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1、4.3 亲和色谱(层析)Affinity Chromatography,AC,第一节 概述原理 利用生物体中许多高分子化合物具有和某些相对应的分子可逆结合的特性建立的色谱法。一、特点 高效、高收率、有浓缩效应，使用局限性,二、应用高效从复杂混合物中得某一种物质；基于生物功能可把有活性与无活性分开三、基本过程 须找配基（它与底物专一可逆结合如下图）,亲和层析过程演示,亲和吸附剂的构成 载体（基质）、配体、连接臂,说明：1.偶联用Gel（须是活化偶联介质）2.亲和吸附剂 高度专一亲和吸附剂 类专一亲和吸附剂3.按相互作用力划分：次级键亲和色谱配位键螯合色谱共价键共价色谱疏水键疏水色谱,亲和层析的必
2、要条件:合适的配体（配基、ligand)合适的载体（Matrix)合适的吸附和洗脱条件,第二节 亲和色谱配基(ligand L)作为配体的条件 亲和力大;具有解离平衡;与载体偶联不失活常用系统酶:底物或类似物、辅助因子、可逆抑制剂、效应物核酸:互补顺序、组蛋白、结合蛋白、核酸多聚物激素:受体、运载蛋白抗体:抗原、病毒、细胞外源凝集素:多糖、糖蛋白、细胞,亲和层析常用配体,配体的浓度 一般使用较高的固定化配体浓度 配体亲和力高，且本身带电则浓度须降低 配体浓度过高引起色谱畸变。(与很多物质发生非特异性结合),配体的选择 1.考虑亲和势L+S LSKl=LS/LS要求Kl在10-410-8mol/
3、L之间 2.与L的偶联不破坏L与S的结合 3.需了解L-S的作用机制 如,例：酶 有单底物反应、双底物反应单 A P E E EA EP 底物A、产物P或它们的类似物都可以,双底物依次 A B P Q E E EA EAB EPQ EQ 须选择A、若选B则吸附时须加A,双底物随机 A（B）B（A）P（Q）Q（P）E E EA EA（B）EPQ A、B都可选择 对A、B的选择仅取决于它们亲和势的大小和固定化的难易程度。,第三节 亲和层析载体,一、作为载体的条件 1.亲水 2.惰性 3.具有活化基团 4.大网孔 5.机械性能好,二、载体的选择,1.琼脂糖凝胶：亲水性强，理化性质稳定（商品名：Sep
4、harose）2.聚丙烯酰胺凝胶：理化性质稳定，耐有机溶剂及去污剂，抗微生物能力强，特别适应用配基与提取物亲和力比较弱的物质。3.葡聚糖凝胶：有良好的化学及物理性质，孔径小。4.纤维素：非特异吸附严重，廉价，易得。5.多孔玻璃：物理性能好，有非特异性吸附。,三、手臂（Spacer arm）在载体和配基间引入适当长度的“手臂”，减少载体的空间阻碍，增加配基的活动度。示意图如下：,连接臂往往为由烃链组成的疏水性手臂（其长短对吸附的影响大）或具氨基、羧基的亲水性手臂（其长短对吸附的影响不大）；疏水性手臂具体选择应考虑：分离物质分子量大小 亲和势大小 过长手臂易弯曲、折叠等；最常用的连接臂有6-氨基己
5、酸、1,6-己二胺和3,3-二氨基二丙胺。,接有连接臂的亲和层析用载体,第四节亲和吸附剂的制备 一、要求.L与基质结合，对L-S结合无干扰；.L为小分子有的需“手臂”，使L-S结 合更有效；.非专一吸附不大，以免吸附杂质；L与基质结合稳定（吸附、洗脱、再生）。,二、偶联用Gel的选择 需考虑：.L上可供偶联的基团.“手臂”.L的稳定pH三、由CNBr活化型Sep.4B制备 商品名：CNBr-Sepharose,一般步骤：,冻干粉 溶胀洗涤 混合反应 掩蔽 溶解L 洗去L（未结合）成品,.溶胀和洗涤 用1mol/L HCl 溶胀洗涤除细碎粒子.偶联条件注意：前处理、偶联密度、缓冲液种类及pH.掩
6、蔽 偶联后有部分氰酸酯未偶联上L，常利用含-NH2的缓冲液或含-NH2的分子处理，将其掩蔽。.洗去未结合L用高-低交叉pH来洗（45次）,亲和吸附剂的制备过程,封闭未反应的活化基团,载体上活化基团浓度 525mol/ml 偶联上的配体浓度 110mol/ml 封闭试剂 pH8.0，1mol/L乙醇胺 甘氨酸 巯基乙醇 室温反应1h,配体浓度评估,差示分析法 直接测定法 放射分析法 水解法 连接臂的连接 连接臂先接配体后偶联至载体 连接臂先偶联至载体后接配体,四、由氨基-Sep或羧基-Sep制备Sep-(CH2)6-NH2 L-COOH AH-SepSep-(CH2)6-COOH L-NH2 C
7、H-Sep碳二亚胺法（配基偶联的一种方法）：,琼脂糖等多糖类载体,溴化氰法 最常使用，简单温和，活化效率高，速度快；反应可逆，剧毒，可能带上电荷,双环氧法(p140-145),产生亲水连接臂，不带电荷，稳定，偶联配体数量少于溴化氰法,二乙烯砜法反应性能强，适合于偶联羟基配体；剧毒，昂贵,N,N-二琥珀酰亚胺碳酸酯法 稳定，不带电荷,有机磺酰氯法 对甲苯磺酰氯、三氟代乙磺酰氯 可释放生色基团，可用于监测偶联反应,碳化二亚胺交联法,其他方法,羰基二咪唑（CDI）法高碘酸盐法磺化氟甲基吡啶鎓法N-羟基琥珀酰亚胺法,其他亲和吸附剂,聚丙烯酰胺载体的亲和吸附剂可用戊二醛法和肼解法活化,然后再将含氨基的配
8、体固定到其活化基团上;硅胶和多孔玻璃载体的亲和吸附剂最常用的修饰方法就是进行硅烷化处理,从而给载体引入氨基或环氧基团.,戊二醛法 OHC(CH2)3CHO 与载体酰胺基团结合，并与配体氨基结合 简单、便宜、稳定，引入连接臂，有中等毒性肼解法-CONH2 CONHNH2 CON3 CONH-L,NH2NH2,NaNO2,L-NH2,类专一性亲和吸附剂.固定化凝集素（本质是蛋白质）可用来分离糖、糖蛋白 如.固定化多聚核苷酸可用来分离NA、核蛋白 如.染料亲和吸附剂以染料为配基，用来分离酶类、干扰素等,第五节一般实验方法是否有类专一吸附剂 有 溶胀Gel 无 选L 选偶联Gel 偶联L 装柱,安装仪
9、器 平衡（23Vt）加样吸附 洗去非吸附物亲和柱 洗脱液 再生 脱盐,一、亲和吸附柱的预备.亲和吸附剂选择或制备 效能小试：据资料等先选择始缓冲液种类、I、pH、t.用10Vt始缓洗，若目的物未流出，说明吸附性能好，0.9.不断加样到目的物流出，确定吸附容量.柱 H/D 高度专一 短 类专一 长 平衡 一般23Vt始缓,二、加样吸附.样品平衡（透析或SephadexG-25）.样品体积Vs（一般5%）若结合紧密，Vs可较大；不紧，Vs要小.洗去非吸附物（10Vt始缓洗）三、洗脱（以S不变性为前提）类专一：选择性洗脱、有分级分离要求、梯度或阶式洗脱。,样品准备,加样前样品应当澄清，不含颗粒状物质
10、，有适当的pH值、离子强度以利于目标分子的结合离心（10000rpm）或过滤（0.45或0.22m滤膜）除去不溶物对复杂样品如组织细胞、植物材料、发酵产物，应预处理，如超声破碎、溶解、均质、抽提、过滤、离心等盐析、离子交换层析透析或凝胶过滤完成脱盐、缓冲液交换,加样吸附,目标分子与配体形成复合物而吸附在层析柱上起始缓冲液的选择：配体-目标分子作用类型 疏水键，提高离子强度，不要采用低温操作；离子键，降低离子强度流速：低压亲和层析，流速50cm/h；高效液相亲和层析，流速50125cm/h。若结合力弱，应降低流速加样量：不超过亲和吸附剂的吸附容量,洗去杂蛋白,5倍床体积的起始缓冲液洗去未吸附物质
11、，直至紫外纪录曲线回到基线亲和柱上存在较多的非特异性吸附，而目标分子结合牢固，可选用介于起始缓冲液和洗脱缓冲液之间的条件洗杂蛋白例：起始缓冲液 0.05mol/L磷酸缓冲液 洗脱缓冲液 含1mol/L NaCl的磷酸缓冲液可用含0.5 1mol/L NaCl的磷酸缓冲液洗去杂蛋白,洗脱,专一性洗脱和非专一性洗脱,非专一性洗脱,改变缓冲液的离子强度 配体与目标分子间如果是 离子作用：升高离子强度 疏水作用：降低离子强度 离子强度变化方式：阶段式、梯度式改变缓冲液的pH值 改变表面带电基团的电性和电量，从而破坏离子键 阶段式为主,改变缓冲液的极性 配体和目标分子依靠较强的疏水作用结合时，可以往洗脱
12、液中添加一定比例的有机溶剂使用洗涤剂 极端疏水性蛋白质，如：膜蛋白 最好使用在280nm附近无吸收的非离子型洗涤剂，如NP-40,Lubrol,使用促溶盐（chaotropic salt）促溶盐能破坏水的结构，降低配体-蛋白质间疏水作用的强度 亲和层析洗脱时常用的促溶剂有13mol/L硫氰化钾、13mol/L碘化钾、4mol/L MgCl2使用蛋白质变性剂 8mol/L尿素，6mol/L盐酸胍,Step elution Gradient elution,专一洗脱(亲和洗脱)使用配体，如：用不同的核苷酸将脱氨酶从染料柱上洗脱 使用能与配体结合的分子，如：用游离糖将糖蛋白从凝集素柱上洗脱 优点：洗
13、脱条件温和，目标分子不会变性 缺点：价格昂贵，配体与目标分子结合后需要进一步分离,Competing binding substance in solutionElution of glycoproteins from Con A Sepharose by a-D-methylmannoside,Specific eluents,Competing ligand in solutionElution of enzymes from Blue Sepharose by free NADH,洗脱方式总结:.pH变化（破坏静电引力）.I变化（减弱静电引力、范德华力）.亲和洗脱 L的类似物L，S的类似
14、物S*采用酶促反应的多元专一性洗脱.表面活性剂 减少疏水作用、范德华力 种类常有：曲通X100 1%（V/V）、乙二醇等,.解离试剂主要破坏氢键，如尿素、盐酸胍等.降低温度t较高t吸附、较低t洗脱、减少疏水力.电泳解吸+在柱两端连上电极进行电泳 四、脱盐-五、再生,再生和保存,再生的目的是除去所有仍然结合在柱上的物质 几个床体积的起始缓冲液再平衡 采用高浓度盐溶液，如2mol/L KCl 根据配体的稳定性升高和降低pH值、加入洗涤剂、使用尿素等变性剂或加入适当的非专一性蛋白酶 保存时应加抑菌剂，如0.02%W/V叠氮钠,第六节其它亲和色谱简介 一、共价色谱 利用形成和破坏共价键能力的差异分离其
15、共价键常为二硫键S-S 主要用于分离分子中含巯基的Pr、多肽 基本层析过程,二、金属螯合色谱 原理 His Cys Trp能与某些金属离子形成复合物，若将金属离子固定，可将含这些外露AA的Pr吸附。固定方法：将环氧活化型Sepharose6B与金属螯合剂偶联成配基，再用金属离子处理。如 洗脱：采用增加I或降低pH或加入EDTA,原理,原理蛋白质分子表面的组氨酸咪唑基、半胱氨酸巯基和色氨酸吲哚环能与铜、锌、镍离子间形成稳定的螯合物,金属螯合亲和层析材料,载体 Sepharose 4B或6B，亲水树脂配体 亚氨基二乙酸（IDA）：3个配位基团 三（羧甲基）乙二胺（TED）：5个配位基团金属离子 C
16、u2+Ni2+Zn2+Co2+Ca2+,Mg2+,金属螯合亲和层析实例,纯化带六聚组氨酸（6xHis）末端的基因重组酶NAD激酶样品准备 重组NAD激酶表达菌离心，分散于起始缓冲液，超声破碎细胞，离心提取上清得粗酶液 层析材料 Ni-chelating，以亚氨基二乙酸作为配体的环氧乙烷活化琼脂糖凝胶，螯合离子为镍离子,装柱 10Vt 50mmol/L EDTA-0.5mol/L NaCl除去杂质，5Vt蒸馏水清洗，0.6Vt 0.1mol/L NiSO4固定金属离子 起始缓冲液 20mmol/L KPB,pH7.5、0.1mmol/L NAD、0.5mmol/L二硫苏糖醇、0.5mol/L N
17、aCl、10mmol/L咪唑 加样、吸附、洗去杂质洗脱液 10mmol/L0.5mol/L咪唑梯度缓冲液解吸 清洗和再生 强螯合剂0.05mol/L EDTA,0.5mol/L NaCl再生亲和柱，5Vt蒸馏水洗涤，储存于20%乙醇,四、有机染料亲和色谱 有机染料如蒽酮化合物和偶氮化合物具类似于NAD+的结构。一些需核苷酸类物质为辅酶的酶，对这些染料具一定亲和力。,Dye-stuffs,Cibacron Blue 3G-A mimics NADH,染料配体亲和层析,以仿生染料，主要是三嗪染料作为配体的亲和层析 常用的染料有Cibacron blue F3GA（多芳香环的磺化物）和Procion
18、 Red HE3B，多以Sepharose作为载体，前者称蓝色Sepharose，后者称红色Sepharose具有一定的阳离子交换作用，应适当提高缓冲液离子强度来减少非特异性吸附作用,原理,蓝色染料Cibacron blue F3GA在结构上与NAD+和NADP+很相似，用于纯化NAD+、NADP+依赖性酶，如各种激酶、磷酸酶、脱氢酶、DNA聚合酶、限制性核酸内切酶等红色染料Procion Red HE3B用于纯化NADP+依赖性酶，如某些脱氢酶，以及其他非相关蛋白质，如干扰素、抑制蛋白、羧肽酶G、血纤蛋白溶酶原等，结合不仅依赖于特定基团，还依赖于离子键或疏水相互作用,材料,制备：偶联到6%交
19、联琼脂糖（Sepharose CL-6B）商品化染料亲和吸附剂,Red Sepharose CL-6B,染料配体亲和层析实例,从Candida utilis中分离NADP+依赖型酶 吸附缓冲液：中性pH缓冲液 洗脱缓冲液：专一性洗脱：含NAD+或NADP+的缓冲液 非专一性洗脱：增加离子强度至2M NaCl 或1M KCl,A：非吸附蛋白，B：6-磷酸葡萄糖脱氢酶，C：谷氨酸脱氢酶，D：谷胱甘肽还原酶，E：6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶,五 凝集素亲和层析凝集素是一类来自于霉菌、植物和动物的蛋白质，能可逆地、选择性地同特定的糖残基结合不同的凝集素结合不同的糖分子用于分离含糖基的化合物，如多糖、糖蛋白、
20、糖脂、细胞内颗粒、细胞等,凝集素亲和吸附剂的合成据待分离物质所带糖基选择适当的凝集素作为配体选择载体 一般选用商品化的活化载体，如CNBr-活化的Sepharose-4B，CDI-活化的Sepharose等偶联封闭活性位点,凝集素亲和层析实例,人细胞表面抗原的纯化 吸附剂：ConA Sepharose-4B ConA：伴刀豆球蛋白A，是从刀豆中分离出的四聚体金属蛋白，与-D-甘露糖，-D-葡萄糖结合 吸附缓冲液：20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，1mM MnCl2，1mM CaCl2，pH7.4 洗脱缓冲液：0.10.5M 甲基-D-葡萄糖或甲基-D-甘露糖,填充层析柱，用10V
21、t的吸附缓冲液清洗并平衡柱子以15cm/h的流速加样用5-10 Vt的吸附缓冲液洗去杂蛋白，直至洗脱液中不含任何杂质分子（用A280监测）用5 Vt的洗脱缓冲液进行洗脱,操作步骤,第七节 应用（p161-166),抗体和抗原的纯化 酶的纯化 糖蛋白和脂蛋白的纯化 其它蛋白质 细胞的纯化,分离酶蛋白,利用酶的底物、底物类似物、产物、辅助因子、激活剂、抑制剂等作为配体，采用亲和层析可以分离多种酶层析材料 大多制备 商品化吸附剂（NAD、GSH等作为配体）,分离胆固醇氧化酶（cholesterol oxidase）10g预活化Sephadex LH20浸入100mL饱和胆固醇乙醇溶液充分溶胀装入2.
22、610cm层析柱 35Vt pH7.5,5mM磷酸钾缓冲液平衡，使胆固醇完全结晶加入15mL待分离样品15Vt 缓冲液洗去杂质含不同浓度Triton X-100的缓冲液洗脱,不同表面活性剂浓度下胆固醇氧化酶的亲和层析分离图谱,分离谷胱甘肽转硫酶（Glutathion S-transferases，GSTs）GST是机体内一组具有解毒作用的同工酶家族，由两个亚基组成的二聚体亲和层析介质Sepharose 4B-GSH的制备 Sepharose 4B在碱性条件下，加入环氧氯丙烷和二氧六环活化，将GSH偶联到载体上样品的准备 4g兔肝剪碎，加入约10倍重量的Buffer A，用组织捣碎机匀浆，低速离
23、心10min，弃沉淀，上清再次离心（4C，100 000g，40min），弃沉淀，滤纸过滤上清液,结合缓冲液（Buffer A）：0.025mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.4，含3mM二硫苏糖醇（DTT），1mM EDTA，0.2M NaCl洗脱缓冲液（Buffer B）：0.025M磷酸盐缓冲液，pH7.4，含3mM GSH，2mM DTT,兔肝匀浆液及纯化样品SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱,思考,1、试比较亲和层析的特异性洗脱和非特异性洗脱的优缺点。2、亲和层析吸附剂制备时，为何常引入“手臂”？3、简述亲和层析吸附剂制备的主要方法和步骤。4、亲和层析的特殊类型有哪些？简述它们的基本原理和应用范围。,课后报告 实例分析新型亲和层析的应用价值和发展趋势,
