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1、实验三 PCR产物回收酶切与连接实验三 PCR产物回收、酶切与连接 一、实验目的 1、 将成功扩增出所需基因片段的PCR产物纯化回收，除去DNA以外的杂质，如蛋白、RNA等，得到高质量的DNA用于后续实验。 2、 将纯化好的DNA和表达型载体分别酶切后连接，用于后续转化感受态细胞。 二、实验原理 选择克隆载体多克隆位点上相应的限制性内切酶，识别特定位点并切割DNA产生粘性末端或平端的外源片段，经DNA的纯化处理后在连接酶的作用下将外源片段连接到载体上，实现外源片段的克隆。 粘性末端连接，DNA片段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端，用同一种限制性内切酶消化DNA可产生相同的粘性末端。在连接酶的作
2、用下可恢复原样，有些限制性内切酶虽然识别不同顺序，却能产生相同末端。平头末端连接，用物理方法制备的DNA往往是平头末端，有些酶也可产生平头末端。平头DNA片段可在某些DNA连接酶作用下连接起来，但连接效率不如粘性末端高。 三、实验步骤 1、PCR产物回收 于PCR产物中加入其两倍体积的Binding Buffer，即80ul。然后转入2ml的收集管中，13000r，1min，离心，弃去收集管中滤液。 加Binding Buffer 300ul，13000r，1min，离心，弃去收集管中滤液，此时DNA挂于柱子上。 加Wash Solution 700ul，13000r，1min，离心，弃去收集
3、管中滤液。 重复步骤，此时已把DNA以外的杂质洗脱完毕。 将柱子装入1.5ml的EP管中，加50ul，60的水洗脱DNA，13000r，1min，离心。 2、将回收所得产物酶切 上游引物：Ncol 下游引物：Xhol 适应温度：37 Buffer4 50ul体系： Ncol：0.5ul Xhol：0.5ul 10xBuffer4：5ul DNA片段：44ul 放入37水浴锅酶切2.5小时。 所得酶切产物按上述纯化方法再次纯化回收。 3、将DNA片段与载体连接 (1)20ul体系： 10xBuffer：2ul T4连接酶：2ul 载体：2ul DNA片段：14ul 放入37温箱过夜。 回收所得连接产物。
