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1、农药污染土壤的微生物分子生态学效应,南京农业大学生命科学学院农业部农业环境微生物工程重点开放实验室,近年来，化学合成工业的发展给环境带来了大量异生物质（xanobiotics），导致环境污染日益严重、生态破坏不断加剧。研究生物系统与被污染的环境系统之间的相互作用规律及采用生态学原理和方法对污染环境进行控制和修复研究成为目前研究的热点。化学农药是一类重要的环境污染物，其土壤环境的污染与效应引起了广泛的重视。,被污染的环境系统与生物系统之间的相互作用是一个动态过程，土壤微生物群落结构及其变化能否成为评价土壤污染的分子指标之一？,农药（甲基对硫磷）长期污染对土壤微生物的影响,对照土壤样品：未污染土壤
2、污染土壤样品：受甲基对硫磷20多年污染的土壤,实验材料（土壤）：,基于常规方法的分析研究：,1、三大菌群数量,个/g.干土,2、对生理功能群的影响（MPN法计数）,107,106,103,101,103,3、对土壤微生物活性的影响,基于16S rDNA方法评价土壤微生物种群结构的变化,对照土壤和污染土壤16S rDNA文库的构建,构建路线,两种土壤总DNA的提取纯化,细菌混合16S rDNA的PCR扩增,T-VECTOR,T/A克隆,转化E.coli DH5 感受态细胞，挑取白斑转化子保存,16S rDNA文库克隆插入片段的RFLP分析,限制性内切酶：Hha：GCGC Rsa：GTAC,Clo
3、ne of unique phylotype,Total phylotypes,Unique phylotypes,Total clones,common phylotypes,Clone of common phylotypes,rare phylotypes,74.36%,72.50%,69.42%,67.22%,25.64%,27.49%,30.58%,32.78%,81.73%,71.13%,甲基对硫磷长期污染对细菌遗传多样性的影响,甲基对硫磷长期污染会造成土壤微生物多样性下降,污染土壤中优势类群的分类地位,常规分析技术与基于16S rDNA的土壤微生物群落结构分析结果趋于一致，越来越
4、多的证据显示该方法可以成为土壤污染的分子判别的指标之一。,污染土壤中有机磷农药降解菌的分离与多样性研究,有机磷农药降解菌的分离,mp-1 Pseudaminobactermp-2 Alcaligenesmp-3 Ochrobactrummp-4 Ochrobactrummp-5 Ochrobactrummp-6 Ochrobactrummp-7 Brucella,有机磷农药降解菌的培养特征,降解菌的生理生化特征,降解菌16S rDNA序列的相似性距阵,降解菌对有机磷化学农药的降解谱,降解菌对芳香族化合物的降解,有机磷农药降解菌的ERIC-PCR图谱,然而，Southern Blot 证明这些降
5、解菌水解酶基因却很保守,这些降解菌在形态、生理生化特征、降解谱、16S rDNA相似性、ERIC 指纹图谱等方面存在广泛的多样性。,降解菌多样性,降解基因的保守性,Any relationship?,降解基因是通过水平转移而来？基因水平转移是降解基因分布在不同种群中的分子机制？降解基因的水平转移是微生物适应污染生态的机理之一？,（1）进化上相近的降解基因（簇）从地理位置上很远的细菌中被发现；（2）同一污染物不同菌株降解基因的系统进化关系与宿主菌16S rDNA的系统发育关系不一致；（3）降解有机污染物的基因与自转移质粒或转座子等MGEs相连；（4）降解基因（簇）G+C%含量与宿主菌的明显不同，
6、一般也认为降解基因是通过水平转移获得的。,基因水平转移的证据：,通过鸟枪法建库克隆了菌株的降解基因，获得了大片段的包含降解基因上下游序列在内的全部基因信息,逻辑证据降解菌16S rDNA 系统进化树与降解菌水解酶基因系统进化树的一致性比较,基于16S rDNA序列,基于有机磷农药水解酶基因序列,进化关系不一致,1291bp,分子基础证据降解代谢转座子（catabolic transposon）的克隆与分析,TnpA,IRL,IRR,转座子插入序列IS6100结构示意图,IRR：TTTGCAACAGAGCC,IRL：GGCTCTGTTGCAAA,1、污染环境中的水平基因转移在代谢转座子的扩散以及新的代谢途径形成中发挥着重要的作用，使细菌群落能更快的适应污染环境。2、降解基因水平转移的另一个重要作用是有力的促进了一些生境中污染物的降解。携带污染物代谢转座子的宿主菌接种至污染环境中，代谢转座子可以向土著微生物转移，从而增强微生物修复农药残留面源污染的效果。,降解基因水平转移在污染环境中功能与作用：,Thank You,
