《第4章次级代谢课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第4章次级代谢课件.ppt（77页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、第四章,微生物次级代谢与调节,本章主要内容,引论次级代谢物生物合成的前体次级代谢物的生物合成原理 抗生素的生物合成微生物次级代谢作用的调控,微生物次级代谢的特征次级代谢产物的类型抗生素的生源学,概念：次级代谢是指微生物在一定的生长时期(一般是稳定生长期)，以初级代谢产物为前体，合成一些对微生物的生命活动没有明确功能的物质的过程。这一过程的产物即为次级代谢产物。,次级代谢物的种类,抗生素色素生物碱毒素维生素,根据产物的作用分,1.1 微生物次级代谢物的特征,（1）次级代谢产物一般不在产生菌的生长期产生，而是在随后的生产期形成。,1 引论,避免生长受其自身产物的抑制培养液中缺乏某种营养物质或者前体
2、物质的积累起到诱导作用或编码次级代谢产物的基因从分解代谢物阻遏中解脱出来所致。,（2）次级代谢物种类繁多，含有不寻常的化学键,（3）一种菌可以产生结构相近的一族抗生素,产黄青霉可产生至少10种不同青霉素,（4）一族抗生素各组分的多少取决于遗传与环境因素。,源于次级代谢物合成所涉及的酶特异性较低,（5）一种微生物的不同菌株可以产生多种在分子结构上 完全不同的次级代谢产物。,曲霉科,（6）次级代谢物的合成对环境因素特别敏感，其合成信息 受环境因素的调节（7）微生物由生长期向生产期过渡时，菌体形态学上会发 生一些变化,（8）微生物的次级代谢产物的合成过程是一类由多基因 控制的代谢过程,这些基因不仅在
3、微生物染色体上，而且也位于质粒上。,微生物次级代谢产物的合成过程可以概括为如下模式：,1.2 次级代谢物的合成,三个步骤,前体聚合,组分装配,结构修饰,1.3 次级代谢物的类型,根据次级代谢产物中主要组分与初级代谢的关系,糖类,多肽类,聚酯酰类,核酸碱基类似物,其它类型,细交链孢菌酮酸灵菌红素糖肽糖脂类化合物,1.4 抗生素的生源学,生源学:又称生物发生学，是研究一些天然物质(包括有生命的物质)发生、存在的原因，以及它对宿主、环境的作用的科学。抗生素生源学:研究一些微生物会产生这类对其他微生物、甚至对其自身有害物质的原因及这类物质的功能。,代谢调控学者认为抗生素的生源学是：次级代谢物的作用不在
4、于产物而在于产物生产的过程。,1.4 初级与次级途径的相互关系,初级代谢为次级代谢提供前体化合物初级代谢中间体修饰为次级代谢终产物的方式 生物氧化与还原（醇与羰基的氧化、双键的引入或还原）生物甲基化（甲硫氨酸为供体，常出现在合成最后一步）生物卤化（对于分子上含有卤素的次级代谢物很重要）,2 次级代谢物生物合成的前体,2.1 研究次级代谢的意义2.2 前体的概况2.3 前体的作用2.4 前体的限制性,2.1 研究微生物次级代谢的意义：,获得与次级代谢有关的基础理论知识，并用于设计更为有效的途径来合成这类复杂的化合物或改造它们，以获得所需的生物性质；有助于优化次级代谢产物的工业生产。借助于生物合成
5、途径的知识，利用基因工程技术可以帮助构建在遗传学上能产生新化合物的突变株。,养分摄入；通过中枢代谢途径养分转化为中间体；次级代谢物前体的生物合成；如有必要，改变其中的一些中间体；前体进入次级代谢物生物合成专有途径；次级代谢的主要骨架形成后作最后的修饰，成为产物。,次级代谢物生物合成步骤：,2.2 前体的概况,前体(precursor)：是初级代谢的中间体或由培养基提供的，能被代谢形成某种终产物的物质。自身的结构无多大变化，有些还具有促进产物合成的作用。,是指养分或者基质进入一途径后，被转化为一种或者 多种不同的物质，均被进一步代谢，最后获得该途径 的终产物,中间体,如何区分基质、中间体、前体？
6、,前体与中间体的区别：前体的结构往往略需改变后才进入到代谢途径中去；有时指同一物质。,可作为次级代谢物前体的物质,Betina认为，次级代谢物的前体大多数源自初级代谢的中间体：糖类莽草酸/或芳香氨基酸非芳香氨基酸C1化合物脂肪酸柠檬酸循环中间体嘌呤和嘧啶,Martin等将可作为次级代谢物前体的初级代谢的中间体分为：短链脂肪酸异戊二烯单位氨基酸糖与氨基糖环乙醇与氨基环己醇脒基嘌呤与嘧啶碱芳香中间体与芳香氨基酸甲基,2.2.1 内源前体的来源,(1)短链脂肪酸-大环内酯类抗生素,乙酸 CoA丙酸 CoA丁酸 CoA,目前，沿用的大环内酯类有红霉素、麦迪霉素、螺旋霉素、乙酰螺旋霉素、交沙霉素、柱晶白
7、霉素。,异戊二烯单位可参与萜和一些抗生素的合成，如真菌代谢物、动植物和真菌的甾类化合物 和萜的形成。,木霉素、羧链孢酸、新生霉素,（2）异戊二烯单位,正常氨基酸和经过修饰的非蛋白氨基酸可用于合成同型肽类抗生素。有些次级代谢物含有不寻常的氨基酸,（3）经修饰的氨基酸构筑 同型肽类抗生素,（4）芳香中间体抗生素的芳香部分,A 莽草酸途径的中间体或终产物：形成许多次级代谢物的芳香部分。B 芳香氨基酸生物合成途径：负责大多数放线菌和许多植物次生代谢物的生物合成。C 聚多酮途径：大多数真菌产生的芳香代谢物是由乙酸通过聚多酮途径合成的。,糖的碳架以整体的方式结合到抗生素，但是在结合前需要 经过差向异构化、
8、异构化、氧化、去羟基、重排等环节。,（5）经修饰的糖与氨基酸,链霉素、庆大霉素、新霉素和卡那霉素,（6）环己醇与氨基环己醇,（7）脒基和甲基,甲基的来源 抗生素生物合成中的所有甲基化作用均以Met作为甲基供体，通过甲基转移酶进行。而Met的甲基源自N5-四氢叶酸。转甲基时Met先活化，即在Mg2+和ATP存在下生成高能甲基供体：S-腺苷酰甲硫氨酸(SAM)。以SAM进行甲基化后自己变成S-腺苷酰高半胱氨酸(SAH)，后者可被水解为腺苷和高半胱氨酸。,核糖部分或嘌呤或嘧啶部分被修饰。含有正常的核苷的抗生素，例如（狭霉素C以及蛹虫草菌素）,或者核糖部分或嘌呤或嘧啶部分被修饰。,（8）经修饰的嘌呤和
9、嘧啶碱,青霉素G前体：苯乙酸、苯乙胺、苯乙酰胺、苯乙酰苷氨酸头孢菌素前体与青霉素基本相似红霉素簇前体丙酸螺旋霉素前体乙酸、丙酸、丁酸麦迪霉素前体丙酰CoA环孢菌素前体氨基酸氨基糖苷类抗生素前体N乙酰葡糖胺、N乙酰胞壁酸,2.2.2 外源前体的来源,（1）抗生素建筑材料,2.3 前体的作用,例如：丙酮酸可用于Ala、Val、Leu等的合成，是几种肽类抗生素（头孢菌素簇或青霉素簇）合成的重要中间体。,次级代谢物通常由初级中间体产生，将初级中间体转化为次级终产物有三个生化过程：,生物氧化和还原；生物甲基化；生物卤化。,许多次级代谢物是用不同的中间体作为建筑单位合成的。,（2）诱导抗生素生物合成 在细
10、胞中的特殊合成酶的活性已被激活的情况下，细胞可利用的前体浓度具有调节抗生素生产的作用。例如：缬氨酸是头孢菌素A的前体物质和诱导物质。,前体与诱导物的区别,诱导作用在次级代谢物的合成控制上起重要作用。有时难于区分这种促进作用是真的诱导物的作用还是前体的作用。诱导物与前体的作用时期不同 诱导物应能被非前体的结构类似物取代。诱导物的另一个特征是其诱导系数特别高。,前体物质不能被吸收或者不能到达合成次级 代谢的部位添加的物质可能对细胞本身的合成产生反馈 抑制作用，或者不是所需要的前体物质添加的前体物质不是起限制作用的物质其他的反馈抑制,思考：当添加前体物质却不一定能促进次级代谢产物的合成。,2.4 前
11、体的限制性,前体常常是次级代谢物生物合成的限制因素。例1：在发酵过程中加适量苯乙酸可强烈促进苄青霉素的生产；例2：丙酸或丙醇促进大环内酯抗生素的生物合成。例3：肽类抗生素的形成中非蛋白的AA成分通常是限制因素。例4：缺少Ac-CoA会限制四环素的生产。例5：金色链霉菌低产菌株的特征是Ac-CoA倾向于走TCA循环而被氧 化；高产菌株没有这一倾向。例6：诺尔斯链霉菌合成制霉菌素的能力的提高与其前体，丙二酸和甲 基 丙二酸合成的增加有关。,（1）前体合成的分子调节机制*如初级代谢和次级代谢均需要同一种必需的前体，则低浓度的前体需先满足生长的需要。高浓度的前体是抗生素合成所必需的，除去前体 生物合成
12、的反馈调节机制有可能使抗生素增产。,*,（2）前体导向抗生素的合成,次级代谢物的前体源自初级代谢，前体叉向次级代谢物合成途径的第一个酶往往是关键。因为：它决定前体流向抗生素合成的数量、代谢流的分布和抗生素的产量。途径中可能存在其他限制性酶。这些酶往往受到反馈、碳、氮或磷的调节。另一些酶可能受到高浓度前体的诱导。引向初级和次级代谢物的支路途径的生理调节随不同的M及其代谢途径而有所不同。,（3）添加前体的策略,研究前体添加策略对有些抗生素高产稳产有重要意义。高产菌株对前体的利用率(可90)比低产菌株高许多。,添加前体时宜少量多次或流加，控制发酵液中前体的残留浓度在适当范围。例如：苯乙胺浓度在0.0
13、50.08。,3 次级代谢物生物合成原理3.1合成原理,前体存在，在适当条件下它们便流向次级代谢物生物合成的专用途径。在某些情况下单体结构单位被聚合，形成聚合物，如聚酮化物、寡肽和聚醚类抗生素等。这些特有的生物合成中间产物需作后几步的结构修饰，修饰的深度取决于产生菌的生理条件。最后，有些复杂抗生素是由几个来自不同生物合成途径组成的。,次级代谢专用的关键酶通常受次级代谢物的控制：例1：麦角生物碱生物合成的第一个酶受Trp或其类似物的诱导作用。从生长期到生产期的过渡期间较高的Trp库存量导致DMAT合成酶的浓度增加。例2：苯恶嗪酮合成酶是放线菌素生物合成的关键酶，受葡萄糖分解代谢物阻遏。例3：磷酸
14、阻遏灰色链霉菌的对氨基苯甲酸合成酶的形成。,通过前体单体聚合的次级代谢物有：四环类、大环内酯类、安莎霉素类、真菌芳香化合物的聚多酮类和肽类抗生素，以及聚醚和聚异戊二烯类抗生素。这些聚合过程所涉及的生物合成机制对上述次级代谢物均适用。这说明这类合成酶具有共同的进化渊源。,3.2 前体聚合作用过程,聚合反应是由高相对分子质量的合成酶催化的：,例如：肽类抗生素合成酶 聚多酮合成酶,聚合后许多次级代谢物的化学结构通过多步酶反应修饰完成。,3.3 次级代谢物结构的后几步修饰,某些次级代谢物是由单一类前体衍生的，（例如同型肽）。许多次级代谢物由几类不同的前体合成的。（例如，杂肽类抗生素是由氨基酸和脂肪酸组
15、装成的）。,3.4 复合抗生素中不同部分的装配,如：链霉素：由N-甲基-L-葡萄糖胺、链霉糖和链霉胍三部分组成。新生霉素：由新生霉糖、香豆素、对氨基苯甲酸和异戊烯四个部 分组成的。杀假丝菌素：由对氨基苯甲酸与4个丙酸，15个乙酸和一个丁酸单 位缩合组装的，并连接上一个罕见的碳霉糖胺。诺卡菌素：由L-高丝氨酸、修饰过的L-对羟苯甘氨酸、L-Ser和未经 修饰的L-对羟苯甘氨酸组成。,次级代谢物合成酶往往只具有簇的专一性，即对基质分子的某一部分有要求，对分子的其他部分无绝对要求。,3.5 次级代谢物合成酶的专一性,如：产黄青霉的青霉素酰基转移酶能催化青霉素N的a-氨基己二酰侧链，使转化为疏水性的酰
16、基侧链。此反应专一性较高，因它不能酰化7-氨基头孢霉烷酸(7-ACA)，但接受广泛的内源与外源酰基CoA衍生物。,然而，不是所有参与次级代谢物合成的酶都缺乏基质专一性。有些具有高度专一性。如：红霉素合成酶形成红霉内酯糖苷配基时只接受甲基丙二酰CoA作为延长单位，而不用丙二酰CoA单位。杀假丝菌素合成酶总是按既定的顺序聚合适当的前体单位。,参与初级代谢物和次级代谢物生物合成的基本差别之一在 于引物和延长单位的异质性。如：如由于缺少高度专一性，乙酰CoA、丙二酰CoA和丙二酰胺CoA可在 四环类抗生素合成中作引物。同样，杀假丝菌素合成中几种芳香酰基 CoA衍生物也可作引物。,4 抗生素的生物合成,
17、合成次级代谢物是作为储藏物；作为正常代谢的无用的副产物；大分子消化后残留的碎片；解除体内有害代谢物的毒性；支路代谢物；竞争需要，用于抑制其他微生物，争夺有限的养分；进化遗留所致；在自然界具有生态上功能；调节功能，至少与形态学的分化方面有关；代谢维持产物，其作用主要是代谢过程而不是产物本身。,合成机理,4.1 抗生素的生物合成,（1）以短链脂肪酸为前体的抗生素活性乙酸和丙二酸单体的依次结合，这种单体首尾缩合，形成聚酮链起始单位是乙酰CoA，丙二酰CoA为延伸单位，在缩合的 过程中形成乙酰乙酰CoA并释放一个CO2。此反应是附着于酶的表面进行的。起始单位可以是乙酰CoA、丙酰CoA或者更为复杂的C
18、oA 衍生物,酯酰基CoA的形成,羧化与转羧基反应,大环内酯合酶,大环内酯类抗生素,(2)以氨基酸为前体的抗生素,此类抗生素是氨基酸的衍生物，如青霉素、头孢菌素、环丝氨酸等。青霉素的生物合成,侧链前体,Cys、Val,+,关键酶,霉菌,(3)以经修饰的糖为前体的抗生素,主要有氨基糖苷类、大环内脂类及蒽环类抗生素。氨基糖苷类抗生素有100多种，产生菌有链霉菌、小单孢菌属、诺卡氏放线菌属、芽孢杆菌属及假单孢菌属。,5 微生物次级代谢作用的调控,从抗生素工业生产角度出发，为了搞清抗生素生物合成控制的机制，需要回答以下基本问题：参与抗生素生物合成作用的酶是什么时候出现的，其合成如何控制；供给抗生素生物
19、合成过程的前体物质是从哪些初级代谢活动中得到的；上述两种系统是怎样协调以保证抗生素合成作用高效进行。,5.1 微生物的次级代谢与其生命活动的关系（1）次级代谢在微生物中起作用,富集营养物质,清除不平衡生长时积累的有害的低分子量中间代谢产物,不利的条件下储存物质,生物调节剂的作用,（2）次级代谢与生长、分化的关系,细菌分化与次级代谢,放线菌分化与次级代谢,真菌分化与次级代谢,肽类抗生素可能具有调节孢子形成或萌芽孢子生长的形成过程,抗生物合成与孢子形成是受到共同的控制机制调节的两种过程,次级代谢是在生长受到限制的分化期产生的,（3）次级代谢产物合成的调控 参与抗生素合成作用的酶的诱导及解除阻遏 抗
20、生素生物合成启动的控制,抗生素生 物合成酶 的阻遏,抗生素合 成的较晚 出现,初级代谢的末端代谢产物反馈抑制作用,碳源分解代谢物的调节,cAMP条件介质因子(conditioned media factor,CMF),碳源分解代谢物,氮源分解代谢物的调节,磷酸盐的调节作用,促进EMP途径抑制HMS途径,限制诱导物的合成,抑制前体的合成,抑制/阻遏磷酸酯酶,抗生素生物合成的终止,途径中的酶发生不可逆的衰退,积累的抗生素产生反馈抑制作用,抗生素前体的耗尽,人工克服微生物次级代谢控制作用的限制,添加色氨酸以促进生物碱合成酶的合成,避免葡萄糖等能迅速被利用的糖类对合成酶的阻遏作用,诱变作用（回复突变）,限制磷的含量以防止阻遏磷酸酯酶的合成,定向抗生素的合成,突变作用,使用非天然前体,抑制剂或诱导物,阻断型突变株,独特的基质,极端条件或菌株,用酶改造代谢产物,混合培养发酵,基因操作,5.2 基因工程在提高生成性能上的应用,强化网络控制机构改变表达体系扩增抗生素产生菌的抗性基因提高编码关键酶的基因剂量提高转移水平的表达效率增强重组基因的生长能力调节性启动子,怀孢菌素A,
