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1、,特殊显微镜的使用(3)荧光显微镜的原理及其应用实验目的掌握荧光显微镜的原理和使用方法二、实验原理荧光显微镜(fluorescence microscope)是荧光显微术的基本装置。荧光显微术是利定波长的光通常是波长短的紫外光和蓝紫光)照射被检样品,激发荧光物质发出可见的荧光。通过物镜和目镜的成像、放大,以供检视和拍摄。荧光显微镜具特殊光源,提供足够强度和波长的激发光诱发荧光物质发出荧光。视场中所见的像,主要是样品的荧光映像,某些物质经波长较短的光线照射后,分子被激活吸收能呈激发态。其能量部分转化为热量或用于光化学反应外,相当一部分则以波长较长的光能形式辐射出来,这种波长长于激发光的可见光称作
2、荧光。生物体内有些物质受激发光照射后接发出的荧光,称为自发荧光(如叶绿体中的叶绿素分子受激发所发出的火红色的荧光);本身不发荧光,在吸收荧光染料之后所发出的荧菱絮次霛誚、當用的光料积持￥橙细胞内大部分物质经短光波照射后,可发出较弱的自发性荧光。有些细胞成分与能发出荧光的有机化合物荧光柔料结合。激发后呈现一定颜色的荧光,借以对组织进行细胞化学的观察和研究,2.1荧光显微镜的基本装置及其光路荧光显微镜因制造厂家、型号的不同,结构各异,但主要构件,基本相同2.1.1光源:采用高压汞灯。汞灯能以最小的表面发出最大数量的紫外光和蓝光,且光亮度大,度汞灯的构光黯体中间为一球形石英玻璃有两个钨电极,内充汞滴
3、和少量氩氖汞灯装在牢固的灯室中,有调中、聚焦和集光装置。使用中严禁频繁启闭,点亮后欲暂停使用时不可切断电源,可用光阀阻断光路后,不能立刻点亮,经510min,汞灯冷却后再通电点亮。HBO200W汞灯的发射光谱为200600nm,其中在365nm和435nm处有两个高峰。,2.2.2滤色镜系统:荧光显微术的滤色镜,按用途或功能,主要分为下列两类激发滤色镜(exciter filter):激发滤色镜的作用,在于为被检样品的荧光染料提供最佳波段的激发光。荧光染料均有一定的吸收光谱(激发峰值),利用滤色镜对光线选择吸收的能力,选用其透射光谱,恰为荧光染料的最大吸收光谱(激发高峰)的激发滤色镜,以便从汞灯发出的广谱光波中,选择透过最宜波段的光线供用。激发滤色镜加放于汞灯和二向色镜(dichoticmirror)之间,物镜之前。滤镜的型号不同,数量较多,可按不同需要选用,阻断滤色镜(barrier filter):阻断滤色镜位于物镜之上,二向色镜和目镜之间,用以阻断或吸收光路中的激发光或某些波长较短的光线,以防伤害眼睛,使荧光透过选用的原则,以能完全阻断或吸收波长短于所需荧光的光线,并透过样品发出的荧光。所以,阻断滤色镜的选用,应视荧光染料的荧光光谱而定,以能最大限度地透过荧光和阻断短波光,
