作用；实验动物能
13、否对受试渔药产生耐受性；测定受试渔药毒性作用的靶器官和靶组织，初步估计出最大无作用剂量及中毒阈剂量，并确定是否需要进行慢性毒性试验，为慢性毒性试验剂量的选择提供依据。,亚急性毒性试验常用的试验方法有：1.细胞培养 如敌百虫、六氯苯、汞、锌对细胞有丝分裂的抑制作用；苯能引起细胞染色体损伤和畸变率增高。测定培养细胞中RNA的合成，可反应药液或污染物对细胞的毒性作用。2.组织病变 如鱼类接触苯酚，可影响肝脏正常功能，使肝组织空泡化；重金属能破坏鳃组织，使鳃丝上皮肿胀，柱状细胞分解及坏死。,3.生理生化等指标的测定 如锌能使鱼类血液中淋巴细胞数量减少；有机磷农药和氨基甲酸酯农药对胆碱酯酶的活性有特异的
14、抑制作用。4.对鱼类呼吸活动影响 一般是通过测定耗氧率、鳃盖活动频率或呼吸率等指标研究药物对鱼类呼吸活动影响。,亚急性毒性的评价方法是将试验数据汇总成表，进行相应的统计处理和分析，并根据中毒时出现的症状，以及停药后组织和功能损害的发展和恢复情况做出综合性评价。,三、慢性毒性试验,慢性毒性试验：是指向受试动物反复多次给药，连续给药超过90d，对水产动物而言，给药时间几乎占去生命周期的大部分时间甚至终生。,慢性毒性试验的目的是为了观察受试动物长期连续接触药物对机体的影响。通过实验动物了解药物的毒性反应、剂量与毒性反应的关系、药物毒性的主要靶器官、毒性反应的性质和程度及可逆性等，动物的耐受量、无毒性
15、反应的剂量、毒性反应的剂量及安全范围，毒性产生时间、达峰时间、持续时间及可能反复产生毒性反应的时间，有否迟发性毒性反应，有否蓄积性或耐受性等。总之，通过慢性毒性试验，可以了解短期试验所不能测得的反应，从而可以确定最大无作用剂量。,慢性毒性试验的方法与亚急性毒性试验在试验设计、观察指标等方面基本相同。慢性毒性试验一般是在急性毒性试验和亚急性毒性试验的基础上进行的，根据急性和亚急性毒性试验数据设置试验浓度。,试验可从胚胎或鱼苗阶段开始，也可从性腺还未发育成熟的幼鱼开始，一直延续到鱼的生长发育成熟，以至产卵孵化。由于试验时间较长，一般需要使用流水装置，以保持药液浓度恒定和鱼类生存的良好条件。此外，还
16、要注意食物、氧气、pH等适宜鱼类的生长条件；,所得到的存活率、生长率、产卵率和孵化率等数据，采取统计的方法进行处理，以此求出渔药对试验对象的最大允许浓度。除此之外，检测鱼体内的蓄积也有较大的价值。有些药物，不仅在试验的第一个生活周期，而且持续三代仍可检出有蓄积的现象，如甲基汞在鱼体内迅速蓄积，第二代和第三代的鱼卵和胚胎中均有从亲鱼转移下来的大量汞残留。,由于慢性试验的周期较长，为了缩短周期，可寻找成熟时间短的无脊椎动物作为试验对象，还可探索采用短期毒性试验的方法预测慢性毒性的可能性。慢性毒性试验是毒理学研究中试验周期最长、困难最大、耗资最高、难以进行重复的试验，对于新药研究成功与否具有重要的作
17、用。慢性毒性试验是临床前安全性评价的主要内容，它还为临床安全用药的剂量设计以及毒副作用监测提供参考依据。,四、特殊毒理学试验,特殊毒理学试验也称专门毒性试验，主要包括繁殖试验、致畸试验、致突变试验和致癌试验等。,1.繁殖试验是检验受试药物对实验动物生殖机能影响的一种方法。试验项目有一般生殖毒性试验（喂养致畸试验）、传统致畸试验和喂养繁殖试验。在水产动物中还广泛应用胚胎毒性试验。试验目的是为了了解药物对实验动物生殖机能的影响以及胚胎毒性，并为致畸试验提供资料。,实验动物为小鼠或大鼠，有时也用兔。一般设计3个药物剂量组和1个对照组。最高剂量应产生轻度毒性反应；最低剂量为治疗有效剂量的23倍。给药途
18、径与临床用药相同。给药时间：一般生殖毒性试验为雄性交配前60d，雌性交配前14d。繁殖试验为大鼠断奶后开始饲喂受试药物，直到90d。传统致畸试验为胚胎器官形成期（7-15d）开始饲喂受试药物。,胚胎毒性，广而言之是渔药对动物胚胎产生的毒性作用。如以鱼类作为试验对象，因鱼类胚胎在不同发育阶段，对药物敏感性会有所不同。其毒性可以表现出胚胎死亡、胚胎发育迟缓、胚胎畸形及胚胎功能不全等四个方面。,试验用鱼卵要求对受试药物比较敏感，并且便于观察。属于半漂浮性的鲢、鳙、草鱼、青鱼的鱼卵符合这个要求。特别是草鱼卵，其卵胚发育初期有明显的蓝绿色、比鲢卵胚的淡蓝色（有的略呈淡灰色）容易观察。金鱼、圆尾斗鱼、食蚊
19、鱼等小型观赏鱼类，易于繁殖，便于取材，也可作为渔药毒性测试的鱼卵。,试验鱼数量可以视容器大小，鱼类品种而定，一般为20-100个。为了便于观察胚胎发育，可采用透明的玻璃皿，如培养皿、培养缸等作为试验容器，但是以能盛溶液200-500ml的容器较好。去用试验的鱼卵，必须首先确定它们是受精卵，一般待发育过原肠中期时方开始毒性试验。,胚胎毒性试验处理的方法有两种：一种是以受试药物处理亲鱼，如对产卵的试验亲鱼每日定时定量投喂含有一定量渔药的饵料，或者把亲鱼饲养于含有试验渔药的水中，使其接触吸收药物，或者对亲鱼人工注射一定剂量的药物，取其人工授精或自然受精的卵使用。另一种是在正常的鱼卵，将其直接放入含有
20、受试渔药的溶液中处理。,受试药物的浓度，一般根据96h的LD50值为基础，按其比例递减的方式设计试验浓度，但是必须包括鱼卵全部死亡的最小浓度（LC100）与鱼卵全部存活的最大毒物浓度（LC0），以便能获得半数忍受限、开始致死浓度及阈浓度等。,2.致畸试验致畸试验是为了了解受试药物是否通过母体对胚胎发育过程(主要是胚胎的器官分化过程)产生不利影响。对鱼类的致畸试验可以利用亲鱼和受精卵进行。胚胎畸形是观察指标之一。,其致畸原(teratogens)可以从两个方面分析。一是来自亲鱼母体，由于通过母体的血液循环传递至生殖腺，如敌百虫、敌敌畏等许多药物就易于在母体的生殖腺内积累，经卵母细胞的二次成熟分裂
21、，脱离滤泡排卵，产卵受精直至孵化，于卵黄囊吸收阶段方显示出较强的毒性，出现畸形胚胎，导致发育迟缓，功能不全以致死亡。另一方面，由于受精卵直接接触外来药物。尤其以卵胚的早期发育阶段，特别是在囊胚期之前，极易引起畸形的现象。,对哺乳动物具有致畸性的有毒物质能引起胎儿非致死性的组织或机能变化，例如导致腭裂、并趾、骨化延缓、肋畸形、肾发育不全、畸形足等仔胎畸形。,致畸试验是在胚胎细胞分化和胎儿组织形成期给受孕动物饲喂受试药物，然后在分娩期观察仔胎是否出现畸形以判定受试药物的毒性。过早地给予受试药物可能会影响受精卵的着床过程，此时胚胎对致畸物的反应往往不敏感，过迟给予受试药物，则胚胎发育基本成熟，致畸作
22、用就可能不会显示出来。,实验动物常用小鼠、大鼠和兔。剂量分组方法与慢性毒性试验相同，至少应用3种剂量。一般以最大无作用剂量用于高剂量组，以其130左右的剂量用于低剂量组。一般小鼠与大鼠于妊娠6-15d，兔于妊娠6-18d饲喂受试药物，至妊娠结束前1-2d，以手术方法从母体内取出胎儿，检查每个活胎有无外观畸形，并进行特殊的固定或染色以检查胎儿脏、脑部及骨骼畸形等。,根据各组动物畸胎出现的数量及所产活胎总数，计算畸胎发生率。经统计处理后求出最小致畸剂量，并以致畸指数比较不同毒物的致畸强度。致畸指数=AB 式中A母体的LD50 B最小致畸剂量。一般认为致畸指数在10以下的毒物为非致畸物，10-100
23、者为致畸物；100者为强致畸物。,3.致突变试验致突变毒性是指生物细胞的遗传物质出现可被察觉并可遗传的变化，它包括基因突变和染色体畸变。致突变试验的项目包括1）微生物回复突变试验、2）哺乳动物培养细胞染色体畸变试验3）微核试验,1）微生物回复突变试验（Ames试验）所用微生物为组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌的TA97、TA98、TAl00、TAl02，或大肠杆菌WP2的若干株。上述4株鼠伤寒沙门氏菌常用。应在加肝微粒体酶(S9)混合物和不加S9的平行条件下实验，受试动物至少5个不同剂量，另设阴性对照组和阳性对照组。最大剂量可达每皿5.0 mg，最小剂量不得小于有效浓度和药量。,2）哺乳动物培养细胞
24、染色体畸变试验 用哺乳动物原代或传代培养细胞进行。设3个以上受试药物组，1个阴性对照组，1个阳性对照组。最大剂量应以50%细胞生长抑制浓度为准，最低剂量不得小于有效治疗剂量的23倍。,3）微核试验 用性成熟的小鼠进行。最少设3个受试药物剂量组，1个阴性和1个阳性对照组。最大剂量应以12LD50为准，最小剂量不得小于治疗有效剂量的23倍。,以上3种试验均应按规定的方法作结果判定。阳性对照药物应获得阳性结果，溶剂对照的阴性组应获得阴性结果。否则结果无效；应重新试验。根据农业部有关新兽药特殊毒性试验技术要求规定，致突变试验必须至少做三项试验，其中Ames试验和微核试验为必做项目，精子致畸、睾丸精原细
25、胞染色体畸变、显性致死突变试验三项可任选一项，如果前二者任何一项为阳性，均必做显性致死突变试验。致癌试验较为复杂，国内因受条件限制，新兽药的特殊毒性试验中暂未列入。,4.致癌试验对于化学结构与致癌有关，致突变试验为阳性，或毒性试验提示有可能致癌的药物，必须进行致癌试验。选择实验动物应根据动物对某种受试药物致癌作用反应的敏感性决定。大鼠或小鼠对多种致癌物的反应较敏感，故致癌试验一般多选用大鼠或小鼠，有时还需要增加一种非啮齿类动物如犬和猴。,此外，根据试验要求，也可选用其他动物，如雏鸭对黄曲霉毒素诱发肝癌的作用较敏感，鸡对致食管癌因子较为敏感。选择动物时，应对所选动物的肿瘤自然发生率有所了解。由于
26、本实验持续时间较长，为使实验动物的肿瘤发生率与对照组相比具有明显的显著的差异，并考虑到试验中途动物可能发生死亡等因素，实验动物的数量不宜太少，一般情况下，啮齿类动物每个剂量组中雌雄至少各25-50只，犬、猴每组4-6只。,试验期限通常要求从断乳开始（有时在断乳前开始）直到自然死亡，几乎包括整个生命期，因为大量的肿瘤多数发生在生命后期。此外，试验期限长可使某些致癌性较弱的受试药物充分显现其作用。小鼠试验期至少为一年半，大鼠至少为2年。若试验已进行一年半或2年，出现肿瘤的情况仍不甚显著时，则应继续延长，一般在动物接近自然死亡期前进行病理剖检，以免因自然死亡而影响病变的观察。,试验过程中要求经常观察
27、动物的一般状况，定期检查和记录肿瘤的总发生率、各种肿瘤发生率和肿瘤出现期限等指标。病理学检查是评定受试药物致癌作用的主要依据，在病理剖检时应仔细检查每一个器官，发现肿瘤或疑似肿瘤的组织器官均应进行细胞病理学检查，小动物的脏器较小，应做系统的组织学检查。,在对照组与试验组(给药组)之间进行如下比较：对照组中出现的某种肿瘤在试验组中的发生率是否增高。在试验组中是否出现某种在对照组中从未见到的肿瘤。上述两种情况是否在试验组中同时发生。,如对某种动物无论多大剂量的药物均发现有明确的致癌作用，则认为对人有致癌的潜在性，定为致癌阳性。如果在受试的两种动物均为阴性结果，可定为致癌阴性。有些化学物质，在应用高
28、剂量时对实验动物的致癌性轻微，欲测定其在极低量时是否引起公害则很困难。饲料添加剂及农药残留的致癌问题在动物毒理学中十分重要。,关于渔药施药后对水产动物(鱼、虾等)及人体致毒、致癌评价常用以下公式：式中 HCC一致毒致癌基准(mgL)；RAI每日有危险物质摄入量(mgkgd)；WA平均体重(kg)；Wt成人每日消费量(mgkgd)；F鱼虾的消费率；BCF毒物、药物的生物浓缩因子。,渔药引起鱼类的回避，是鱼类对外界环境刺激的一种保护性反应，它是通过嗅觉、视觉、侧线及其他感受器而实现的。回避反应是一种生理效应，当外界环境物质对鱼类某一感官产生刺激，就会导致其行为的改变。利用鱼类的回避特性，可以在一定
29、程度上判定渔药毒性的大小与作用的持续情况。,五、行为回避反应,回避试验装置，是进行回避试验的基本条件。目前国内外所用的装置种类很多，形式不一，且各具特色。主要装置有：管道型回避槽、分叉型回避槽、TL一81型鱼类回避槽、环型回避槽。试验时，先将试验鱼放入回避槽进行驯化，然后分别放入清水与试液，记录鱼类在各只槽内的停留时间与进入次数，计算出不同浓度内鱼类回避的百分率，以判断试鱼类对受试渔药的回避反应。,六、毒代动力学研究,急性和慢性毒性试验，是考察药物在不同剂量水平产生毒性的表现和程度，剂量和给药时间与毒性的关系，毒性靶器官与药物的关系等，但是并未涉及体内药物浓度及其在体内驻留蓄积的问题。开展毒代
30、动力学研究，对于理解药物毒性实验结果，发现毒性的剂量水平和时程的关系，提高毒性研究资料的价值等均具有意义。,毒代动力学试验是毒理学研究的一个重要组成部分。它能提供毒代动力学参数比较全身染毒(systemic exposure)与毒性的关系。与药物代谢动力学研究不同，毒代动力学是在毒性试验条件下进行研究，用于解释毒性试验结果，而不是为了描述药物动力学的基本特征。,毒代动力学研究的主要目的：一是在毒性实验条件下药物所达到的全身染毒与毒性发现的内在联系；二是比较实验动物和靶动物的全身染毒来解释毒理实验数据的价值；三是为临床前毒性研究的实验设计，如动物种属、实验剂量和用药方案的设计提供依据。最终目的是
31、通过不同毒性实验中的毒代动力学研究，并与不同的毒性研究结果一起为药物的安全性评价提供依据。,1.毒代动力学研究的设计 毒代动力学试验设计应遵循以下基本原则：首先，与药代动力学研究一样，要求建立专属性好、灵敏度高的血药浓度测定方法。其次，研究采用与药物临床应用和动物毒性研究相同的给药途径和剂型，以便比较不同种属动物的药物全身染毒程度与毒性之间的关系。,其三，测定目标物可以是原型药物，也可以是活性代谢物。当药物代谢成数种活性代谢物时，而且产生毒性的活性代谢物明显影响组织或靶组织反应时，应主要测定其代谢物的浓度。其四，数据和参数统计，通常以平均值和变异系数(或相对标准差)表达。,2.毒代动力学的研究
32、内容 毒代动力学的研究一般包括在毒性试验中的单剂量试验、多剂量试验、组织分布试验、遗传毒性试验、致癌试验、生殖毒性试验以及特殊药物(如生物技术药物)的毒代动力学研究。研究方案要根据不同的试验来制定。,单剂量试验：单剂量试验中的毒代动力学研究，有助于确定试验剂赶方案，预测给药期间药物全身染毒的速度、程度和持续时间。多剂量和慢性毒性试验：多次给药毒代动力学试验的设计原则是，试验方案和动物选择应与药效学研究和药代动力学研究相符。组织分布试验：单剂量给药的组织分布研究，应作为药物临床前安全性评价的组成部分。,出现以下情况时应考虑进行多剂量给药的组织分布试验研究：单剂量时出现或提示，药物或代谢物在器官或
33、组织中蓄积分布半衰期较长；在药代动力学和毒代动力学研究中，血液循环中药物或代谢物的稳态浓度显著高于单剂量给约研究中所预测的浓度；单剂量组织分布试验和药理试验中，发现关键性组织分布与组织的病理变化相关；拟开发具有特异性分布的靶向释放药物时。,多剂量给药的组织分布试验的设计，应有针对性地选择一定的剂量和特定种属的动物。应利用已有的药代动力学和毒代动力学资料，设计给药时间和选择目标组织进行测定。一般给药不得少于1周，血浆药物或代谢物浓度未达到稳态时也不必长于3周。对于半衰期长的药物、不完全消除的药物，或具有不可预见的毒性靶器官分布的药物，多剂量组织分布试验方案设计和给药时间的确定应有区别。,第二节
34、渔药的安全评价,渔用药物的不合理使用，会对用药的水产动、植物、水产食品的消费者(人)和环境生态产生有害影响。为了保障人、动物健康和环境不被污染，避免含化学物质残留的水产品对人引起有害反应，就必须对食品动物所能接触的各种化学物质(如药物、添加剂、工农业污染物、生物毒素等)进行安全性评价。,药物安全性评价，主要包括毒理学评价靶动物毒性评价残留安全性评价环境的安全性评价,一、毒理学评价,毒理学评价主要包括四个阶段：急性毒性试验阶段蓄积毒性和致突变试验阶段亚慢性毒性试验（包括繁殖试验和致畸试验)和代谢毒性试验阶段慢性毒性试验阶段(包括致癌试验）,1.急性毒性试验 目的是要了解受试药物毒性的强度和性质，
35、为蓄积亚慢性试验的剂量选择提供依据。试验项目包括测定经口LD50。如剂量达10.0 gkg b.w仍不引起动物死亡，则不必继续测定，必要时尚需进行7d喂养试验。如LD50或7d喂养试验的最小有效量小于人可能摄入量的10倍，此化合物应放弃，不得用于食品动物。如10倍，可进入下一阶段试验。,2.蓄积试验 急性毒性试验LD5010.0gkg b.w.者，可不必进行蓄积毒性试验。蓄积试验可用蓄积系数法或20d试验法。如蓄积系数(k)3，为强蓄积性；k 3为弱蓄积性。在20 d试验中，如果120 LD50剂量组动物有死亡，而且有量效关系，则为强蓄积性；如120 LD50剂量组动物无死亡，则为弱蓄积性。强
36、蓄积性化合物应放弃。,3.亚慢性毒性试验和代谢毒性试验 亚慢性试验的目的，是观察受试药物以不同剂量长期饲喂，对动物的毒性作用性质和靶器官，并确定最大无作用剂量；了解受试药物对动物繁殖功能的影响以及对其子代的致畸作用；为慢性毒性和致癌试验的剂量选择提供依据，并为评价受试药物能否应用于食品动物提供依据。,试验项目包括90d喂养试验、喂养繁殖试验、喂养致畸试验和传统致畸试验。前3项试验可用同一批动物进行。如上述试验中的任何一项的最敏感指标的最大无作用剂量(以mgkg b.w.计)人的可能摄入量的100倍，就表明该化合物的毒性较强，应予放弃。如I00倍300倍，可进行慢性毒性试验。对于300倍者，则不
37、必再进行慢性毒性试验。,4.慢性毒性试验(包括致癌试验)目的是要发现仅长期接触才出现的毒性作用，尤其是进行性或不可逆的毒性作用及致癌作用；进一步确定最大无作用剂量，对最终评价受试药物能否用于食品动物提供依据。,实际工作中可将2种慢性毒性试验和致癌试验结合在一个动物试验中进行。可用2种性别的大鼠和(或)小鼠进行。如慢性毒性试验所得的最大无作用剂量人的可能摄入量的50倍，表示毒性较强，应予放弃；50倍而100倍者，可考虑允许使用于食品动物，并制订日许量（ADI）。如果任何一个剂量发现有致癌作用，且有量效关系，则需进行再评议，以做出评价。,靶动物的毒性评价就是直接用靶动物进行药理学试验，旨在确定药物
38、在靶动物可能的毒副作用或不良反应、毒副作用的剂量范围，从而提出减少或避免毒副作用的办法。,二、药物对靶动物的毒性评价,用靶动物进行毒性研究的目的：要证明受试药物在推荐使用条件下对靶动物的安全性；了解与受试药物毒性有关的症状和反应；若最大推荐量的5倍或不足5倍的剂量就能使受实验动物中毒，毒性研究应证明受试药物对动物的健康或生产不产生明显副作用的最大剂量；确定受试药物对受试动物的安全范围。,基本要求 试验设计要合理严格对照，由有经验的研究人员进行。实际工作中用采用盲样法。受试动物对照动物应具有相同的特点，一视同仁地对待，只是药物暴露不一样。在整个试验过程中临床观察应每日记录2次，每周7d。所有试验
39、组都应采用合适的临床病理学程序。若研究中包括组织学检查内容，组织应从所有动物或每组中一定数量的有代表性的动物(通常为一半或事先规定的量)中采取。试验组和对照组都应进行组织学检查。如果组织经显微观察有损伤，下一个较低剂量组的组织也应做相应检查，直到确定无可察性作用量为止。,1.动物耐受性试验 药物在受试动物体内的剂量反应曲线，是一个从无效到有效再至中毒反应的连续的动力学过程。人们感兴趣的是有效剂量和中毒剂量，以及两者之差所代表的安全范围(图42)。药物的耐受性试验是在对照条件下，确定靶动物对药物毒性剂量的反应。即通过诱导毒性和记录受试动物对特定剂量的临床症状来变化。这可提示药物中毒作用的临床表现
40、。一般而言，对于起局部作用的动物，不需做耐受性试验。,2.食用鱼的安全性评价 近年来水产业得到了迅速发展，无论是淡水还是海水水产养殖生产中都在广泛使用治疗药、防腐药、消毒药、麻醉药、渗透调节增强剂等各种药物。进行对食用鱼的安全性评价试验前，首先应该进行全面的文献检索，包括拟用于对照的每种疾病或综合征的病原、受感染鱼的种类、疾病的流行和危害、病原学中的环境或其他因素方面的资料，还应包括控制鱼病的技术资料。,治疗性化合物可以3种方式用于鱼类：添加于水中浸浴受试鱼类，混合于饲料投喂鱼类和直接注射鱼体。一般而言，对于外寄生虫和体表细菌感染症，可将药物添加于水中进行浸浴治疗，对于全身性细菌感染和内寄生虫
41、病，可通过制作药物饲料或注射给药对水产动物而言，温度是一种非常重要的外部因素因为鱼类是变温动物。温度变化也会影响受试水产动物对药物的代谢速度。其他环境因素的影响通常都比温度小。,对于口服给药，试验应选择标准的鱼种。对于温水鱼疾病预防的相关试验。可采用斑点叉尾鮰等鱼类进行。而虹鳟等可作为冷水鱼疾病预防试验的试验鱼。受试鱼的发育阶段依药物的用途而定。试验应在商业养殖条件下至少两种水温(反映生产实践)的范围进行，例如温水鱼为17和25，冷水鱼为12 和17。受试动物可能出现的副作用至少要连续观察14d。任何可察性反应都应记录和报告，包括流行性和严重性。为证明药物的有效性，每种疾病至少要进行两种规范的
42、对照研究。,口服给药的渔用药物的有效性和安全性评价应依据如下步骤：1）在离体条件下，证明药物的抑制或杀灭病原菌的有效浓度，包括时间与剂量关系。,2）用实验感染鱼建立控制病原菌的有效剂量，测定时间剂量关系。应采用剂量梯度试验测定对典型传染病的效果，包括1个不加药的对照组和3个非零的治疗剂量组。3个剂量中，有1个是所估计的最佳剂量。其他试验组在特定试验中还用以对比评价受试鱼的增重率和饲料报酬。,3）在生产条件下证明药物至少对3种流行病的效果。希望在多个地点进行试验，但是这并非是强制性要求。也须设立不感染不加药的对照组。,4）毒性研究应采用外表正常的动物进行，应能证明药品在受试动物的合适安全范围。安
43、全性研究也包括1个非加药的对照组和3个非零的药物剂量组。3个剂量应是1个推荐剂量，1个估计的毒性剂量和1个中等剂量，或者使用0X、1X、3、5的方案。给药时期应是最大推荐使用的期限的3倍。所有试验须用已经上市的配合饲料进行。对于拟用于亲鱼的药物，还要求有繁殖方面的试验资料。,5）安全性评价的参数。所有的中毒反应应是有特征性的，还应监测死亡率、发病率、增重率、血液学和血液化学。每个治疗组的动物均应进行尸体剖检。6）试验前应确定统计分析的方法。若资料收集后发现所期望的差异很明显，可不必进行统计分析。,对于通过浸浴给药的药物，就是将药物加到养鱼的水中，或将鱼放入含药的溶液中进行浸浴处理，使鱼与药物接
44、触一段时间或长期接触。要用标准的鱼种进行试验。受试鱼发育阶段的确定取决于药物的用途。所有药物要在至少两个不同水质条件下进行试验。水质对药物的有效性和(或)动物的安全不应产生影响(如温度、pH、总硬度、总硬度或有机质负荷)。所选定的试验条件取决于药物在水中的理化特征。对受试动物应该就副作用等至少观测14 d。任何可察性反应均应记录和报告，包括流行性和严重性。为证明药物的有效性，每种疾病至少要进行两个规范的对照试验。,对浸浴给药的药物的有效性和安全性评价步骤如下：1）用离体试验确定抑制或杀灭病原菌的有效浓度，包括时间和剂量关系。2）建立在特定时间控制实验室使鱼发病病原菌的有效浓度；例如15.0mg
45、或30.0 mg，1、4、8、12 h等。确定时间剂量关系。用剂量梯度研究法确定对规范的重症感染的效果，采用不加药的空白对照组和3个非零的治疗浓度。3个浓度中有1个应该是所估计的最佳药物浓度，2个浓度分别是较低和较高剂量组。在疾病治疗过程中，时间剂量关系至关重要。不感染不加药的对照组用以确定正常或健康鱼的“正常死亡率，在特定的试验或测定中，该对照组也可以对比评价受试鱼的增重率和饲料报酬。,3）要证明药物在生产条件下至少对2种暴发性流行病的有效性。可在多个地点进行试验，但是这并非是强制性要求。也必须设立不感染不给药的对照组。4）安全性试验应使用外表正常的鱼进行，以证明药品在拟用动物种属的安全范围
46、。安全性试验分组也包括：1个非加药的对照组和3个非零药物浓度组，3个浓度应是1个拟用浓度、1个估计的毒性浓度和1个中等浓度，或者用推荐应用浓度的倍数0、1、3x和5x的方案。给药期应是最大推荐使用期的3倍。所有研究均应使用已经上市的配合饲料进行。对于拟用于亲鱼的药物还需要药物对繁殖影响的资料。j：5）安全性评价的参数。所有的毒性反应是具有特点的。还应监测死亡率、发病率、增重率、血液学和血液化学指标。每个处理组的动物应进行尸体剖检。6）研究前应确定合适的统计分析方法。,中草药是我国的国粹。渔用中药的安全性和有效性评价尚无统一的要求。中药饲料添加剂，一般要做急性毒性试验。如因给药浓度或给药体积过大
47、，无法测出LD50者，可测定最大浓度下的最大容积。试验一般是在24h内灌服24次，在7d内观察动物的表现。,三、中草药的评价,对于文献记载有中等毒性的中药，除进行急性毒性试验外，还应做亚慢性毒性试验。如受试样品体积过大，难以选出中毒的最大剂量时，则应参考急性毒性试验。选择动物能承受的最大剂量或数倍于最大有效量的剂最(高于临界推荐剂量)为高剂量组进行分组试验。给药方式与临床一致；亚慢性毒性试验常用大鼠，给药和观察期为6090d。按西药的方法测定毒理学指标。,中药的临床试验也分实验临床试验和扩大区域临床试验两部分。对于保健促生长的中药，实验临床试验是在实验室条件下进行，目的是要确定有效剂量和安全性
48、。试验分不同剂量组，每组动物的数量应符合统计学要求。实验动物为靶动物，用药方式与推荐的临床应用药方式相同。应设空白对照组，有同类有效中药可用的，还应设阳性对照组。,扩大区域的试验是自然生产条件下的较大范围内考察药物的有效性的安全性。试验设一个对照组和两个剂量组。两个剂量组中，一组为推荐的临床有效量，另一组为高剂量组(剂量为推荐临床剂量的1倍或几倍)。临床试验的观察指标有发病率、存活率、增重率、饲料报酬率和动物产品质量等。,对于防治疾病的中药，实验临床试验应采用人工发病模型进行试验。感染前给药是观察预防作用，感染后给药以观察治疗作用。受试动物分为空白对照组、阳性对照组和23个受试药物组。试验前最
49、好进行体外抑菌试验。如果人工感染有困难，也可利用自然病例。但是自然病例的性质、发病的程度等必须诊断确实。扩大区域试验前，应做流行病学调查，选择合适的常发病的动物群体进行试验。无论预防还是治疗试验，均需设对照组(空白对照和有效对照)。对于试验结果应进行统计分析。,四、残留研究,畜、禽、水产动物是人类蛋白质食品肉、乳、蟹、鱼的来源，因而在畜、禽、水产动物饲养过程中所用的化学物质的安全性评价与人类食品中化学物质残留的安全性评价直接相关。同时，由于兽用药品只是在有限时间内使用，而大多数化学物质，不论是像黄曲霉等偶然污染物还是有目的使用的饲料添加剂，一般都是长期的、甚至是对食品动物终生使用。,因此，对于
50、任何一种饲料添加剂(或饲料污染物)进行安全性评价，需考虑以下几方面的问题。饲料中化学物质对食品动物、共生微生物以及食品消费者的毒性。畜、禽、水产品中作为持久性残留物的添加剂及其代谢物的化学性质和数量。畜、禽、水产品中残留物对人的潜在毒性，动物哪些组织或器官中的含量高。残留物在食品中的允许残留量。是否有适宜的监测方法。食品加工过程对饲料添加剂在食品中的残留及各种代谢的毒性是否有影响。,1.代谢研究和用于毒性测试残留物的选择 对靶动物使用的化合物，不一定在可食性产品中出现。动物体的酶系统或体液可能对此化合起作用，产生出新的物质（代谢物和降解物）。动物可食产品中的这些物质，是原型化合物吸收速度与程度
