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1、基因工程原理及实验技术,基因工程原理及实验技术基因工程原理及实验技术基因工程原理及实验技术 Principles And Experimental Technics in Gene Engineering 教材和参考书教材：简明基因工程与应用吴建平 主编，2005，科学出版社主要参考书：1.基因工程 张惠展 编著,华东理工大学出版社,2005 2.基因工程 孙明 主编,高等教育出版社,2006 3.基因工程原理 吴乃虎 编著，科学出版社,(第二版),1998 4.基因工程 彭银祥,主编,2007 5.基因工程技术 钟卫鸿主编,化学工业出版社,2007,基础教育课程改革是一场空前的教育革命，贯彻
2、新理念，执行新课标，给当前小学语文教学注入了前所未有的生机。课程目标和内容的改革，教学观念和学校方式的变革激发了学生极大地学习积极性和创造性，当前小学语文教学也因此而出现了一些新的动向与问题。由于城乡地区的差异，语文课程的内容的学习与教学目标的达标，也给农村小学生的学校增加了一些困难。如何提高学生的语文素养和提高思想道德素养，发展学生的语文能力。利用农村现有的教学资源，克服城乡差异，寻找农村小学语文教学的突破口，是农村小学语文教师迫切需要解决的问题。我认为就应该从差异入手，寻找突破口。城乡差异主要体现在文化差异，生活差异和地方差异上。在语文教学中，充分利用这些差异，挖掘农村小学的教学资源。扬长
3、避短，优势互补，搞好农村小学语文课堂教学，完成教学任务，对学生进行语文能力的培养，提高人文素质教育，人文理想教育。一、文化差异中的契机 农村因为地理条件的原因，交通不便，文化、商业不发达，消息比较闭塞，孩子们接触新事物的机会很少。唯一能给孩子们传递信息的只有电视机和学校的课本。孩子们没有逛书店的习惯。因为我们这里已经安上了有线电视，于是我抓住这个契机，教育孩子要有选择的看电视，每个晚上看三十分钟到一个小时的电视，电视剧除外，喜欢看什么就看什么。并推荐一些比较好的节目，如七巧板动物世界动画城异想天开新闻联播等节目。利用早上晨会时间讲一讲自己的收获，这样不但增长见识，培养好奇心，而且还提高了学生的
4、语言表达能力。在讲北京一课时，我很早就让学生从电视上了解关于北京的一些情况，果然同学们有意收看中央电视台的节目，电视上关于北京的一些画面，同学们的印象非常深刻，这样课文学起来就非常容易。有的同学竟津津有味地讲起天安门广场上升国旗的情景，这就是意外的收获。毕竟同学们没去过什么大的城市，文章中的立交桥，广场，对他们就比较陌生，通过课前的准备，就不一样了，同学们在电视上见过，再加上文中的介绍，理解起来就很容易了。另外，我有意加学生的阅读量，没有条件创造条件，我通过各种渠道收集图书，选择一些学生能够阅读的书籍，鼓励学生把家里的书带到学校和同学分享，同学们互相传阅。有时一本书要全班同学轮流看，谁想这样却
5、提高了学生的阅读兴趣，有时要两个人同看一本书。这样阅读量增加了，学生的阅读能力提高了，语文阅读水平也提高了，遇到难题，同学们也知道上哪儿去寻找答案了。随着农村生活水平的提高，有的同学家中也安上了电脑。针对这部分同学，我加大难度，鼓励他们在网上收集资料并和同学分享。在班级建立qq群，欢迎同学加入，有机会教同学如何提用电脑进行学习交流，还可以发布班级的消息，这样做不但激发学生学习的积极性，还促进了师生感情。二、生活差异的契机 城里的孩子吃洋快餐，而农村的孩子有许多连麦当劳，肯德基是什么都不知道，更别提什么游乐园、商业城。城里的孩子可以接触各种现代化设备，去各种特长班，而农村的孩子，整天上山下河，掏
6、鸟窝等与泥土为伴，既是差异也是有优势，语文教育的“生活化”是指语文教师在传授知识和引导进行语文能力训练的过程中，自然的注入生活内容，进行生活教育。在教学两只鸟蛋这一节课，我就利用了这个优势，农村孩子经常见到鸟蛋，农村妇女又有用鸡蛋孵小鸡的习惯，这样理解这篇文章，就不算什么难事了。雪地里的小画家一课，也是篇充满农村生活情趣的文章，引导学生课前注意观察鸡鸭狗马的脚印，这样学生很快就记住这篇文章的内容，达到事半功倍的效果。只要有农村生活的文章，我都鼓励学生自己去观察，这样不但增加学生的学习兴趣，还提高了学生的观察能力，使学生感受到生活的情趣，和家乡的美。三、地方差异的契机 农村的孩子大多和爷爷奶奶，
7、爸爸妈妈生活在一起，亲情的氛围很浓，所以农村的孩子比较淳朴懂事。因为他们的亲属大多没有念过几天书，使用的方言、口语比较多，所以孩子的语言也不规范。往往在课上已经纠正过来，可是放学回家以后，又变成土语了。语言比较单调枯燥，也不会说什么“漂亮话”，于是我采取了朗读加死机硬背的方式，朗读可以有意识的改变方言习惯，朗读书面语言再生成为口头语言，使语气因素得到表达。汉子是一种表意文字，是音形义的综合体，对他的掌握，主要是靠理解，接收，体验，有得甚至是靠背诵，机械记忆，在理解、接收、记忆、体验的基础上，通过大量的语文实践，从模仿到认同，形成“类”的经验，最后，内化为一种语文能力。儿童的大脑就像一台计算机，
8、如果没有较大的内存和数据库，没有大量的信息储存，必将影响和制约将来处理问题的能力，等将来处理问题的时候，再临时进行信息储存，会由于内存空间的不足，而无法再储存，因为内存空间的大小取决于儿童早期的识记的扩容，而成大脑空间的扩容，取决于儿童早期机械识记潜能的开发和挖掘，所以我平常就注重学生语言的积累，每学完一篇文章，我就让学生把各种佳句背诵下来，长此以往，大量的语言素材积累在脑中，就像小牛反刍一样，进而内化运用，家长经常对我说，我家的孩子现在会咬文嚼字了，我想这就是死记硬背的结果吧。四、其他可利用的资源（下转第102页）农村幼儿教师在我国幼儿教群体中占据着很大的比例，她们的专业发展意识直接决定了他
9、们工作动力。为了了解农村幼儿教师的专业态度状况，笔者进行了研究。本研究选取腾冲县选取腾越镇、猴桥镇、中和乡、界头乡、曲石乡、芒棒乡、蒲川乡等七个乡镇，40所幼教机构（包括幼儿园及学前班），共120名农村幼儿教师为研究样本。7个乡镇的选取基本上考虑了个乡镇经济发展水平的好、中、差三个等级，以及以县城区为中心在方位上的辐射。主要采用问卷调查法，问卷的编制包括了农村幼儿教师的基本情况：如性别、学历、专业等。问卷发放120份，回收120份，回收率10。一、腾冲县农村幼儿教师专业发展目标 美国教育家布卢姆曾说过：“有效的学习始于知道希望达到的目标是什么。”对该县农村幼儿教师进行调查统计得出，61.7%的
10、教师制定了自己的发展目标，并且正在按计划实现着自己的目标。在和她们的交谈中得知，有的教师还是很明白自己工作的意义，也很明确给自己制定了发展目标。“现在很多家长都很重视娃娃的教育了，对我们老师的要求也越来越高。刚开始幼师毕业的时候还觉得所学的东西带小娃娃已经足够了。可是现在才发觉知识越来越不够用，要成为合格的教师该学习的东西还多着呢，我也给自己制定了明确的计划。”（某老师，幼师毕业）有36.7%的教师表示曾经有想过发展目标，但是目前没有明确的目标；还有1.7%的教师表示从没有想过要制定什么目标，过一天算一天。“像我们这种初高中毕业的老师，带娃娃还是有些吃力的，特别是唱歌、弹琴、舞蹈等方面。一直以
11、来都想着去学习一下，可是工作忙很辛苦，也没有多余的钱，一直没有做，也不知道什么时候可以去学。”“没有什么目标了，反正也干不久，干一天看一天吧！”虽然在该县61.7%的农村幼儿教师都表示自己给自己制定了发展目标，并且也正在按照计划实现自己的目标。但是和她们的交流中，笔者发现虽然她们对自己的专业发展有一定的规划，但大多数教师对发展目标的的思考只是粗线条的，只算得上是个概括的打算，没有十分明确具体的目标，更没有确定的对实现目标的明确的方法与途径的规划。还有的教师的目标也只是针对比较具体的一些事件，没有比较长远的打算。比如打算今天要学会某样东西。可是问她们为什么要学习，学习以后有什么用？她们都回答不上
12、来。二、腾冲县农村幼儿教师专业反思现状 美国著名学者波斯纳说这样一句话：没有反思的经验是狭窄的经验，只有经过反思，经验方能上升到一定的理论高度，并对后继教学行为产生影响。调查显示，在该县有71.7%的农村幼儿教师经常对自己的教学和工作进行反思，有25%的农村幼儿教师有时进行反思，有3.3%的农村幼儿教师偶尔反思。由此可见，在该县所有农村幼儿教师都对自己的教学工作和现状进行反思，只是所反思的方式和程度有所不同而已。在访谈中问：“您有无反思过自己的教学？如何反思？有没有写反思日记？”“反思呀，有啊，我每天晚上睡觉之前都会想想今天都做了哪些工作？哪些做的好？哪些做的不好？反思日记没有写了，有时候想着
13、想着就睡着了，第二天又忘记了，又开始忙碌工作了。”“工作太忙，下班回家又很多事情要忙，几乎没有时间思考了，所以很少反思。除非哪天有什么特殊情况发生，会想想反思哪些没有做好”虽然在该县的极大部分农村幼儿教师都进行教学反思，但是大部分都只是“随便想一想”，对于“如何进行教学反思，反思以后该如何做”，这些问题她们似乎都没有认真考虑过。她们一般只有在遇到问题时，她们才会进行反思，想一想问题出在哪里，该如何解决这些问题。但是当找到解决问题的方法，问题得到解决以后，她们就会把这些问题忘得干干净净。如果下一次再遇到类似的问题时，他们仍然还会重复前面的工作。因为，她们的反思大部分都是在头脑中进行，而从来不会把
14、反思写下来，以书面的形式记录下来。可见，她们的教学反思对于教学工作没有起到该有的作用，对于提高教学校效果没有多大帮助。三、腾冲县农村幼儿教师专业发展意愿 当问及该县的农村幼儿教师们：“是否愿意进一步提高自己的水平？”绝大部分的教师明确表示很愿意提高自己的水平。对参与问卷调查的教师们的数据进行统计得出：有55%的教师非常愿意提高自己的水平，有43.3%的教师愿意提高自己的水平，仅有1.7%的教师不太清楚是否愿意提高自己的水平。从数据上来看，该县的农村幼儿教师们的专业发展愿意还是十分强烈的。“非常愿意提高自己的水平，也很希望有更多的机会去学习提高，自己也在假期的时候自己去学习些东西。但是由于时间和
15、资金的安排，能学习的机会是很少的，所以很希望领导和教育部门能多安排点学习提高的机会。”“有机会学习提高当然愿意了，可是工作那么忙，每天从早到晚都安排的满满的，也没有时间出去学习点什么，下了班累死了，周末或者放假的时候也只想好好休息或者做做家里面的活，所以没有过多的时间。再说去学习啥的不都得花钱，工资本来就低，也没有多余的钱去学习了。如果学校安排时间和一切开销去学习倒是也挺愿意去学习的。”光从问卷的统计结果来看，该县的农村幼儿教师们都愿意进一步提高自己的水平，可是由于时间安排和资金不足等问题，她们能出去学习的机会很少。教育部门很少组织教师们出去学习培训，即使有少数的培训组织，也不是所有教师都能去
16、，可以说极大多数的教师们都没有机会去。教育部门组织的培训也都是一些政治理论方面的学习，对教师的专业发展没有多大实质性的帮助。在和教师们的深入交谈中，笔者发现，虽然该县农村幼儿教师们都愿意提高她们的水平，但是在问到她们都希望在哪方面得到提高，都希望有些什么方面的学习时，除了少数比较有职业规划的教师们有着明确的学习期待，极大部分的教师们都具体回答不上来她们希望在哪方面得到提高，只是说能提高肯定是好的，只要能有学习的机会肯定比没得学习好。从以上的分析可以看出该县农村幼儿教师们的专业发展意识状况：从数据统计结果来看她们的专业发展意识都比较强，但是深入探究，该县农村幼儿教师们的专业发展意识有着很大的局限
17、性，这个局限主要是受她们的自身内部因素的影响，和她们的学历、专业、认识有着很大的关系。,基因工程原理及实验技术 Principles And Experimental Technics in Gene Engineering,广义基因工程,广义的基因工程：是指DNA重组技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是外源基因重组、克隆、表达的设计与构建(即狭义的基因工程)；下游技术则涉及含有重组外源基因的生物细胞(基因工程菌或细胞)的大规模培养以及外源基因的表达、产物的分离、纯化过程。因此，广义的基因工程概念更倾向于工程学的范畴。,广义的基因工程是一个高度统一的整体。
18、上游DNA重组的设计必须以简化下游操作工艺和装备为指导思想。而下游过程则是上游基因重组蓝图的体现与保证。这是基因工程产业化的基本原则。,狭义的基因工程 重组DNA技术 广义的基因工程 重组DNA技术 细胞工程 染色体工程 细胞器工程,二、基因工程的基本过程,基因工程:两大部分组成 基因工程的整个过程由工程菌(细胞)的设计构建和基因产物的生产两大部分组成 工程菌(细胞)的设计构建:实验室里进行，其单元操作过程如下:(1)从供体细胞中分离出基因组DNA，用限制性核酸内切酶分别将外源 DNA(包括外源基因或目的基因)和载体分子切开(简称“切”)；,(2)用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段接到载
19、体分子上形成DNA重组分子(简称“接”)；(3)借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中(简称“转”)；(4)短时间培养转化细胞、以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中(简称“增”)；(5)筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞(简称“检”)；基因工程的上游操作过程；可简化为：切、接、转、增、检。,三基因工程的基本原理,基因工程的主体战略思想是外源基因的稳定高效表达为目的其基本原理可从以下四个方面考虑。（1)利用载体DNA在受体细胞中独立于染色体DNA而自主复制的特性，将外源基因与载体分子重组，通过载体分子的扩增提高外源基因在受体细胞中的剂量借此提
20、高其宏观表达水平。这里涉及到DNA分子高拷贝复制以及稳定遗传的分子遗传学原理。,(2)筛选、修饰和重组启动子、增强子、操作子、终止子等基因的转录调控元件，并将这些元件与外源基因精细拼接通过强化外源基因的转录提高其表达水平。(3)选择、修饰和重组核糖体结合位点及密码子等mRNA的翻译调控元件。强化受体细胞中蛋白质的生物合成过程。上述(2)和(3)两点均涉及到基因表达调控的分子生物学原理。,(4)基因工程菌(细胞)是现代生物工程中的微型生物反应器，在强化并维持其最佳生产效能的基础上，从工程菌(细胞)大规模培养的工程和工艺角度切入，合理控制微型生物反应器的增殖速度和最终数量，也是提高外源基因表达产物
21、产量的主要环节，这里涉及的是生物化学工程的基本理论体系。因此分子遗传学、分子生物学以及生物化学是基因工程原理的三大基石。,.四、生物工程等概念,生物工程：直接或间接利用生物体的机能生产物质的技术。包括发酵技术、基因重组、细胞融合、细胞大量培养、生物反应器等技术。生物技术：是在细胞水平上，特别是在分子水平上对生物体遗传性实现巨大的接近定向改造的一套内容繁多和复杂的技术。包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程等。,现代科技革命,高新技术,生物技术,基因工程,基因克隆,第二节 基因工程的发展历史,基因工程的发展历史概括为三个阶段 基因工程的诞生 基因工程的成熟 基因工程的腾飞,一、基因工程的诞生,
22、基因工程是一项新兴的工程技术，它的诞生需要理论和技术上的支持 理论上的三大发现技术上的三大发明,证明了生物的遗传物质是DNA（基因工程的先导）DNA的双螺旋结构和半保留复制机理遗传信息的传递方式（中心法则）,1.理论上的三大发现,证明了生物的遗传物质是DNA（基因工程的先导）：1944年首先用体外的转化实验证明基因的化学本质就是DNA分子的是加拿大生物化学家艾弗里 O.T.Avery（1877-1955）。他和他的合作者CMMacLeod及MMcCarty在纽约进行细菌转化的研究。,1)遗传物质是DNA,体外的转化实验证明基因就是DNA分子,2).DNA的双螺旋结构和半保留复制机理,DNA双螺
23、旋结构的发现Watson（沃森）and Crick（克里克）（1953）美国遗传学家Watson(J.Watson)和英国生物学家克里克(F.Crick)1953年4月25日DNA的双螺旋结构假说（不到1000字的短文）核酸的分子结构脱氧核糖核酸的一个结构模型在（自然）杂志上发表。1个月后在（自然）杂志上又发表了遗传物质的复制机理。1962年与M.H.F.Wilkins 共获诺贝尔生理学奖。DNA半保留复制机理的证明Meselson-Stahl实验(1958)DNA复制模式的破解M.Meselson(Matthew Meselson,西尔逊)and F.W.Stahl(Franklin Sta
24、hl,斯塔尔)(1958)1958年来西尔逊（Meselson）和斯塔尔（Stahl）首次在分子水平上成功地证明了DNA的半保守复制（semiconservative replication）利用氮标记技术在大肠杆菌中首次证实了DNA的半保留复制(15N),DNA半保留复制图,3）遗传信息的传递方式（中心法则）,中心法则的确立F.Crick(1958),中心法则的确立F.Crick(1958),中心法则的确立F.Crick(1958）,1958年克里克确立的中心法则(1971年修改),最早提出遗传密码这一名词的是量子力学奠基人之一，奥地利物理学家施勒丁格(ESchrodinger，1944)。
25、第一个提出遗传密码具体设想的是美国物理学家G.Gamov，他通过推算提出了三联体密码子的概念，并且进一步推论一种氨基酸可能不止有一个密码子。第一个用实验破译密码子的是马太(Matthaei)和尼伦伯格(Nirenberg)，1966 M.Nirenberg and H.Khorana（1968年诺贝尔生理医学奖获得者）建立了完整的遗传密码表,DNA技术分子体外切割与连接技术 限制性内切酶(1970)和DNA连接酶(1967)发现，标志着DNA重组时代的开始基因工程载体技术 1970载体（vector）的使用成功1970年，逆转录酶的发现 使真核基因的制备成为可能。,2 技术上的三大发明,DNA
26、技术分子体外切割与连接技术 限制性内切酶和DNA连接酶的发现,限制性核酸内切酶Hind 1970年，美国生化學家 Simith 和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离提纯了限制性核酸内切酶 Hind（1978年诺贝尔生理医学奖获得者)EcoR 1限制性核酸内切酶(1972年Bover实验室 发现）GAATTC DNA连接酶的发现：1967年世界上5个实验室几乎同时发现了DNA连接酶。1970年，在美国Khorana实验室发现了一种高效连接活性的DNA连接酶T4 DNA连接酶,1970美国Dullecco Temin 和Baltimore（1975年诺贝尔生理医学奖获得者）在肿瘤病毒中存在反转录酶打
27、破了中心法则，使真核基因的制备成为可能。DNA分子序列分析及相关技术的发展也推动了基因工程的发展 DNA分子的核苷酸序列分析技术，琼脂糖凝胶电泳和Southern杂交技术等技术的展。,基因工程载体技术,1970载体（vector）的使用成功.1970年噬菌体导入大肠杆菌细胞内（转化）,1970年，逆转录的发现.,1973年，美国斯坦福大学Boyer 和Cohen等获得了抗四环素和抗新霉素（卡那霉素）的重组菌落，标志着基因工程的诞生。1973年建立的基因工程的基本模式为标志的。他们将大肠杆菌体内的两个不同的质粒提取出来，拼接成一个杂合的质粒。当杂合质粒被导入大肠杆菌后，它能在大肠杆菌内复制并表达
28、双亲质粒的遗传信息。这是基因工程的第一个成功的克隆转化实验。,Tetracycline pSC101,EcoR I,DNA Ligase,Kanamycin R6-5,Kanr and Tetr,基因工程的诞生标志,基因工程的成熟,1977年日本的Itakura及其同事首次在大肠杆菌中克隆并表达了人的生长激素释放抑制素基因。几个月后美国的Ullvich克隆并表达了人的胰岛素基因。1978年，美国Genentech公司开发出利用重组大肠杆菌合成人胰岛素的先进生产工艺，从而揭开了基因工程产业化的序幕。,表1-1 主要基因工程产品的研制、开发、上市时间,三、基因工程的腾飞：,1.1982年，美国人，
29、大鼠生长激素基因转入小鼠；2.1983年，美国人，Ti质粒导入植物细胞（细菌 Neor基因）3.1990年，美国人，腺苷脱氨酶（ADA）基因治疗，重度联合免疫缺陷症（SDID）4.1990年，美国倡导，人类基因组计划，15年时间30亿USD；2000年6月26日各国科学家向全世界宣布“人类基因组计划”工作草图绘制成功，“基因”和“基因组研究”更是成为人们谈论的焦点问题。2003 人类基因组侧序完成。5.1997年，英国，克隆多利绵羊,三、基因工程的腾飞：,四.基因工程的意义,基因工程可以绕过远缘有性杂交的困难，使基因在微生物、植物、动物之间交流，迅速并定向的获得人类需要的新的生物类型概括地讲，
30、其意义体现在以下三个方面 大规模生产生物分子；设计构建新物种；搜集、分离、鉴定生物信息资源,导致第四次工业大革命,1980年11月15日，美国纽约证券交易所开盘的20分钟内，Genentech公司的新上市股要从3.5USD上至89USD，胰岛素基因表达 1.医学：抗病毒、抗癌因子、新型抗生素、疫苗、抗衰老保健品、心脏血管药物、生长因子诊断剂 2.轻工食品：氨基酸、助鲜剂、甜味剂、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶蛋白酶、生物拆分混旋体 3.能源：石油二次开采、纤维素分解、太阳能转换 4.环保：微生物生态种群 5.信息：蛋白芯片、基因芯片 日本政府称基因工程为战略工业,第二次农业大革命,1.蛋白类杀虫剂（
31、生物农药）、抗广谱虫害植物；2.农作物品种改良；高营养、长保存、抗环境压力、花卉颜色与型状；3.畜牧业；高蛋白乳汁、鱼生长激素、饲料利用率4.固氮,第四次医学大革命,1.分子病：（文明病富贵病）基因治疗，遗传病、心脑血管病、糖尿病、癌症、过度肥胖综合症、老年痴呆症、骨质疏松症 2.抗衰老：端粒酶编码基因基因疗法补充突变基因原始产物、更换突变基因,五、基因工程的应用,工业轻工业能源工业,医药重组药物基因治疗检测遗传疾病、病原,农业,抗病虫提高品质提高花卉的观赏价值抗逆性家畜瘦肉比饲料利用率加快生长,45,26、要使整个人生都过得舒适、愉快，这是不可能的，因为人类必须具备一种能应付逆境的态度。卢梭27、只有把抱怨环境的心情，化为上进的力量，才是成功的保证。罗曼罗兰28、知之者不如好之者，好之者不如乐之者。孔子29、勇猛、大胆和坚定的决心能够抵得上武器的精良。达芬奇30、意志是一个强壮的盲人，倚靠在明眼的跛子肩上。叔本华,谢谢！,
