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1、甲基化原理及步骤二、DNA亚硫酸氢盐修饰和纯化操作步骤 修饰设计：使用CpGenomeTMkit使胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤如下。中等温度碱性pH下使DNA变性成为单链形式暴露出碱基。试剂一，一种包含亚硫酸氢根的钠盐，可使未甲基化的胞嘧啶磺化和水解脱氨，产生一种尿嘧啶磺酸盐中间产物。然后DNA在另一种盐试剂二存在的条件下与一种微粒载体试剂三结合，并通过重复离心和在70%的乙醇中重悬浮脱盐。向尿嘧啶的转化是通过在90%的乙醇中反复碱性脱磺酸基作用和脱盐完成的。DNA最终在TE缓冲液中通过加热从载体上洗脱下来。 第一步：试剂准备 3 M NaOH原料 把1g干NaOH片剂溶解在8.3mL水中。使用此
2、类腐蚀性碱，注意小心谨慎和实验操作。 20 mM NaOH/90% EtOH 配制1mL该溶液需：900l 100%的乙醇，93.4l水，6.6l 3M的氢氧化钠。 溶解试剂 打开前将试剂瓶加温至室温。对每份待修饰的样本，称取0.227g DNA修饰试剂加入0.571mL水中。充分涡旋振荡混合。使用该试剂时要小心谨慎，因为它对呼吸系统和皮肤有刺激性。用大约20l 3M NaOH调整pH至5.0，用pH试纸检测pH值。试剂避光保存以免分解。为了最佳效果，试剂应在配置后立即使用。 溶解试剂 打开前将试剂瓶加温至室温。将1l -巯基乙醇加入20mL去离子水中。每份待修饰的DNA样本需将750l该溶液
3、加入到1.35g DNA修饰。充分混合确保完全溶解。过量的试剂可用箔纸包裹的容器、2-8、避光保存长达6周。 第二步：DNA修饰程序 1、在带有螺旋形瓶盖的1.5-2.0mL的微量离心管中：将7.0l 3M NaOH加入到含有1.0 g DNA的100l水中，混匀。 注意：如果样本含有的DNA量不到1.0g，就向样本DNA中加入2 l DNA修饰试剂并加水至总体积100l。再加入7.0l 3M NaOH并混匀。 2、50 DNA孵育10分钟 3、加入550 l新鲜配制的DNA修饰试剂并涡旋振荡。 4、加热块或水浴50避光孵育4-16小时。 1 第三步：初步脱盐 1、 强力涡旋振荡悬浮DNA修饰
4、。用10x的1mL塑料移液管枪头来回吸排悬液以分散仍存在的凝块。 2、 向含DNA溶液的管中加入5l充分悬浮的DNA修饰试剂。 3、 加入750l DNA修饰试剂并充分混匀。 4、 室温孵育5-10分钟。 5、 5000 X g离心10秒使DNA试剂成颗粒状。弃去上清。 6、 加入1.0mL 70%的乙醇，涡旋振荡，5000 X g离心10秒，弃去上清。该步骤重复进行，共3次。 7、 将第三次上清弃去后，离心管高速离心2分钟，用塑料移液管枪头移去剩余上清。 第四步：完成DNA修饰，再次脱盐，并洗脱。 1、 适量样本加入50l 20 mM NaOH/90% EtOH溶液。 2、 充分涡旋振荡悬浮
5、颗粒，再室温孵育5分钟。 3、 5000 X g离心以移除管顶所有成分。加入1.0mL 90%的乙醇并涡旋振荡洗脱颗粒。再旋转，除去上清。再次重复该步骤。 4、 第二次洗脱除去上清后，高速离心样本3分钟。 5、 用塑料移液管头除去所有剩余上清。试管室温晾干10-20分钟。 6、 加入TE缓冲液。注意：加入TE的量取决于起始DNA的量和目的用途所需的加入浓度。例如，如果加入25l TE，基于完全恢复1g DNA的最终浓度应为40ng/l。快速强力涡旋振荡直到颗粒完全悬浮。用手轻打或轻敲内容物至管顶。 7、 50-60下样本孵育15分钟以洗脱DNA。 8、 高速离心2-3分钟并用塑料移液管头转移样
6、本到新管。 9、 进行MSP或测序，或-15-25可保存达2个月，-80可保存6个月。避免重复融化和解冻；可分量储存。不要将DNA存储在自动除霜冰箱。 10、 当从一管中转移已解冻的DNA以备用时，避免将试剂转移到PCR反应管中。通常首先将管充分离心，使残留的试剂固体成颗粒状。 三、MSP 引物合成 运用特别设计的针对甲基化和非甲基化序列的引物，引物由上海生物工程有限公2 司合成。见表1 表1 甲基化引物序列及扩增条件 hMLH1引物 甲基化(M) 正义 甲基化(M) 反义 非甲基化(U) 正义 非甲基化(U) 反义 PCR反应条件 a 反应体系：10PCR缓冲液5l，2.5mmol/LdNT
7、P4l，甲基化上下游引物和去甲基化上下游引物分别为1l，甲基化模板DNA5l，Taq酶0.25l，加水至总体积50l。 b 循环条件： 程序 预变性 变性 退火 终末延伸 共35个循环 PCR产物结果判定：琼脂糖凝胶电泳 a 甲基化阳性：甲基化特异性引物扩增出相应长度的片断，但非甲基化特异性引物未扩增出相应长度的片断，则判断基因启动子区5CpG岛甲基化阳性。 b 甲基化阴性：非甲基化特异性引物扩增出相应长度的片断，但甲基化特异性引物未扩增出相应长度的片断。则判断基因启动子区5CpG岛甲基化阴性。 引物序列(53) ACGTAGACGTTTTATTAGGGTCGC CCTCATCGTAACTACCCGCG ACCACCTCATCATAACTACCCACA 产物长度 115 bp 115 bp 124 bp 温度 55 55 55 55 TTTTGATGTAGATGTTTTATTAGGGTTGT 124 bp 温度 95 95 55 72 时间 60 sec 30 sec 30 sec 60 sec 3
