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1、第十四章基因工程常用技术,1.了解基因工程常用技术2.掌握细菌的转化和转染3.理解定点突变的诱发因素4.掌握核酸分子杂交5.理解PCR技术6.理解DNA序列分析方法7.了解基因组文库的构建方法,教学目的和要求,基因工程常用技术,凝胶电泳细菌的转化和转染核酸分子杂交定点突变PCRRFLPRAPDDNA序列分析目的基因的分离和转基因植物、转基因动物等技术。,凝胶电泳：分辨DNA范围 使用浓度 琼脂糖凝胶 几百-2万bp 0.3-2.0%聚丙烯酰胺凝胶 6-1000bp 3-20%凝胶电泳制备方法：样品制备凝胶制备电泳染色观察。应用于分析；纯化。,细菌的转化和转染,转化：指受体细胞从周围介质总共吸收
2、外来DNA片段，使其基因型和表型发生相应变化转染：转化的特殊形式，是用离体状态的噬菌体、病毒核酸感染细胞，以改变受体遗传组成关键：受体细胞是否处于感受态。诱导方法为：快速生长的细菌+0、CaCl2低渗溶液细胞肿胀呈球状（感受态）+DNA吸附+42短暂处理+MgCl2吸收为防止限制，提高转化效率，可选用无限制作用的突变体。,定点突变的诱发,这项技术是加拿大的M.Smith70年代创造，获1993年诺贝尔化学奖。也称位点专一诱变。是一种反向遗传学方法。即将克隆基因在体外按预先的设计利用核酸酶、诱变剂等来诱发位点特异性突变，或将预先确定的碱基改变引入人工合成的寡核苷酸再组入基因中，然后将已知缺失、插
3、入、碱基替换、移码等不同类型的突变基因导入受体细胞，再进行选择、分析突变表型。这里仅介绍寡核苷酸定点突变,寡核苷酸定点突变,原理及步骤,核酸分子杂交,1968年由Boy Britten等人发明原理：DNA或RNA（带互补的特定核苷酸序列）混合（退火）同源区段形成双链结构杂种核酸分子（来源不同）类型：Southern杂交；Northern杂交；原位杂交（boltting）Southern杂交：将电泳凝胶中的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同DNA或RNA探针杂交检测同源片段的方法。见图,Southern杂交,图.Southern转移和分子杂交的过程,Northern杂交,又称RNA印
4、迹技术，是将RNA分子从电泳凝胶转移到NC滤膜上进行杂交的一项技术。由J.C.Alwinex等在1979年建立它与Southern杂交十分相似，不同之处只是从凝胶中转移到滤膜的是RNA而不是DNA类似的转移蛋白质的方法叫Western杂交应用Northern杂交技术可以了解特定基因的表达情况。,原位杂交,在Southern杂交技术的基础上发展起来的菌落（或噬菌斑）杂交，其方法是将培养皿中的菌落印迹到NC滤膜上，溶菌，使变性的DNA与滤膜牢固结合。然后按照Southern杂交的方法进行分子杂交和显影。常用于目的克隆（菌落）的筛选。（见下图）细胞和组织的原位杂交首先要制备组织样品，步骤包括组织固定
5、、脱水、石蜡包埋和切片。转移至滤膜并在原位进行杂交，放射性同位素标记的DNA或RNA探针与待测DNA的互补配部位，可通过放射性自显影显示出来。,PCR技术,PCR：polymerase chain reaction的缩写叫做聚合酶链式反应技术1985年，美国Kerry Mullis发明荣获1993年诺贝尔化学奖原理：引物延伸反应产生的子链DNA经热变性为单链后，有可作为模板，在引物和DNA聚合酶的作用下指导新的子链的合成。需要：引物（一对）；酶（如TagDNA聚合酶）；dNTP；缓冲液；水（超纯水）,PCR扩增的几个方面,关于扩增参数：启动温度循环“变性”（94；30）“退火”（温度由引物确定
6、；30）“延伸”（72；时间由扩增的长度而定）。注：退火温度4(G+C)+2(A+T)循环次数 2530次最后延伸时间要长一些。优点和问题：可对痕量DNA进行大量扩增。TagDNA聚合酶复制忠实性差，错误掺入率为210-4，30轮后可达0.25%，比Klenow酶高4倍。应用 gene扩增探针制备临床法医学,RFLP和RAPD技术,RFLP：限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism）DNA分子（来源不同）；基因组DNA（不同生物）长度不同的限制性片段。对于一种酶和一种DNA来说，所产生的限制性片段都是特异的，所以，这些片段的电泳图谱
7、可以作为这种DNA的“指纹”，故又叫指纹分析。RAPD：随机扩增多态性，用于DNA“个性”DNA样品PCR扩增得到一组数目及长度不同的DNA片段电泳，EB染色电泳图谱,DNA序列分析,Maxam-Gilbert和W.Gilbert建立基本原理：DNA片段（末端带有放射性标记）特定位点断裂一组长度不同的片段电泳自显影X光片上显示谱带读出DNA碱基顺序。步骤：化学降解时，将DNA样品分为四份，放入不同的反应系统中。见下图,双脱氧-M13体系DNA序列分析法,待测片段克隆到M13载体上，其优点制备足够的DNA片段使用一种通用引物M13复制产生的单链DNA释放到细胞外。,目的基因的分离,通常是先建立基
8、因文库，然后从基因文库中筛选和鉴定含目的基因的克隆。基因文库（gene library）：是指含有插入片段的重组体DNA分子的一个集合体，这些分子加在一起就构成了一个生物体的整个基因组。,（一）基因组文库的建立,cDNA文库：从某一生物或特定器官和组织中获得的总DNA，经反转录产生cDNA，以cDNA构建的克隆群体就叫这种生物（或器官和组织）的cDNA文库。主要优点：筛选目的基因较容易，因为一个完全cDNA基因文库所含的克隆数，比一个完全的基因组DNA文库所含的克隆数要少的多cDNA克隆中不存在内含子序列，这有利于在原核细胞中表达。,（二）基因组文库（genome bank）基因组文库即gDN
9、A文库，是指包含某种生物的基因组全部DNA的基因文库。哺乳类的基因文库多用 噬菌体构建，计算得到的噬菌斑数目可确定基因文库是否包括了99%的基因组DNA。基因组文库大小：N=（1-p）/（1-f）N：所需的重组体数目；p：是从一个基因文库中分离得到的单拷贝基因的 概率；f：是外源DNA片段平均大小占整个基因组长度的 百分数。该公式还可简化为N=4.61G/f，其中G是基因组的大小,本章小结,1.基因工程常用技术凝胶电泳、细菌的转化和转染、核酸分子杂交、定点突变、PCR、RFLP、RAPD、DNA序列分析、目的基因的分离和转基因植物转基因动物等技术2.细菌的转化和转染3.定点突变的诱发4.核酸分子杂交Southern杂交、Northern杂交、原位杂交5.DNA序列分析双脱氧-M13体系DNA序列分析法6.基因组文库的建立,
