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1、基因组编辑,应用基因编辑技术不长角的奶牛,基因编辑的定义：通过精确识别靶细胞DNA片段中靶点的核苷酸序列，利用核酸内切酶对DNA靶点序列进行切割，从而完成对靶细胞DNA目的基因片段的精确编辑。,基因编辑的优势,与传统的以同源重组和胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)技术为基础的基因打靶技术相比，基因编辑新技术保留了可定点修饰的特点，可应用到更多的物种上，效率更高，构建时间更短，成本更低。,基因编辑原理,现代基因组编辑技术的基本原理是相同的，即借助特异性 DNA 双链断裂(DNA double-strand breaks DSBs)激活细胞天然的修复机制，包括非同源末端连接
2、(NHEJ)和同源重组修复(HDR)两条途径。,第一代:ZFN(锌指核酸酶)第二代:TALEN(转录激活样效应因子核酸酶)第三代:CRISPR/Cas9(成簇的规律性间隔的短回文重复序列)第四代：NgAgo-gDNA 韩春雨,基因编辑发展史,ZFN 基因组编辑技术,ZFN 技术是第一代基因组编辑技术，其功能的实现是基于具有独特的DNA序列识别的锌指蛋白发展起来的。1986年Diakun 等首先在真核生物转录因子家族的 DNA 结合区域发现了Cys2-His2锌指模块。1996年，Kim等首次人工连接了锌指蛋白与核酸内切酶。2005年，Urnov等发现一对由4个锌指连接而成的ZFN可识别24 b
3、p的特异性序列，由此揭开了ZFN在基因组编辑中的应用。,ZFN=DNA识别域+核酸内切酶DNA识别域：由一系列 Cys2-His2锌指蛋白（zinc-fingers）串联组成（一般34个），每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。核酸内切酶：非特异性核酸内切酶FokI，形成二聚体时切割双链DNA。,ZFN原理和机制,ZFN 由锌指蛋白(ZFP)和 Fok核酸内切酶组成。其中，由 ZFP 构成的 DNA 识别域能识别特异位点并与之结合，而由Fok构成的切割域能执行剪切功能，两者结合可使靶位点的双链DNA 断裂(DSB)。于是，细胞可以通过同源重组(HR)修复机制和非同源末端连接(NHEJ)修
4、复机制来修复 DNA。HR 修复有可能会对靶标位点进行恢复修饰或者插入修饰，而 NHEJ 修复极易发生插入突变或缺失突变。两者都可造成移码突变，因此达到基因敲除的目的。,ZFN 诱导的基因组编辑技术可应用于很多物种及基 因位点，具有较好的发展潜力。缺点:(1)以现有的策略设计高亲和性的 ZFN，需要投入大量的工作和时间;(2)在细胞中持续表达 ZFN 对细胞有毒性;(3)虽然三联体设计具有一定特异性，但仍然存在不同程度的脱靶效应。,TALEN 基因组编辑技术,2009 年，研究者在植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas)中发现一种转录激活样效应因子(TAL蛋白),它的核酸结合域的氨基酸序列
5、与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系,一个模块单元识别一个碱基，简单且特异性极好。随后，TALE特异识别 DNA 序列的特性被用来取代 ZFN技术中的锌指蛋白。它可设计性更强，不受上下游序列影响，具备比ZFN 更广阔的应用潜力。,TALENs 包含两个 TALEN 蛋白,每个 TALEN 都是由 TALE array 与 Fok融合而成.其中一个 TALEN 靶向正义链上靶标位点,另一个则靶向反义链上的靶标位点.然后 Fok形成二聚体,在靶向序列中间的 spacer 处切割 DNA,造成双链 DNA 断裂,随后细胞启动 DNA 损伤修复机制.针对不同的TALEN 骨架,其最适宜的spacer长
6、度不同,其长度范围一般为1220 bp.,实验结果表明,TALENs在靶向DNA时,第一个碱基为 T 时其结合效果更佳。通过组合各类模块，可对任意核苷酸序列进行靶向特异性敲除或内源基因的表达调控。目前已在人、大鼠、小鼠、猪、羊、斑马鱼、拟南芥及酵母等多类物种中得到成功应用。,CRISPR/Cas9 基因组编辑技术 CRISPR/Cas9系统的发现可以追溯到1987年，日本学者首次在大肠杆菌(E.coli)基因组中发现一连串短的空间间隔重复序列。随后，在其他细菌和古细菌中也发现了这一特殊的序列。2002年科学家才将其命名为成簇的规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly in
7、terspaced short palindromic repeats,CRISPR)，现有测序结果显示40%的细菌基因组中含有CRISPR位点。2005年，科学家们发现CRISPR中的许多间隔序列来源于质粒和病毒，CRISPR的基因座能够被转录，并且Cas基因编码的蛋白具有核酸酶和解旋酶结构域，因此推测CRISPR/Cas 是利用无义的RNAs标记外源核酸序列的防御系统。,2011年，才揭示了CRISPR/Cas系统的分子机制：当病毒首次入侵时，细菌会将外源基因的一段序列整合到自身的CRISPR的间隔区；病毒二次入侵时，CRISPR转录生成crRNA前体(pre-crRNA)，pre-crR
8、NA经过加工形成含有与外源基因匹配序列的 crRNA，该crRNA与病毒基因组的同源序列识别后，介导Cas蛋白结合并切割，从而保护自身免受入侵。2013年，研究者报道了CRISPR/Cas9系统可高效地编辑基因组。其中分别在人类细胞和小鼠细胞中成功对部分基因实现了编辑。,CRISPR/Cas系统概述 CRISPR/Cas系统广泛存在于细菌和古菌中，是它们的一种适应性免疫系统，能够识别自身和外源入侵DNA片段。CRISPR/Cas系统有3种类型：型、型和型。型和型CRISPR/Cas系统较为复杂，需要多个Cas蛋白形成复合体切割DNA双链，而型CRISPR/Cas系统只需要一个Cas9蛋白核酸酶
9、来切割DNA双链,即为现在广泛应用于遗传学基因编辑的CRISPR/Cas9系统。Type系统中只有一种核酸酶Cas9核酸酶，在该系统中Cas9蛋白与crRNA参与对抗外源噬菌体和质粒的入侵。目前，Type系统在基因组编辑中应用的最为广泛。,CRISPR-Cas主要由两部分组成：,CRISPR/Cas的结构CRISPR 是一个特殊的DNA重复序列家族,广泛分布于细菌和古细菌基因组中。CRISPR 位点通常由短的高度保守的重复序列(repeats)组成,重复序列的长度通常 2148 bp,重复序列之间被 2672 bp 间隔序列(spacer)隔开。CRISPR就是通过这些间隔序列（space）与
10、靶基因进行识别。,Cas（CRISPR associated）：存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在guide RNA引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。,CRISPR/Cas9系统由间隔重复CRISPR基因座转录出来的pre-crRNA、多功能的Cas9核酸酶和tracrRNA组成，其中tracrRNA促进pre-crRNA的成熟，以及形成具有切割活性的crRNA-tracrRNA-Cas9三元复合体。病毒或质粒入侵细菌后，其基因组DNA暴露于细菌胞浆之中，经过同源重组，CRISPR重复序列转录、翻译出的Cas复合物对外来
11、DNA进行剪切，产生新的spacer序列。如果产生的新spacer序列能够与CRISPR array内部的短重复序列部分互补，将会通过某种未知的方式整合到细菌基因组的CRISPR array 序列中，从而对该病毒或质粒产生特异性免疫记忆。,CRISPR/Cas9系统的工作原理和机制,CRISPR/Cas9系统的工作原理和机制,当同类的病毒或者质粒再次入侵该细菌时 首先，tracrRNA与pre-crRNA的重复序列结合；第二，内源RNase 切割pre-crRNA/tracrRNAs复合体，切除5末端的间隔序列，形成成熟的crRNA，并与tracrRNA形成被称为向导RNA(Single gu
12、ide RNA,sgRNA)的嵌合RNA分子；第三，每一个成熟的sgRNA能够引导Cas9蛋白定位到双链DNA的靶位点上并在原型间隔毗邻序列(Proto-spacer adjacent motif,PAM)的上游38 bp位置对结合的序列进行切割(图2A)。,Cas9的特异性靶点 依赖于原型间隔序列3端PAM序列，不同的Cas9突变体在基因组中拥有不同的PAM序列，来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9识别一个5-NGG-3的PAM，而来源于嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningi
13、-tidis)的Cas9分别识别5-NNAGAAW-3的PAM和5-NNNNGATT-3的PAM。Cas9拥有两个核酸酶结构域 分别是蛋白中间的HNH结构域和蛋白氨基酸末端附近的RuvC-like结构域，其中HNH切割与crRNA互补的链，切割位点位于PAM序列上游3 bp，RuvC-like切割非互补链，切割位点位于PAM序列上游38 bp，从而造成双链的断裂。,Cas9的特异性靶点和两个核酸酶结构域,CRISPR/Cas9产生的DSB能够激活细胞和生物体自身修复机制，产生两种不同的修复途径NHEJ和HDR修复。NHEJ能够高效地引入不同长度的插入或者缺失突变，导致转录阅读框编码序列，转录激
14、活相关的启动子和增强子的损坏；而HDR的修复通常会引入特定位点的突变或者在外源供体DNA模板存在时对靶位点进行可预测的插入。,1.PAM序列区是CRISPR/Cas9系统行使切割功能的基本条件。如果靶序列3端没有PAM序列，即使靶序列与sgRNA序列完全匹配，Cas9蛋白也不会切割该序列位点.,2.sgRNA与目标基因组相结合的20nt序列区决定着CRISPR/Cas系统的靶向特异性。,CRISPR/Cas9系统的关键点,3.sgRNA的长度也与特异性密切相关。sgRNA的5端额外增加两个鸟嘌呤核苷酸后能够显著提高CRISPR/Cas9系统的特异性。,CRISPR/Cas9基因编辑系统的特异性
15、决定于sgRNA上的识别(20nt)。然而，在复杂的生物基因组中，sgRNA的识别序列可能会与非靶点DNA发生局部匹配(Partial match)。这种局部匹配，目前可归结为两类：sgRNA与脱靶位点DNA序列长度相同，但存在碱基错配。(2)脱靶位点DNA序列长度比sgRNA多或少几个碱基，通过形成DNA凸起(DNA bulge)或RNA凸起(RNA bulge)来完成其他碱基的正确配对。,CRISPR/Cas9系统的脱靶效应,CRISPR/Cas9系统在基因组DNA片段编辑中的应用,1.DNA片段靶向删除2.DNA片段靶向反转3.DNA片段靶向重复4.DNA片段靶向插入5.染色体靶向易位,
16、编辑技术对比,NgAgo-gDNA编辑,NgAgo-gDNA是格式嗜盐杆菌（Natronobactricum grogoryi)ACO蛋白（Argonauto）的简称，其本质是一种核酸内切酶，NgAgo根据指导DNA的定位，可以有效地对基因组目标区域进行编辑。,NgAgo-gDNA 概述,NgAgo,是格氏嗜盐碱,杆,菌,（,Natronobacterium,gregoryi,）,AGO,蛋,白,（,Argonaute,）,的,简,称,，,其,本,质,是,一,种,核,酸,内,切,酶,。,NgAgo,酶根据指导,DNA,的定位,，,可以有效地对基因,组目标区域进行编辑,。,NgAgo-gDNA
17、与 Crispr-Cas9 特点比较,NgAgo-gDNA 的优势,1.设计更加灵活 由于NgAgo-gDNA系统无PAM要求，5p ssDNA设计相较sgRNA更加灵活2.理论上精确性会比Crispr-CAS9 高 NgAgo-gDNA识别靶序列的长度会比Crispr-Cas9长约4个碱基，另外DNA-DNA duplex的特异性比RNA-DNA duplex高,所以理论上精确性会更加高。3.对向导序列-靶序列错配容忍度低 脱靶率低5.针对富含GC的靶序列，NgAgo系统比Cas9系统切割效率更高,基因功能研究基因治疗构建模式动物改造和培育新品种,基因编辑新技术的用途,1.基因功能研究,基因
18、敲除是在活体动物上验证基因功能必不可少的逻辑环节，但是传统的基因敲除方法需要通过复杂的打靶载体构建、ES 细胞筛选、嵌合体动物模型选育等一系列步骤，成功率受到多方面因素的限制。,基因编辑新技术则不然，敲除基因高效快速，是研究基因功能的有力工具,ZFN 技术已在大鼠、小鼠、斑马鱼、果蝇、拟南芥、玉米、烟草 等模式生物或经济物种的细胞或胚胎中以及包括诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)在内的人体外培养细胞系中成功地实现了内源基因的定点突变，其中在果蝇、斑马鱼、大鼠等物种中还获得了可以稳定遗传的突变体。,2.基因治疗,传统的基因治疗是将正常的基因片
19、段引入细胞中替代有缺陷的基因，但这种方法难以精准控制，可能产生很大的毒副作用。基因编辑新技术可以精确定位，在靶位点进行修正或进行基因切除，达到基因治疗的目的。,Bacman 等人利用 TALEN 技术清除了来自于病人线粒体内的有病 DNA。这是 TALEN 首次应用于线粒体基因的编辑，这项研究有望用于治疗母系遗传的线粒体病。,Li 等人利用 ZFN 技术能在染色体上精确定位的优势，通过“剪切”和“粘贴”基因，在实验小鼠体内实现了血友病治疗，避免了传统基因疗法带来的插入诱变风险，首次取得了基因组编辑在基因疗法上的突破。,3.构建模式动物,基因编辑新技术不受 ES 细胞的限制，效率高，速度快，且定
20、点编辑更加精确，可在多种细胞及生物体的特定位点进行切割和修饰。构建转基因小鼠第一人 Jaenisch 与其同事最近利用 CRISPR-Cas 系统又构建了携带特异性突变的小鼠模型。,4.改造和培育新品种,传统的改造动植物品种的转基因技术是将外源 DNA 片段插入受体的基因组中，改造基因功能，使其表达优良的性状，获得人类需要的品种。基因编辑技术则可以进行定点修饰，达到高效定向。,Shukla 等对玉米进行肌醇磷酸激酶 1(inositol phosphate kinase 1，IPK1)基因的修饰，使其对除草剂的耐性增强，在发育的种子中肌醇磷酸盐表达谱也发生了与预期一样的改变。ownsend等以烟草中的丙酮醇合酶(acetolactate synthase)基因 SuR(SuRA和SuRB)位点为靶标，育成了对咪唑啉酮(imidazolinone)除草剂和对磺脲(sulphonylurea)除草剂都有抵抗力的新品种。,
