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1、“烟草青枯病和黑胫病综合防治技术”项目实施方案一、研究内容和预期目标1、研究内容：（1）鉴定烟草青枯病和黑胫病的致病小种，通过现代生物技术手段，开展早期检测、监测技术体系研究。 （2）结合气象、土壤、品种、生物和生产方式等因素系统研究我市烟区烟草青枯病和黑胫病的发生条件、流行规律。（3）结合我市烟区现状和生产习惯，研究有针对性的农业防治措施，形成农业防治技术规程,探索生物防治手段。2、预期目标：（1）基本明确重庆烟区烟草青枯病和黑胫病发生、危害、流行的特点和规律。（2）初步明确重庆烟区烟草青枯病和黑胫病病原致病力分化和烟草青枯病生理小种，探索综合防治手段。（3）初步建立早期快速检测与监测技术。
2、二、合作研究期限：2006年3月2006年12月三、试验研究地选择1、室内试验研究在西南大学植物生态病理研究所进行。2、系统调查、样品采集及综合防治探索研究拟在酉阳县烟草种植区进行。四、具体研究内容和实施方案（一）重庆烟区烟草青枯病和黑胫病发生、危害、流行的特点和规律研究。1、 调查地点：酉阳县烟草青枯病、黑胫病发生地区2、 研究方法：（1） 通过与当地烟草公司的技术人员、烟农座谈和实地考察，了解当地土壤状况，品种特性，栽培措施（含病残体处理），水肥管理等因素与两病害的关系。（2） 通过县烟草公司，从当地气象部门获取（温度、湿度、降雨等）气象资料，结合病害调查，基本明确烟草青枯病、黑胫病发生、
3、危害、流行与气候条件之间的关系。（3） 定点调查：选择有代表性的田块（水田、旱地、品种等）定点观察。从田间初始发病开始采用系统调查方法，每隔35天调查记载青枯病、黑胫病发生情况。将数据转化为青枯病、黑胫病的季节流行曲线图，分析病害随着时间的推移所表现出来的动态变化过程。找寻青枯病、黑胫病发生流行的主导因子。3、 人员安排：两位大学生驻点系统调查与教师定期下点调查相结合。（二）烟草青枯病和黑胫病病原致病力分化和烟草青枯病生理小种研究。1、菌种标样采集点：主要在酉阳县发病地区以及其他烟区县有代表性发病田。2、研究方法：（1） 采样：在青枯病、黑胫病发生期，分多次、多县、多点，选择有代表性的发病田，
4、采集不同类型的病害标本。冷冻保鲜条件下，无污染带回实验室。（2） 病原菌分离：在室内进行病菌的分离、纯化。获得的菌种保存在冰箱和室温条件下。（3） 菌种的致病性测定：在实验室，将分离获得的所有菌株分别接种在烟草感病品种的健康植株上，调查其发病情况，确定各个菌株的致病性。（4） 病原菌致病力分化研究：在实验室，将有致病性的菌株分别接种在不同品种的健康烟草植株上，发病后，调查病害的发病率和病情指数，根据不同菌株在不同品种上的致病反应，评价菌株的致病力。为监测重庆地区青枯病、黑胫病菌致病力的变化以及品种的选择奠定一点基础。（5） 青枯病生理小种研究：选择有代表性的20个以上菌株，接种到烟草青枯病菌生
5、理小种鉴别寄主（茄子、辣椒、马铃薯、番茄和花生等）上，根据致病程度和病情指数确定生理小种类型。将分离的青枯菌菌株分别接种到3糖3醇培养基上，根据其利用糖、醇的差异确定其生物型。初步了解重庆烟区病原菌小种的类型。为进一步研究青枯病菌在烟区的其他寄主打下基础。（三）探索青枯病的快速检测技术和方法1、血清学方法：将分离纯化并经致病性测定的青枯病菌强毒株，免疫注射雄性健康家兔，制备抗血清。以其它土壤细菌菌株为对照，纯化血清；根据免疫反应，确定其特异性。2、分子生物学方法：从GeneBank database中获得的烟草青枯病菌 (R.solanacearum)的鞭毛亚基基因fliC的序列,根据该序列合
6、成1对特异寡聚核苷酸引物：Forward 5_-GAACGCCAACGGTGCGAACT-3_ Reverse5_-GGCGGCCTTCAGGGAGGTC-3_以其它土壤细菌菌株为对照，对采集分离得到的烟草青枯病菌菌株进行特异扩增试验。在室内分别对以上两种方法进行试验研究，并对比两种方法的优缺点，初步探索快速、简便检测该病菌的技术和方法，为后续试剂盒的研制奠定基础。（四）综合防治技术研究1、 大田示范地点：在酉阳县青枯病、黑胫病发生地区选择不同发病烟田和无病田5-10亩，探索青枯病、黑胫病的综合防治措施。2、 试验示范田要求：（1） 如有可能，分别选取去年发病率为5%、10%、20%的病田作为
7、实验地；（2） 能避开山洪、大水的冲刷；（3） 不是积水地，开沟排水方便；（4）（5）（6） 待添加的隐藏文字内容2方便管理。3、 烟苗要求：漂浮育苗，无病健苗。4、 示范比较措施：（1） 头年烟叶收获后及时清除病残体的田地，与未清除病残体的田地对发病的影响；（2） 对排水不畅，易积水，湿度大的田块，起垄提埂，开好四周排水沟，增加横沟数量，防止田间积水，与传统方式开沟对发病的影响；（3） 经常检查病情，发现病株立即开展防治： 发现青枯病零星病株及时拔除，带出田集中销毁；向病窝土壤施用生石灰200克300克；全田开始药剂灌根防治3-4次。在整个生长期，发现病株带出田集中销毁。药剂待定。 发现黑胫
8、病零星病株，全田开始药剂淋根防治2-3次。药剂待定。（4）收获前，调查统计最终发病率。收获后及时清除病残体。为明年田间试验作好准备。5、 探索生物防治手段：从烟田土壤中、烟草植株内外，分离对青枯病、黑胫病具有拮抗作用的附生细菌或内生细菌，进行平板测试，筛选出有利用价值的生防菌；在实验室做初步控病测定。五、进度安排2006.3-4月：制定试验计划，安排课题组人员作好前期准备，开始预备试验工作，实验室培养试验烟草苗；到酉阳县与烟草公司人员商定试验，安排试验地及学生驻点事宜。2006.4-8月 采用定点调查与普查相结合的方式，对酉阳县青枯病、烟草黑胫病病害的危害程度、分布情况、影响因素等做较为全面的调查，基本明确青枯病、黑胫病的危害情况、发生条件和流行规律。对病原菌加以分离，鉴定重庆地区烟草青枯病、黑胫病的致病力变化，分离筛选对青枯病、黑胫病具有拮抗作用的附生细菌或内生细菌等生防菌。按计划开展大田控病试验。2006.9-12月 制备青枯病菌抗血清。以其它土壤细菌菌株为对照，纯化血清；根据免疫反应，确定其特异性，同时开展PCR检测技术研究。并进行课题的结题验收工作。
