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1、脱落细胞学检验-脱落细胞学基本技术,戚永孝,概 述,脱落细胞学技术是本课程的重要内容。脱落细胞检验者除要熟练掌握细胞形态学特征外，还必须掌握各项操作技术和观察方法。包括标本的采集、制片、固定、染色、镜下观察以及书写诊断报告等。,第一节 标本采集,标本采集是脱落细胞学检验的基础，也是细胞学诊断成败的关键之一。一、标本采集的原则正确选择采集部位，尽可能自病变区直接采取细胞。采集的标本必须保持新鲜，以免细胞自溶或腐败。尽可能避免干扰物，如血液、粘液等混入标本内。采集方法应简便，病人少受痛苫，且不致引起严重的并发症或促使肿瘤扩散。,二、几种常用的标本采集法,（一）直视采集法直视下采集标本的部位有外阴、
2、阴道、宫颈、阴道穹窿、鼻腔、鼻咽、眼结膜、皮肤、口腔及肛管等，可用刮片、吸管吸取、擦拭或刷洗。此外，用带有微型尼龙刷的纤维内窥镜在食管、胃、气管及肺内支气管部位的病灶处直接刷取细胞涂片也属于直视采集法。,（二）自然分泌液的收集法自然分泌液包括痰液、尿液、前列腺液、乳头溢液等。1痰液涂片检查 因痰液为支气管等呼吸道的分泌物，对支气管肺癌和呼吸道的疾病诊断具有重要价值。2尿液涂片检查 泌尿道的上皮、炎症细胞及恶性肿瘤细胞等均可在腔内脱落，随尿液排出，因此，收集尿液细胞作检查，对泌尿道肿痛及某些疾病诊断有一定意义。3前列腺液涂片检查 采用前列腺按摩法取得分泌物作涂片，对前列腺炎及癌的诊断有一定价值。
3、4乳头溢液涂片检查 用于诊断乳腺病。,（三）灌洗法此法是通过向空腔器官灌注一定量生理盐水等液体，运用冲洗、振动、揉捏等方法，使空腔器官中的某些细胞包括癌细胞脱落于其中，然后将灌洗液取出，经适当处理后检查。（四）摩擦法此法主要采用摩擦工具，摩揉病变区的粘膜直接涂片。,（五）穿刺针吸法,细针吸取细胞学又名细针吸取或针吸细胞学，是用细针穿刺病灶，吸取少许细胞成分做涂片检查的种诊断细胞学。所吸取的细胞是人为的“脱落”细胞，有时可同时吸出少许组织。此法是细胞学诊断中重要的标本采集方法之一。,1细针吸取细胞学穿刺部位的选择 正确选择穿刺部位是一个十分重要的问题，实践证明，对肿块穿刺部位的选择应参考下列原则
4、进行：（1）肿块暴露较好，操作较方便。（2）怀疑原发性病灶的肿块。（3）淋巴结或肿块较大、较硬，无液化、坏死或继发感染者。（4）穿刺点应避开体表血管、炎症及溃疡等部位，且肿物邻近无重要神经、血管、脏器。,2细针吸取细胞学的优点（1）穿刺抽取操作简单易行。（2）操作安全，极少发生副作用或意外，病人痛苦小，不需切开，无明显瘢痕形成。（3）取样迅速、制片、诊断亦较快一般仅需1h左右可用于手术中的快速诊断。（4）应用范围，几乎适用于任何部位。穿刺检查可到达人体不同组织器官的病灶，并可同时对多个肿块进行穿刺提高了阳性率及准确率。（5）可对同肿物进行多次穿刺，重复检在，有利于动态观察肿块的生长、发展或肿块
5、放疗、化疗的疗效。,第二节 涂片制作,良好、适宜的涂片是脱落细胞学能否正确诊断的重要条件之一。一、涂片制备的原则：第一，在标本制片之前，要把材料准备好，如载玻片、推片、盖玻片、滴管等，各种用品均要求清洁、干燥，载玻片要求表面光滑，无油渍、无划痕及破损等。第二，标本采集后，应尽快做出处理、以最快的速度制片，否则标本凝固或pH值改变，引起细胞形态变化或自溶、腐败等，影响诊断结果。第三，制片时操作应轻巧，以免损伤细胞。涂片的厚薄应适宜，太厚则细胞过多、重叠不易染色且细胞形态不易辨别；太薄则细胞稀少，影响阳性的检出率。一张好的涂片应是分布均匀、厚薄适宜，涂片呈舌状，分为头、体、尾三部分，镜下各个视野均
6、有细胞成分，红细胞无明显重叠现象。,第四，若液体标本内缺乏蛋白质时，在制片过程户，可先在玻片上涂上粘附剂（如甘油血清、甘油蛋白、血清等）或直接在液体标本中加入粘附剂，以防标本在固定及染色过程中脱落。第五，应采取标本的各部分制片，特别是对于组织钳取物及较大组织的印片，并尽可能选取具有代表件的部位制片，以减少漏诊，提高阳性的检出率。第六标本一般应制片4张以上，并逐张固定、染色及镜检，以防遗漏。第七，涂片应统一进行编号、登记，以免混淆。,二、涂片的制备方法,（1）推片法：用于稀薄的标本，如血液，胸、腹水等。取离心后标本一小滴滴在玻片偏右侧端，用推片用30度夹角将玻片上检液轻轻向左推。（2）涂抹法：适
7、用于稍稠的检液，如鼻咽部标本。用竹棉签在玻片上涂布，由玻片中心经顺时针方向外转圈涂抹；或从玻片一端开始平行涂抹，涂抹要均匀，不宜重复。（3）压拉涂片法：将标本夹于横竖交叉的两张玻片之间，然后移动两张玻片，使之重叠，再边压边拉，获得两张涂片。该法适用于较粘稠标本，如痰液。,（4）吸管推片法：用吸和将标本滴在玻片一端，然后将滴管前端平行置于标本滴上，平行向另一端均速移动滴管即可推出均匀薄膜。此法亦适用于胸、腹水标本。（5）喷射法：用配细针头的注射器将标本从左至右反复均匀地喷射在玻片上，此法适用于各种吸取的液体标本。（6）印片法：将切取的病变组织用手术切开，立即将切面平放在玻片上，轻轻按印。此方法为
8、活体组织检查的辅助方法。,第三节 涂片的固定,固定的目的是保持细胞自然形态，防止细胞自溶和细菌所致的腐败；固定液能沉淀和凝固细胞内蛋白质和破坏细胞内溶酶体酶，使细胞不但保持自然形态，而且结构清晰，易于着色。因此标本愈新鲜，固定愈及时，细胞结构愈清晰，染色效果愈好。,1固定液：细胞学检查常用的固定液有下列三种：第一种乙醚酒清固定液：该固定液渗透明性较强，固定效果好适用于于一般细胞学常规染色；二种是氯仿酒精固定液：又称卡诺氏固定液。其优点同上；第三种95%酒精固定液：适用于大规模防癌普查。制备简单。但渗透作用稍差。,2固定方法（1）带湿固定：涂片后未待标本干燥即行固定的方法称带湿因定。此法因定细胞
9、结构清楚，染色新鲜。适用于巴氏或HE染色。痰液、阴道分泌物及食管拉网涂片等常任常用此方法。（2）干燥因定：涂片后未待其自然干燥，再行固定。适用于稀薄标本如尿液、胃冲洗液等，也适用于于瑞特染色和姬姆萨染色。3固定时间：一般为15-30min。含粘液较多标本，如痰液、阴道分泌物、食管拉网等因定时间在适当延长；尿液、胸、腹水等涂片不含粘液，固定时间可酌情缩短。,第四节 涂片的染色,1染色的目的和原理：染色的目的是借助于一种或多种染料，使组织和细胞内结构分别着不同的染色，这样在显微镜下能清楚地观察细胞内部结构，作出正确判断。组织细胞染色原理至今尚无满意的解释，可能是物理作用，也可能是化学作用，或者是两
10、者综合作用的结果。染色的物理作用是利用毛细管现象，渗透、吸收和吸附作用，使染料的色素颗粒牢固地进入组织细胞，并使其显色。,染色的化学作用是渗入组织细胞的染料与其相应的物质起化学反应，产生有色的化合物。各染料都具有两种性质，即产生颜色；与组织形成亲和力。这两种性质主要由发色基因和助色基因所产生的。发色基团：苯的衍生物具有可见光区吸收带。这些衍生物的吸收带与其价键的不稳定性有关，如对苯二酚为无色，当其氧化后失去两个氢原子，它的分子或则变为有黄色的对醌，这种产生颜色的醌式环称为发色基团。若一种化合物含有几个环，只要其中有一个醌式环就会发出颜色，称此发色基团为色原.,助色基团：是一种能使化合物以生电离
11、作用的辅助原子团（酸碱性基团）。它能使染色的色泽进一步加深，并使其与被染色组织具有亲和力。助色基团的性质决定染料是酸性碱性。碱性染料具有碱性助色基团，在溶酶中产生的带色部分为带正电荷的阳离子，易与组织细胞内带负电荷的物质结合而显色。如细胞核内的主要化学成分脱氧化核糖核酸易被苏木素染成紫蓝色，称嗜碱性。酸性染料具有酸性助色基团，在溶酶中产生带色部分为阴离子，易与组织细胞内带正电荷部分结合而显色，此性质被称为嗜酸性，如细胞浆内成分为蛋白质，易与伊红或橘黄结合呈红色或橘黄色。,2常用染色方法：临床日常工作中较为常用的染色方法有下列3种：（1）巴氏染色法：本法染色特点是细胞具有多色性颜色，色彩鲜艳多彩
12、。涂片染色的透明性好，胞质颗粒分明，胞核结构清晰，如鳞状上皮过度角化细胞胞质呈橘黄色；角化细胞显粉红色；而角化前细胞显浅绿色或浅蓝色，适用于上皮细胞染色或观察阴道涂片中激素水平对上皮细胞的影响。此方法的缺点是染色程序比较复杂。（2）苏木精伊红（HE）染色法：该方法染色透明度好，核与胞质对比鲜明。染色步骤简便，效果稳定。适用于痰液涂片，异质核呈紫蓝色，胞质淡玫瑰红色，红细胞呈淡朱红色。（3）瑞特吉姆萨染色法；本方法多用于血液，骨髓细胞学检查。胞质内颗粒与核安危质结构显示较清晰。操作简便。,第五节 涂片的观察与诊断,一、涂片观察的方法为提高诊断率和防止造成差错，检查涂片前必须严格核对涂片编号，了解
13、送检单上填写的全部资料；阅片要全面、认真、细心观察。因涂片中细胞成分分布极为分散，所以显微镜观察时必须按顺序视全张涂片，用推进器从左至右。自上而下移动，仔细观察每一个视野，归后将盖片边缘亦做仔细检查，防止漏诊（图20-1）。,图20-1 观察切片的移动法A错误的玻片移动法 B正确的玻片移动法,涂片细胞学检查十分重视低倍观察，先宏观涂片中各种细胞成分，发现异常细胞时，再转换高倍视野，仔细观察细胞结构，明确性质，做出正确诊断。,二、提高细胞学诊断率的要领,（一）细胞学诊断的书写方式细胞学检查癌细胞的诊断方式分为直接法和分级法。1直接法：根据细胞学检查结果，直接写出关于疾病的诊断如痰抹片检查结果为“
14、支气管鳞癌”。2分级法：将涂片中细胞学检查发现的细胞变化，用分级方式表示。它的优点是能真实地反映细胞学所见。比较客观。目前有三级、四级、和五级三种分类方法。五级分类法过于繁琐，实际应用中较难掌握。因此国内仍常用三级或四级分类法，该两种分类 法较为简单明确，易于掌握，能够更准确地反映涂片的本质。,（1）三级分类法：将细胞学检查结果分为阴性，可疑和阳性三级。级：阴性：无核异质细胞，涂片中均为正常细胞或一般退变细胞。级：可疑。涂片中发现核异质细胞，但不能肯定的是肿瘤细胞，应重复送检。级：阳性。涂片中发现典型癌细胞，有时根据癌细胞形态特征及分布，初步进行分类。,（2）四级分类法：将细胞学检查结果分为阴
15、性、核异质，可疑和阳性四级。级：阴性。级：核异质。涂片中发现少量核异质细胞，由高度炎症增生所致。级：可疑。涂片中见重度核异质细胞，其形态基本符合恶性肿瘤细胞标准，但数量过少，还不能完全排除癌前期病变或高度炎症增生生的可能，建议临床重复送检。级：阳性。,（3）五级分类法级：无核异质细胞。级：少量轻度核异质细胞，但无恶性证据。级：有较多重度核异质细胞，但不能肯定为恶性。级：有大量重度核异质细胞，但仍缺乏典型恶性肿瘤细胞的证据。级：发现典型恶性肿瘤细胞，根据其细胞形态，作出初步的分类。,（二）提高细胞学诊断的要领1熟练掌握病理学：脱落细胞来自组织，所以是病变组织的部分反映，具有踏实的病理学基础，才能
16、对千变万化的脱落细胞形态作出正确的判断。2多思考、多比较：涂片中细胞成分，背景成分以及细胞变性程度等每例各不相同，阅片时要分析思考和比较，最好用涂片中某一背景成分，如淋巴细胞或红细胞作标本。3密切结合临床：多与临床医生联系，了解临床症状，化验及影像诊断结果，避免盲目性。4认识脱落细胞学的局限性：无充分证据，宁可保守一点。未肯定的报告对临床亦有参考价值。5了解各种染色的特性和优缺点因不同染色方法，细胞表现差别很大。,（三）细胞学诊断的误诊原因细胞学诊断误诊造成临床诊断的错误，以致影响对患者疾病的诊断治疗。误诊形式有假阳性和假阴性两种。前者是在非肿瘤患者涂片中找到所谓的癌细胞；后者是在肿瘤患者涂片
17、内未找到癌细胞。细胞学检查从取材到最后诊断，任何一个步骤处理不当，均可产生误诊。引起的误诊原因有以下几种：,1标本取材不当：未取到真有癌细胞部分，如痰液制片时未仔细选择有效病理成分；或患者咳痰方式不对，未采集到支气管深部分泌物等。2标本不新鲜：细胞学检查标本必须在采集后1-2小时内涂片，立即固定，以防止细胞自溶。3编号错误：会发生误诊造成医疗事故。故送检标本、申请单、涂片、报告单编号后应仔细核对，避免出现差错。,4细胞污染：涂片在固定和染色过程中，不断有细胞脱落于试剂中，这些细胞有可能粘附在其它患者涂片上而造成误诊，故要经常过滤或现换试剂。5观察不仔细或方法不正确而发生的漏误。6肿瘤细胞分化好，与正常细胞不易区别。7经放疗或化疗后，正常上皮细胞受射线作用，有明显的形态学改变，易误诊为癌细胞。,
