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1、烟草青枯病,黄俊斌 教授刘海龙 黎妍妍,研究背景,烟草是一种重要的经济作物，是烟区人民脱贫致富的主要经济来源，但是烟草的病害发生严重，尤其是烟草青枯病，几乎分布于世界上所有烤烟种植区。烟草青枯病是由茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起,1864年在印度尼西亚首先报道。,该病在我国长江流域及其以南烟区普遍发生，其中以广东、福建、台湾、湖南、湖北、江西、广西东部、安徽南部、四川及贵州局部烟区为害严重，个别年份常常暴发流行，造成毁灭性损失。,一、症状,正常,萎蔫,典型症状是叶片萎蔫，部分叶片变黄，茎上出现长形黑褐色条斑，有的条斑扩展到病株顶部，根部变黑腐烂。,枯萎,茎干变
2、褐,叶肉病变,茎干变褐,研究内容,二、病原菌的分离和鉴定 1.病原菌的分离 采用稀释划线分离法。将烟草病株基部的茎杆表面用清水洗净晾干，75的酒精表面消毒，在含有无菌水的培养皿中研磨病组织。用移菌环蘸取少量菌液在TTC培养基（青枯菌选择培养基）上划线，30培养48h。,TTC平板培养48h后青枯菌菌株的菌落形态TTC培养基：NA培养基中加入三苯基四氮唑（TTC）.,烟草青枯菌分离菌株来源,2 病原菌的纯化和保存 从TTC培养基上挑取呈不规则圆形，中心淡粉红色，周围白边较宽，流动性强的单菌落进行纯化，2-3次后，用接种环挑取少量细菌于灭菌水中20保存。3 青枯菌的分子鉴定 通过常规PCR，利用青
3、枯菌种的特异性引物759760，对分离获得的菌株进行分子鉴定，根据扩增结果来确定是否为青枯菌。,引物序列：759：GTCGCCGTCAACTCACTTTCC 760：GTCGCCGTCAGCAATGCGGAATCGPCR扩增采用25L反应体系，其中10PCR buffer 2.5L，Taq酶2U，MgCl21.5mM，dNTPs200M，引物759和760各1L，DNA 5L。反应程序为：952 min；9420s，30 6830s，7230s；72延伸10min。,3.青枯菌的分子鉴定结果,扩增结果表明：所有分离获得的供试青枯菌菌株均可扩增得到280bp左右的特异性片段。,分离菌株的特异性P
4、CR鉴定结果,注：1-22、24-46分离的烟草青枯菌；23：阴性对照；M：1000bp Marker（自上而下片段大小分别为：1000bp，700bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp）,280bp,280bp,280bp,三、烟草青枯菌菌系分化研究1.青枯菌生理小种鉴定供试菌株：从湖北恩施地区烟草青枯病病株上分离的54个青 枯菌菌株。鉴别寄主：烟草、番茄、茄子、马铃薯、花生和辣椒接种方法：1mL细菌悬浮液（浓度为108cfumL），注射到5-7叶期的寄主茎基部。培养条件：温度30，相对湿度80%以上。小种划分：接种7天后，调查接种植株的抗感反应，根据Budenha
5、gen、华静月等人制定的生理小种划分标准，确定菌株的生理小种归属。,烟草青枯菌接种生理小种鉴别寄主,鉴定结果表明：54个烟草青枯菌菌株接种6种鉴别寄主均能使其致病，发病率均为100%，侵染的植物种类范围符合生理小种1号的侵染范围，因此可将供试菌株划分为生理小种1号。,2.烟草青枯菌生化型测定 根据菌株对3种双糖（乳糖、麦芽糖、纤维二糖）和3种己醇（甘露醇、山梨醇和甜醇）的利用程度，将菌株划分为不同的生化型。,注：“+”代表能利用（培养基变黄），“”代表不能利用（蓝色）,青枯菌生化型划分标准,根据何礼远、华静月等提出的青枯菌5型划分标准，对分离菌株进行生化型划分，标准如下：,生化型测定结果表明：
6、54个烟草青枯菌菌株均能利用3种双糖和3种己醇，根据青枯菌生化型划分标准鉴定均为生化型。,甜醇,山梨醇,甘露醇,纤维二糖,乳糖,麦芽糖,菌株对3种己醇和3种双糖的利用（左为CK，右为接菌）,3.烟草青枯菌演化型鉴定 参照Fegan和Prior的方法，用7条引物扩增青枯菌株DNA，根据扩增的片段大小确定供试菌株的演化型。,DNA提取：用TaKaRa试剂盒提取菌株的DNA。PCR扩增采用25L反应体系，其中包括：10PCR buffer 2.5L，Taq酶2U，MgCl21.5mM，dNTPs 200M，引物759和760各4pmol，引物Nmult21:1F，Nmult21:2F，Nmult23
7、:AF，Nmult22:InF，Nmult22:RR各6pmol，DNA模板50ng。,反应程序为：965 min；9415s，30 5930s，7230s；72延伸10min。取5LPCR产物于2%的琼脂糖凝胶中电泳，电压5Vcm，通过Biorad凝胶成像仪观察结果。,反应程序为：965 min；9415s，30 5930s，7230s；72延伸10min。取5LPCR产物于2%的琼脂糖凝胶中电泳，电压5Vcm，通过Biorad凝胶成像仪观察结果。,280bp,144bp,四、青枯菌的寄主范围,青枯菌的寄主范围非常广泛，可侵染包括54个科的450余种植物，如烟草、番茄、茄子、辣椒、花生、马铃
8、薯、桑树、油橄榄、甘薯等。,五、烟草青枯病田间发生动态研究调查地点：湖北恩施州宣恩县和咸丰县烟田调查时间：2013年6-8月调查方法：采用双行平行跳跃法定点定株调查调查内容：发病时期，发病率，气候条件等。,按照国家标准(GB/T23222-2008)，以株为单位分级调查，分级标准如下：0级：全株无病；1级：茎部偶有褪绿斑；3级：茎部有黑色条斑，但不超过茎高1/2；5级：茎基部黑色条斑超过茎高1/2，但未到达茎顶部；7级：茎部黑色条斑到达茎顶部，或病株叶片全部萎；9级：病株基本枯死。,2013年咸丰点烟草青枯病发生情况,始发期6月20日，发病率为3.33%，病情指数为0.37，随着日平均气温达到
9、25，7月中旬进入盛发期，8月底发病率达到90%以上，病情指数达37以上。,2013年宣恩点烟草青枯病发生情况,始发期为6月8日，发病率为2.86%，病情指数为0.22，随着日平均气温达到26，6月下旬烟草青枯病进入盛发期，8月中旬发病率达到93%以上，病情指数达到40以上。,两个地区烟草青枯病始发期都在6月中旬，随着时间的延长，发病率和病情指数逐渐升高，7月下旬进入盛发期，8月中旬进入稳定期。,六、烟草青枯病防治,1、筛选和利用抗病品种 参试共计46个烟草品种 苗期温室鉴定：伤根灌菌接种法，接种条件：温度28-30，RH80%。接种后定期（接种后第5d、7 d、10 d、15d、21d）调查
10、发病情况。大田病圃鉴定：烟株旺长初期，用小铁铲从烟株茎基部斜插人土使侧根受伤，随后浇灌菌液。每隔10 d 调查1 次发病情况。接种浓度：1108 CFU/mL。,参试烟草品种,青枯病严重度分级标准(GB/T 23222-2008),烟草品种抗病性鉴定标准(GB/T 23224-2008),苗期鉴定结果,苗期鉴定结果：华农温室,以抗病品种（Coker176、毕纳1号、D101）为砧木，云烟87（感病品种）为接穗品种采用靠接法进行了嫁接。,2、嫁接防病,团棵期嫁接烟株表现,打顶期嫁接烟株表现,可调节角度的嫁接刀，专利号：ZL 2013 2 0354249.3,打顶期调查嫁接云烟87植株的青枯病发病率为10.87%18.42%，未嫁接的植株发病率为78.95%，其中尤以D101为砧木的嫁接云烟87植株抗病效果最好。,嫁接烟株防病效果,3、生物防治（1）植物源农药：大蒜素等。（2）生防菌：荧光假单胞菌，枯草芽孢杆菌等。4、化学防治 农用链霉素，硫酸链霉素，青枯立克等。,
