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1、定义：分子生物学与实验核医学结合。内涵：利用示踪技术观察体内的生化过程并与相关基因联系起来的一门分支学科，分子识别是其重要理论基础。研究领域：受体显像 基因显像 重组单抗片段、肽类放射性药物及微型抗体。,特点：1）深入分子水平认识疾病，通过细胞信息传导、基因表达、生化代谢等多个方面，在解剖学和功能症状出现之前发现病变信息。2）通过特定示踪剂，将疾病与基因表达的改变联系起来，提高疾病诊治的层次。3）当代分子生物学研究成果是其理论源泉。4）分子识别是分子核医学的理论基石。5）生化代谢的评价是其理论重要组成部分。,二、当前的几个热门研究领域（六个领域）1、受体显像：举例 a、b、c2、受体介导的放射
2、配体治疗3、放免显像（RI I）4、放免治疗（RIT）5、基因显像和基因放射治疗 原理：将放素标记的反义寡核苷酸注入受试者体内，由于体内癌基因等有过度表达，通过体内核酸分子杂交而与相应靶基因结合，以定位、定量显示特异靶基因，从而进行基因诊断以及破坏相应致病基因而达到治疗的目的。,反义寡核苷酸基因显像剂的特点：1）分子量小4）无免疫原性2）穿透力强5）与靶结合快3）特异性高 6）靶/非靶比值高反义寡核酸的基本要求：P303,基因显像必备条件：1）胞浆中必须有足够的mRNA基因产物标记反义探针必须与靶细胞特异选择性结合并保持稳定。,6、代谢显像：主要指PET显像原理：+衰变的放素与体内靶物质作用而
3、损失能量被吸收、转化为二个方向相反的高能r光子。它提供了很好的空间定位信息，经计算机处理重新购成清晰的三维图像。,+核素特点：大部分为人体基本元素，全部为人工生产湮灭辐射可获得三维图像T1/2短，一次可给较大剂量，图像清晰重复给药，动态观察。临床应用举例：18F-萄糖研究脑功能状况，老年痴呆时摄取18F-萄，测脑部放射性下降。脑瘤区18F-萄。,三、分子生物学中的示踪技术及应用P271（一）核酸标记：标记上放射性核素的又叫探针，或叫基因探针。1、探针分类：基因组DNA探针 CDNA探针 以mRNA为模板CRNA探针 反向合成的DNA片段 人工合成寡核探针的标记物分类 放素：32P 33P 35
4、S 3H 14C 125I等非放：生物素、地高辛等。,两类探针的比较：,六种常用的放素的性质、特点 P273 表111,2、核酸探针的具体标记方法：体内标记：将32P磷酸盐加到细胞或细菌培养体系中，使32P参入新合成的核酸分子上。酶促法体外标记：很常用，先将核素预先标记在核苷酸上，然后利用多种核酸聚合酶将核苷酸参入到探针分子中或交换到探针分子中去。常见的几种外标记方法：1）DNA缺口平移法：已有试剂盒提供如Amash ema,promega,BR2等公司。2）随机引物法：也有试剂盒上市。,两种方法注意点：模板越小，产物的比活度越高；产物的长度与加入寡核苷酸引物的量成正比；有5种原因常引起标记碍
5、障：a、DNA双链未充分变性；b、DNA纯度不佳；c、Klenow酶效价不够；d、DNA片段太少，G50分离时丢失；e、DNA用量过大或过少。,3）单链DNA探针标记：在M13噬菌体的环状单链上合成互补DNA链时参入放素。4）CDNA探针标记：以mRNA为模板，在引物和四种脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP，其中一种为标记物）存在下，经酶促聚合反应合成互补标记CDNA。5）RNA探针标记：P275 6）DNA探针的5端标记：P275 7）DNA探针的3端标记：P276 8）PCR-DNA标记：PCR扩增时通过合成DNA将32P-dNTP参入到DNA分子中达到标记作用。将32PdNTP参入到DNA分子
6、中达到标记作用。,3、核酸标记的检测核酸标记方法很多，虽已大部分商品化和标准化，但环节繁杂，试剂质量及操作等影响因素多，标记完成后应定性、定量检测。参入核酸中的cpm主要两个指标：参入比=-100%加入的标记品总cpm 比活性：指每微克核酸中的放射性计数cpm/gDNA(RNA),4、核酸标记注意事项：1）同位素的安全防护2）核酸原料一般用50-150ng，越少，产品比活度越高。3）标记前体32P-dNTP，用时须真空抽干4）使用的Ependoff管和吸头需先硅化、防止吸附。5）标记物应及时用，-20可保存13天6）严格按厂家说明书操作，最好做预实验。7）个别标记方法标记前需做DNA变性处理。
7、,（二）核酸分子杂交技术 定义：具有一定同源性的核酸单链在一定条件下按硷基互补原则形成异源双链的过程。杂交步骤：核酸探针与核酸样品（处理好的）混合反应漂洗ARG or测量分析。固相杂交：1）Southern印迹杂交：P277、查DNA序列，分析基因结构、并进行定性、定量研究。步骤：提取DNA酶解DNA琼脂糖电泳转移硝酸纤维膜上并固定杂交ARG 2）Nothern印迹杂交法：主要查RNA序列，步骤大致同上。,3）斑点杂交：将变性的DNAorRN点样在硝酸纤维膜上，然后杂交，ARG。4）反向斑点杂交：将多种未标记的已知序列寡核苷酸探针点样于纤维膜，再将待分析的DNA用放素标记后与其杂交，ARG根据
8、杂交点判断DNA序列。P278 5）菌落、噬菌斑原位杂交：将微生物点于纤维素膜或贴印方式转移微生物，曝露细胞DNA，硷化DNA变性，并固定，再进行斑点杂交过程。6）组织、细胞原位杂交：将组织切片或细胞固定在玻片上，用已知的标记核酸探针进行杂交。特点；不需以细胞中提取DNAorRNA，通过ARG在显微镜下观察银颗粒，进行定位、定性研究，定位准。敏感性高，对含量极低的靶序列也可检测。,注：如原位杂交采用非放探针，可染色显微观察。液相杂交：将变性的单链核酸与探针在溶液中自由杂交，适当方法分离获得杂交分子、测放了解其特定序列的信息。特点：1）受检的目标核酸与示踪的标记核酸均不在支持相上。2）主要用于基
9、因筛选和将基因组中重复的序列与单一序列分离出来。,（三）DNA序列分析 DNA序列分析的两个基本步骤 DNA片段的制备的扩增 测定 DNA序列 PCR测序分析：利用一对高特异性引物，可以直接从基因文库中原始克隆或从极复杂的基因组DNA中，通过不对称PCR反应制备特定基因片段为测序模板（单链DNA），然后用双脱氧法完成序列分析。双脱氧法 指当有双脱氧核糖核苷三磷酸ddNTP参入时，链的延长就终止，可以得到一系列长度不同的核酸片段，由于4种原料dNTP中有一种是标记的，所以可通过ARG，从图上读出被测DNA的硷基排列序列。常用方法：未端终止法 化学法 P280,（四）重组DNA和基因工程 重组DN
10、A基因克隆（基因工程）：指采用分子生物学技术在试管内有目的地切割分离纯化或人工合成的DNA分子和相应的载体，并将其拼接成重组DNA后导入合适的宿主细胞中，使之大量扩增形成克隆，并表达基因产物。基因工程的基本步骤：P282了解 与核医学相关技术基因诊断：核酸分子杂交技术中用的放素，主要包括遗传性疾病、癌基因与抗癌基因的研究。（五）聚合酶链反应PCR P284 了解（六）蛋白质合成中的核技术应用 P287了解,（七）半抗原标记及其应用：P215半抗原：定义不能诱导产抗体，但能反应。应用原理：将半抗原看作为放素去标记核酸或抗体，激素等分子（方法已趋成熟）。然后把能与半抗原结合的相应抗体用荧光素、酶或
11、胶体金标记上，然后作示踪研究，通过测荧光素或显色反应进行定位和定性研究。,举例：（1）地高率半抗原标记：将地高率通过一个“联结臂”结在duTP上，再用随机引物法或其它酶反应方法将DIGduTP掺入到核酸上，反应完后用碱性磷酸酶标记的抗DIG抗体去结合，而该酶可显色反应。*）而胶体金即为氯化金分子呈胶体态粉红色，具有高电子密度和能与大分子物质结合的特征，可在电镜，光镜下进行定性，定位研究。2）二硝基苯或三硝基苯（DNP或TNP）半抗原标记：它可标蛋白、激素、抗体等。示踪过程酶显色。,（八）免疫PCR技术：P216定义：PCR+Ag-Ab结合反应的新技术。原理：DNA作为标记物（看做放素），最后可用PCR将DNA扩增，通过测定DNA的量进行定性研究的一种方法。基本反应：1）将待测抗原固化试管底部2）加入生物素标记的特异抗体Ab-b3）加入亲和素A作为连接分子 Ag+Ab-b+AAgAb-b-A4）每加入生物素标记的DNA-b,得Ag+Ab-b-A+DNA-b AgAb-b-A-b-DNA 引物 PCR扩增 染色 记录PCR扩增的DNA量。特点（优点）：1）特异性强（与RIA相同）2）灵敏度高（比酶标高1000倍，也高于RIA）3）操作简单缺点：1）假阳性高2）影响实验的因素多 3）未商品化。,精品课件！,精品课件！,
