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1、,细胞增殖和细胞活力,中心实验室 李娜,检测细胞增殖能力的方法,一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability）检测方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。所以最直接的证据应该采用方法一。,细胞增殖检测技术,直接计数胸腺嘧啶核苷(3HTdR
2、)渗入法5.5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)检测法5-乙炔基-2脱氧尿嘧啶核苷（EdU）羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)检测法CCK8MTT检测法ATP检测,1.直接计数,利用计数板或计数仪得出细胞的数目，然后对数目进行比较。优点：简单：不需要特定的试剂和仪器准确缺点：不适合样品数量多的情况不适合评估特定的亚群,台盼蓝,细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合，使其着色。而活细胞能阻止染料进入细胞内。故可以鉴别死细胞与活细胞。,2.胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)渗入法,胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的碱基，也是DNA合成的必需物质。用同位素H标记TdR即H-
3、TdR作为DNA合成的前体能掺入DNA合成代谢过程，通过测定细胞 DNA链内标记核苷酸的量的放射性强度，可以反映细胞DNA的代谢及细胞增殖情况。优点：3H-TdR掺入法敏感性高，客观性强，重复性好。缺点：但需一定设备条件，同时还存在放射性核素污染问题。,3.5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)检测法,Brdu是胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活体注射或细胞培养加入，而后利用Brdu专一性抗体，显示增殖细胞。同时结合其它细胞标记物，双重染色，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义。BrdU标记很适合免疫组化IHC、免疫细胞化学IC、细胞内ELISA、流式细
4、胞分析和高通量筛选。优点：不仅能用于体外实验，还能用于活体实验，缺点：就是需要变性DNA后才能与抗体结合，但这就破坏了DNA双链结构，影响了其他染料的结合染色，导致染色弥散，准确性降低等问题,8,4.5-乙炔基-2脱氧尿嘧啶核苷（EdU）,也是一种胸腺嘧啶核苷类似物。它也能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶（T）渗入正在复制的DNA分子，通过基于EdU与Apollo荧光染料的特异性反应检测DNA复制活性，通过检测EdU标记便能准确地反映细胞的增殖情况。EdU检测染料只有BrdU抗体大小的1/500，在细胞内很容易扩散，无需DNA变性（酸解、热解、酶解等）即可有效检测，可有效避免样品损伤，在细胞和组织
5、水平能更准确地反映细胞增殖等现象。,5.羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)检测法,羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，使CFSE成为一种良好的细胞标记物。CFSE进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。当细胞分裂时，CFSE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。这样，在一个增殖的细胞群中，各连续代细胞的荧光强度呈对递减，利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通道可对其进行分析。,5.羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(
6、CFSE)检测法,CFSE能够轻易穿透细胞膜，在活细胞内聚积并与胞内蛋白共价结合，水解后的CFSE释放出荧光物质，这些共价结合的荧光物分子很少从细胞内脱落。CFSE标记后的细胞用于体内观察可以长达数周。因此，CFSE常被用来做活细胞检测试验和用荧光电镜观察细胞长期活动的试验。利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通道可对其进行分析。CFSE标记的细胞的激发和发射波长分别为500 nm和520 nm,6.CCK8检测法,是一种基于WST8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测方法。CCK8细胞活性检测试剂中含有WST8：2(2甲氧基4硝基苯基)3(4硝基苯基)5(2,4二磺酸苯)2
7、H四唑单钠盐。WST8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的甲瓒产物formazan。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。,7.MTT检测法,MTT检测法主要反映细胞的能量代谢，是检测细胞增殖活力的一种简便准确的方法。其原理是在活细胞生长和增殖过程中，线粒体内的脱氢酶可将黄色的MTT分解
8、成兰紫色的水不溶性的甲瓒(Formazan)，并沉积在细胞中，死细胞无此功能。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数和细胞活力成正比。MTT方法用于判断药物、外源性基因、小RNA、蛋白、抗体、细胞因子、血清等对于细胞的作用，以明确上述因子对于细胞生物学行为的影响（如细胞活力、增殖、凋亡等方面）。,8.ATP检测,细胞内的ATP含量受到了严格调控，检测ATP也可以得到细
9、胞增殖的信息。死亡细胞或即将死亡的细胞几乎不含ATP，在细胞溶解物或提取物中测得的ATP浓度与细胞数之间存在严格的线性关系。利用荧光素酶luciferase及其底物荧光素luciferin的ATP检测以生物发光为基础，能够提供非常灵敏的结果。如果有ATP存在荧光素酶就会发光，而且其发光强度与ATP浓度成正比，用能读取发光信号的光度计和酶标仪都可以方便的进行检测。这种方法非常适用于高通量细胞增殖检测和筛选。,细胞计数,计算板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按公式计算：细胞数/mL=四大格细胞总数/4104,选择策略,怎样选择最适合的检测方法，主要依赖于使用的细胞类型和具体研究方案，
10、还取决于实验者在细胞增殖中期望得到的信息。假如希望了解细胞增殖中的代谢活性变化，可以使用四唑盐和比色法检测；如果关注重点在于对DNA合成的改变，可以选择用BrdU或EdU标记，再通过比色法、化学发光或荧光检测进行分析；若研究的是单个细胞，也可以用BrdU或EdU标记来检测DNA合成，将其与荧光标记的相应抗体结合，就可以通过流式细胞仪来进行流式分选。,选择策略,应该注意，测定细胞增殖很多时候单一方法都是有缺陷的，四唑盐MTT法不够精确；最直接的指标是活细胞数量的变化，结果比较准确，但细胞直接计数法所需细胞量较多，操作繁琐费时；而3H掺入法麻烦且不安全。所以，建议最好用两种以上的方法进行测定，这样
11、做主要是可以有一个用于辅助修正的数据。,注意事项-选择适当得细胞接种浓度。,一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。,注意事项-设置调零孔,实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜不同的是对照孔加溶解药
12、物的介质加药组加入不同浓度的药物。每组设定3复孔设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。,注意事项-药物浓度的设定,一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。,注意事项-时间点的设定,在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。,注意事项-培养时间,200ul的培养液对于10的45次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。,注意事项,MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。,注意事项-避免血清干扰,用含15%胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。,谢谢！,
