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1、C 基因工程的理论基础,1 基因工程的基本概念,B 基因工程的基本形式,A 基本定义,第十章 基 因 工 程 导 论,A 基本定义,1 基因工程的基本概念,基因工程是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。因此，供体、受体、载体是基因工程的三大基本元件。,1 基因工程的基本概念,广义的基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌
2、或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。,基因工程(gene engineering)常和以下名称混用:遗传工程(genetic engineering);基因克隆(gene cloning);分子克隆(molecular cloning);基因操作(gene manipulation);重组DNA技术(recombination DNA technique)克隆(clone):作名词时指含有某目的DNA片段的重组DNA分子或含有该重组分子的无性繁殖系.作动词时是指基因的分离与重组过程。,基因工程的操作过程,转化子的筛选和鉴定（检）,重组DNA分子的转化和扩增（转、增）,DNA的体外重组
3、（切、接）,基因工程的操作过程,切,接,转,增,检,B 基因工程的基本形式,1 基因工程的基本概念,第一代基因工程 蛋白多肽基因的高效表达 经典基因工程,第二代基因工程 蛋白编码基因的定向诱变 蛋白质工程,第三代基因工程 代谢信息途径的修饰重构 途径工程,第四代基因工程 基因组或染色体的转移 基因组工程,C 重组DNA技术的理论基础,19世纪中 孟德尔 豌豆杂交试验 遗传因子 经典遗传学,20世纪初 摩尔根 果蝇杂交实验 基因 基因学,1944年 艾弗瑞 肺炎双球菌转化实验 遗传物质DNA,1973年 伯格-杰克森-考恩-鲍耶 DNA分子体外拼接,分子遗传学,1953年 沃森-克瑞克 DNA双
4、螺旋结构 分子生物学,基因工程,2 基因工程的基本条件,C 用于基因转移的受体菌或细胞,B 用于基因克隆的载体,A 用于核酸操作的工具酶,A 用于核酸操作的工具酶,2 基因工程的基本条件,限制性核酸内切酶,DNA连接酶,DNA聚合酶,核酸酶,核酸修饰酶,限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶的发现及其生物功能,识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链,主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵,细菌的限制与修饰作用,hsd R：编码限制性核酸内切酶,hsd M：编码限制性甲基化酶,hsd S：编码限制性酶和甲基化酶的协同表达,1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出
5、,Hind II和Hind III,限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶的类型,主要特性 I 型 II 型 III 型,蛋白结构,异源三聚体,同源二聚体,异源二聚体,切割位点,距识别序列1kb处,识别序列内或附近,距识别序列下游,随机性切割,特异性切割,24-26bp处,限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶的命名,属名 种名 株名,H i n d III H i n d III,Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株,同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶,II 型限制性核酸内切酶的基本特性,识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列,大部分酶的切
6、割位点在识别序列内部或两侧,识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构,5 G C T G A A T T C G A G 3,3 C G A C T T A A G C T C 5,EcoR I的识别序列,EcoR I的切割位点,EcoRI等产生的5粘性末端,EcoRI 37,退火 4-7,5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5,OH,P,OH,P,PstI等产生的3粘性末端,5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5,PstI 37,5 G-C-T-C-T
7、-G-C-A-OH P-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5,退火 4-7,5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3,3 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5,OH,P,OH,P,PvuII等产生的平头末端,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5,PvuII 37,DNA连接酶,DNA连接酶的基本性质,修复双链DNA上切口处的磷酸二酯键,DNA连接酶,5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3,3 C-G-A-G A-C-G-T-C-C
8、-T-C 5,OH,P,OH,P,5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5,nick,nick,DNA连接酶,DNA连接酶的基本性质,修复与RNA链结合的DNA链上切口处的磷酸二酯键,T4-DNA连接酶,5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C 5,OH,P,nick,5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C 5,ds-DNA结构:切口,缺口,断口,DNA连接酶,DNA连接酶的基本性质,连接多个
9、平头双链DNA分子：,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5,T4-DNA连接酶,载体的功能及特征,载体的功能,运送外源基因高效转入受体细胞,为外源基因提供复制能力或整合能力,为外源基因的扩增或表达提供必要的条件,载体的功能及特征,载体应具备的条件,具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）,具有合适的筛选标记,具有较高的外源DNA的载装能力,具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点,具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点,质粒,质粒的基本特征,质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并,被稳定遗传的一类
10、核酸分子,质粒常见于原核细菌和真菌中,绝大多数的质粒是DNA型的,绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，,即cccDNA,质粒DNA的分子量范围：1-300 kb,质粒,质粒的构建,天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。,目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：,pSC101 8.8 kb 拷贝数 5 四环素抗性标记基因 Tcr,ColE1 6.5 kb 拷贝数 20-30 大肠杆菌内毒素标记基因 E1,RSF2124 ColE1衍生质粒
11、氨苄青霉素抗性标记基因 Apr,质粒,重要的大肠杆菌质粒载体,松弛型复制,pBR322：,氯霉素可扩增,拷贝数 50-100/cell,用于基因克隆,质粒,重要的大肠杆菌质粒载体,pUC18/19：,拷贝数 2000-3000/cell,用于基因克隆和测序,装有多克隆位点（MCS）,正选择颜色标记 lacZ,质粒,重要的大肠杆菌质粒载体,pUC18/19：正选择标记 lacZ 的显色原理,pUC18/19,Plac,lacZ,MCS,b-半乳糖苷酶的a-肽段,a,b,5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷,X-gal,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l 噬菌体的生物学特
12、性：生物结构,l 噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体,l 噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成,l-DNA全长48502个核苷酸,l-DNA上至少有61个基因,l 噬菌体生物学特性：生物结构,5 TCCAGCGGCGGGG,3,3,CCCGCCGCTGGA 5,COS,COS,cos,头部合成基因,尾部合成基因,溶菌控制基因,晚期控制基因,DNA合成控制基因,阻遏基因,早期控制基因,阻遏基因,重组基因,删除与整合基因,l-DNA,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l 噬菌体生物学特性：感染周期,体内包装,100个左右的拷贝,包装范围为原DNA的75-105%,即 36-51 kb,
13、D,A,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建：缩短长度,野生型l-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型l-DNA的长度，可以提高装载量。其实野生型l-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将l-DNA分成两大类载体：,插入型载体,取代型载体,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建：缩短长度 插入型载体,体外包装,插入位点,体外包装,插入片段,载体长度 37 kb,插入片段大小：,0-14
14、 kb,（51 37）,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建：缩短长度 取代型载体,体外包装,体外包装,插入片段,最小装载长度 10 kb,（51 26）,载体长度 26 kb,插入片段,最大装载长度 25 kb,（36 26）,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA重组分子的体外包装：,l-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞用于体外包装的蛋白质可直接从感染了l噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：一部分缺少E组份，另一部分则缺少D组份。包装时，当且仅当这两部
15、分包装蛋白与重组l-DNA分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组l-DNA污染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的,考斯质粒,考斯质粒（cosmid）,考斯质粒载体的构建：,考斯质粒是一类人工构建的含有,1978年Collins和Hohn发明构建,pHC79,6400 bp,Tcr,l fragment,cos,ori,Apr,PstI,BamHI,SalI,l-DNA cos序列和质粒复制子的,特殊类型的载体,cos site-carrying plasmid,1.8 kb的l-DNA片段+pBR322片段,装载范围为31-45 kb,考斯质粒,考斯
16、质粒（cosmid）,考斯质粒载体的特点：,能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞,装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围,能像质粒那样在受体细胞中自主复制,重组操作简便，筛选容易,不能体内包装，不裂解受体细胞,人造染色体载体,人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百,甚至上千 kb 的DNA片段，此时考斯质粒的装载量也远远不能满足需要。,将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳,定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外,源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，,它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。,目前
17、常用的人造染色体载体包括：,细菌人造染色体（BAC）,酵母人造染色体（YAC）,人造染色体载体,酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YAC）,YAC载体应含有下列元件：,酵母染色体的端粒序列,酵母人造染色体的构建：,pYAC4,CEN4,EcoRI,URA3,TEL,BamHI,TEL,ori,Apr,TRP1,ARS1,酵母染色体的复制子,酵母染色体的中心粒序列,酵母系统的选择标记,大肠杆菌的复制子,大肠杆菌的选择标记,YAC载体的装载量为350-400 kb,人造染色体载体,酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YA
18、C）,酵母人造染色体的使用：,EcoRI,EcoRI,EcoRI,BamHI,连接,转化酵母菌,重组酵母染色体,C 用于基因转移的受体菌或细胞,3 基因工程的基本条件,各种基因工程受体的特性,实验室常用的基因工程受体,受体细胞应具备的条件,受体细胞应具备的条件,限制性缺陷型,外切酶和内切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-）,重组整合缺陷型,用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-）,具有较高的转化效率,具有与载体选择标记互补的表型,感染寄生缺陷型,防止重组细菌扩散污染，生物武器除外,实验室常用的基因工程受体,大肠杆菌,用于接受质粒：C600、W3110、HB101、JM83、J
19、M101（Aps、Tcs、Cms）用于接受l-DNA：LE392、ED8654,酵母菌,哺乳动物细胞 CHO,毕赤酵母,啤酒酵母,3 基因工程的操作过程,C 转化子的筛选和鉴定（检）,B 重组DNA分子的转化和扩增（转、增）,A DNA的体外重组（切、接）,3 基因工程的操作过程,切,接,转,增,检,A DNA的体外重组（切与接）,3 基因工程的操作过程,同种内切酶生产的粘性末端的连接,同尾酶生产的粘性末端的连接,不同粘性末端的连接,粘性末端的更换,人工粘性末端的连接,重组率,同种内切酶生产的粘性末端的连接,5,5,EcoRI,退火,G,CTTAA,AATTC,G,G,CTTAA,AATTC,
20、G,T4-DNA ligase,5,5,5,5,B 重组DNA分子的转化和扩增（转与增）,3 基因工程的操作过程,转化的原理与技术,转化率,转化细胞的扩增,转化的原理与技术,Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化,Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态,转化的原理与技术,电穿孔转化,将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便
21、可进入细胞内 电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大 同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验,C 转化子的筛选和鉴定（检）,3 基因工程的操作过程,由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子,转化子,重组子,目的重组子,载体遗传标记检测,抗药性筛选法,ROP,ROI,Sal I,BamH I,Tc,r,Pvu I,Pst I,Pst I,EcoR I,Cla I,Hind III,Hind II,Bal I,Ap,r,抗药性筛选法的基本原理：,pBR322,
22、4363 bp,ori,抗药性筛选法可区分转化子与非,转化子、重组子与非重组子,将外源DNA片段插在EcoRI位点：,非重组子呈 Apr、Tcr,重组子呈 Apr、Tcr,将外源DNA片段插在BamHI位点：,非重组子呈 Apr、Tcr,重组子呈 Apr、Tcs,载体遗传标记检测,抗药性筛选法,抗药性筛选法的基本操作：,先将转化液涂布含有Ap的平板,再将Ap平板上的转化子影印至,含有Ap和Tc的平板上,在Ap平板上生长、但在Ap和Tc,平板上不长的转化子即为,Ap,Ap+Tc,影印,挑选,重组子,载体遗传标记检测,显色筛选法,显色筛选法的基本操作：,pUC18,Ap,r,lacZ,ori,Ap
23、+X-gal,重组子（Apr+lacZ-）,将外源基因克隆在pUC18的lacZ标记基因内部，使之灭活，此时重组子呈Apr、lacZ-，淡黄色菌落；而非重组子则呈Apr、lacZ+，蓝色菌落,核酸分子杂交,Southern杂交检测DNA,Southern杂交检测DNA,A 鸟枪法,4 目的基因的克隆与基因文库的构建,鸟枪法克隆目的基因的基本战略,鸟枪法操作的改进,鸟枪法克隆目的基因的局限性,鸟枪法克隆目的基因的基本战略,随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离,B cDN
24、A法,4 目的基因的克隆与基因文库的构建,cDNA法克隆目的基因的基本战略,cDNA法分离目的基因的基本程序,cDNA法法克隆目的基因的局限性,cDNA法克隆目的基因的基本战略,mDNA,cDNA第一链的合成,AAAAAAAAAAAAAAOH 3,TTTTTTTTTTTTTTp 5,AAAAAAAAAAAAAAOH 3,TTTTTTTTTTTTTTp 5,cDNA第一链,引物,退火,逆转录酶,dNTPs,cDNA第二链的合成,煮沸,NaOH,自身引导法：获得的双链cDNA 5端会有几对碱基缺失,AAAAAAAAAAAAAA,AAAAAAAAAAAAAAOH 3,TTTTTTTTTTTTTTp
25、5,TTTTTTTTTTTTTTp 5,TTTTTTTTTTTTTTp 5,AAAAAAAAAAAAAAOH 3,TTTTTTTTTTTTTT,OH 3,Klenow,dNTPs,S1,cDNA第二链的合成,DNApol dNTPs,RNaesH,置换合成法：获得的双链cDNA 5端也会有几对碱基缺失,AAAAAAAAAAAAAAOH 3,TTTTTTTTTTTTTTp 5,AAAAAAAAAAAAAAp 5,5,S1,AAAATTTOH 3,TTTTTTTTTTTTTTp 5,5,TTTTTTTTTTTTTTOH 3,AAAAAAAAAAAAAA 5,5,TTTTTTTTTTTTTT 3,3
26、,T4-DNA ligase,cDNA第二链的合成,dCTP,TdT,引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5端序列,AAAAAOH 3,TTTTTp 5,3 HO,AAAAACCCCCCCOH 3,3 HOCCCCCCC,TTTTTp 5,3 HOCCCCCCC,TTTTTp 5,3 HOCCCCCCC,TTTTTp 5,5 pGGGGGGG,3 HOCCCCCCC,TTTTTp 5,5 pGGGGGGG,AAAAAOH 3,NaOH,退火,Klenow,dNTPs,cDNA法克隆目的基因的基本战略,双链cDNA的克隆,双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：,平头末端
27、直接与载体连接，但插入的片段无法回收,平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组,分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段,加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收,cDNA法克隆目的基因的局限性,并非所有的mRNA分子都具有polyA结构,细菌或原核生物的mRNA半衰期很短,mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，,分离纯化困难,仅限于克隆蛋白质编码基因,E 基因文库的构建,4 目的基因的克隆与基因文库的构建,基因文库的基本概念,基因文库的构建程序,基因组文库重组克隆的排序,基因文库的基本概念,基因库与基因文库,基因库（gene pool）,特定生物体全基因组的集合（天
28、然存在）,基因文库（gene library or gene bank）,从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式,基因组文库（含有全部基因）,存在（人工构建）。根据构建方法的不同，基因文库分为：,cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）,基因文库的基本概念,基因文库构建的基本战略,用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体DNA,用cDNA法构建cDNA文库，材料来自mRNA,在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA,种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的cDNA文库,一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA,文库等。很显然，cDN
29、A文库的信息量远小于基因组文库,基因文库的基本概念,基因文库的质量标准,除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件：,重组克隆的总数不宜过大 以减轻筛选工作的压力,载体的装载量最好大于基因的长度 避免基因被分隔克隆,克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域 以利克隆排序,克隆片段易于从载体分子上完整卸下,重组克隆能稳定保存、扩增、筛选,基因文库的构建程序,基因组DNA的切割,用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和,限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：,第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区,第二，保证DNA片段大小均一,超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需
30、加装人工接头,部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如：,Sau3AI或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控,连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级,分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体！,基因文库的构建程序,载体和受体的选择,出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的,l-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体,l-DNA,由于绝大多数真核生物的mRNA小于10 kb，因此用于cDNA文库构建的载体,通常选质粒,上述几种载体的最大装载量如下：,质粒,考斯质粒,15 kb,25 kb,45 kb,BAC,300 kb,YAC,400 kb,用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌,
