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1、基因重组与基因工程技术课件,基因工程亦称遗传工程，即利用DNA重组技术的方法，把DNA作为组件，在细胞外将一种外源DNA（目的基因）和载体DNA重新组合连接（重组），最后将重组体转入宿主细胞，使外源基因DNA在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增殖（cloning，克隆），或最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状。基因重组技术作为分子生物学最重要、最基本的技术之一，是许多分子生物,生物化学和细胞生物学实验实施的基础。,现代基因工程的创始人P伯格（美国,1926）在1960年以敏锐的科学预见力提出一个大胆的设想：是否可以创造出一种人工方法，把外界的遗传基因引入动物体内，以达到改变遗传
2、性状和治疗某些疾病的需要呢？1972年，伯格把两种病毒的DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来，于是产生了一种新的重组DNA分子，首次实现两种不同生物的DNA体外连接，获得了第一批重组DNA分子，这标志着基因工程技术的诞生。伯格因此获得了1980年诺贝尔化学奖。,1973年，美国斯坦福大学教授S科恩和加州大学旧金山分校教授HW博耶将两个不同的质粒（一个是抗四环素质粒，另一个是抗链霉素质粒）拼接在一起，组成嵌合质粒，并将其导入大肠杆菌，当该重组质粒进入大肠杆菌体内后，这些大肠杆菌能抵抗两种药物，而且这种大肠杆菌的后代都具有双重抗药性。这表明“杂合质粒”在大肠
3、杆菌的细胞分裂时也能自我复制。,科恩随后以DNA重组技术发明人的身份向美国专利局申报了世界上第一个基因工程的技术专利。这标志着自然界不同物种间在亿万年中形成的天然屏障被打破了，人类可以根据自己的意愿定向地改造生物的遗传特性，甚至创造新的生命类型。1977年，吉尔伯特（WGilbert）分别将编码胰岛素和干扰素的DNA经过体外重新拼接后，导入大肠杆菌中，分别使大肠杆菌合成了胰岛素和干扰素。,DNA重组的基本模式,目的基因,基因载体,重组体,分,切,接,转,筛,表,总体技术路线,(分)-目的基因及载体的分离,需要克隆的DNA片段：,化学合成法,cDNA文库基因组DNA文库,聚合酶链式反应,目的基因
4、的获取,从基因所在生物直接取得-用限制酶剪切供体DNA-用机械的方法eg 超声波,化学合成法,人工合成：根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。较短的核酸片段（60-80bp）,多肽链的氨基酸顺序,mRNA的碱基排列顺序,相应的基因结构,化学合成目的基因,化学合成的最大优点是可以合成一些分离较困难的基因。化学合成的不足之处在于：-要已知基因的核苷酸顺序；-基因不能太大，这一方面是测定核苷酸（或氨基酸）顺序比较困难，另一方面是因为每次仅能合成几百的短片段，短片段越多，要连接成正确的基因顺序就越困难，得率越低；-价格昂贵。用途：PCR引
5、物,测序引物,定点突变,核酸杂交探针,从基因文库中筛选,将某一种基因DNA用适当的限制酶切断后，与载体DNA重组，再全部转化宿主细胞，得到含全部基因组DNA的种群，称为G文库(genomic DNA library)。将某种细胞的全部mRNA通过逆转合成cDNA，然后转化宿主细胞，得到含全部表达基因的种群，称为C-文库(cDNA library)。C-文库具有组织细胞特异性。,从mRNA反转录合成cDNA,构建基因文库获取目的基因存在的问题费时费事内含子序列反转录人工合成互补DNA方法的优势 获取的DNA片段往往是 具有特定功能的目的基因,聚合酶链式反应（polymerase chain re
6、action,PCR）,如已知目的基因两端的序列，则可采用聚合酶链反应技术，在体外合成目的基因。但此法可能会造成克隆的目的基因碱基序列的改变。,载体DNA的选择,理想载体的基本条件：可转移性,为目的基因提供进入受体细胞的转移能力。合适的复制位点,为目的基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力。多克隆位点：广泛、特异选择标志，便于筛选和鉴定分子较小，可容纳较大的外源DNA,质粒噬菌体腺病毒载体逆转录病毒载体,种类：,质粒载体的一般结构,存在于细菌染色体外的小型环状DNA分子。具有自我复制功能。带有抗性基因及表型识别等遗传性标记物。经改造后具有多克隆位点。,DNA重组的基本模式,切-限制性内切酶酶
7、切,限制性内切酶酶切,酶切,载体和目的基因的切断,通常采用限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)，简称限制酶，分别对载体DNA和目的基因进行切断，以便于重组。限制酶目前已经发现400多种，所识别的顺序往往为4-8个碱基对，且有回文结构。由限制酶切断后的末端可形成平端、3-突出粘性末端和5-突出粘性末端三种情况。形成粘性末端(cohesive end)者较有利于载体DNA和目的基因的重组。,酶切-双酶切：体系：选择合适的缓冲体系，尤其是双酶切反应中。DNA：经过纯化的，尽量不含有蛋白质，酒精等杂质。时间：一般为5-7h，载体overnight以保证酶切完全。不能时间
8、过长，以防止内切酶的star活性，降低特异性。酶切之后立即回收，小片段用PCR-purification Kit 除去，大的片段要用切胶回收去除。,T-vector,T-vector两条链的5端含有一个游离的TPCR过程中，普通的Taq酶可在产物的3端多加一个A,DNA重组的基本模式,接-载体和目的基因的连接,（一）粘性末端连接法：当载体DNA和目的基因均用同一种限制酶进行切断时，二者即可带有相同的粘性末端。如将载体与目的基因混合在一起，二者即可通过粘性末端进行互补粘合，再加入DNA连接酶，即可封闭其缺口，得到重组体。较少的情况下，对产生的平端也可直接进行连接。,即将带有切口的载体与所获得的目
9、的基因连接起来，得到重新组合后的DNA分子。,载体DNA与目的基因的连接,（二）人工接尾法：即同聚物加尾连接法。当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断，无法得到相同得粘性末端时，可采用此方法。此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的基因的3-端，如载体上添加一段polyG，则可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通过碱基互补进行粘合，再由DNA连接酶连接。,末端转移酶（terminal transferase）该酶全称为末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase），它所
10、催化的反应与DNA pol I 相似，所不同的是它不需要模板，它可以含有的片段为引物，在端加入核苷酸达几百个。末端转移酶常用于在平头上合成一段寡聚核苷酸，从而形成粘性末端。,（三）人工接头连接法：将人工连接器（linker，即一段人工合成的含有多种限制酶切点的小分子DNA片段，约1020个核苷酸）连接到平末端DNA分子(载体和目的基因)上，即有可能使用同一种限制酶对载体和目的基因进行切断，得到可以互补的粘性末端。这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点。,连接体系的建立：温度：粘末端连接：12-18(16-20 hours)平末端连接：室温（低于30)DNA量：载体分子数/目的基因分子数=
11、1：3-5酶量：平端连接时需加大酶量 连接反应体系越小越好，相对而言，酶切体系稍大较好,连接失败后-一步一步向上游检测问题所在，所以分子 克隆部分“留一半”的原则有时候是很有用的。酶切是否完全，所以要做载体的自连对照。载体酶切回收是否考虑到切除片段的大小，是否要用切胶回收更保险。,DNA重组的基本模式,转-重组体的转化,受体细胞,重组体的转化,宿主菌或受体细胞,原核系统-大肠杆菌-枯草杆菌真核系统-酵母菌酵母-昆虫细胞-哺乳动物细胞,原核细胞的转化（细菌转化）,受体细胞的选择：限制缺陷型:避免修饰和降解重组缺陷型：避免重组整合转化亲和型：较高的可转化性遗传互补型：利于筛选感染缺陷型：防止感染,
12、感受态细胞（competent cell）,所谓感受态，就是细菌吸收转化因子的生理状态。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2等化学试剂法）的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Competent cells）。,大肠杆菌感受态细胞的制备(化学方法),大肠杆菌细胞,大肠杆菌感受态细胞,CaCl2处理,目前常用的感受态细胞制备方法是CaCl2法,CaCl2 法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15的无
13、菌甘油于-70保存(半年),因此CaCl2法为使用更广泛。,一、受体菌的培养 从LB平板上挑取新活化的E.coli DH5单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中，37下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中，37振荡培养2-3小时至OD600 0.5左右。二、感受态细胞的制备(CaCl2 法)将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟，然后于4下3000g离心10分钟。弃去上清,用预冷的0.05 mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后，4下3000 g离心10分钟。弃去上清,加入4ml
14、预冷含15%甘油的0.05 mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。感受态细胞分装成200l的小份,贮存于-70可保存半年。,感受态细胞的制备的操作步骤,为了提高转化效率,实验中要考虑以下几个重要因素：细胞生长状态和密度:不要用经过多次转接或储于的培养菌，最好从70或-20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。试剂的质量:所用的
15、试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管,tip头等经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染,否则均会影响转化效率或杂DNA的转入,为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。,大肠杆菌细胞,大肠杆菌感受态细胞,得到噬菌斑或单菌落,与重组DNA共同冰浴而后42短暂热刺激,CaCl2处理,受体细菌,50-100mmol/L,CaCl2,感受态细菌,重组体转入细菌,转 化,从-70冰箱中取200l感受态细胞悬液,室温下使其解冻
16、，解冻后立即置冰上。加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50 ng,体积不超过10l)，轻轻摇匀，冰上放置30分钟后。42水浴中热击90秒或37水浴5分钟，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp)，混匀后37振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)。将上述菌液摇匀后取100l 涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37培养16-24小时。计算转化率。,转化的操作步骤,为了提高转化效率,实验中要考虑以下几个重要因素：用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDN
17、A)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1 ng的cccDNA即可使50l 的感受态细胞达到饱和。当所转化的很难得时（如用从相对难得的样品中提取mRNA而合成的cDNA),这就显得格外重要。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5。,对照实验,E.coli的电穿孔转化：在高压电场下使细胞产生瞬间的穿孔，这个穿孔足够大并可维持足够的时间，使外源DNA进入受体细胞。电穿孔法的转化效率比钙转化法高23个数量级。这种方法也可用于真核生物的转染。,转化方法,真核细胞的转染,受体细胞系统 永生细胞系 细胞特异性的选择标记
18、,对抗某种药物,电穿孔法：原理与原核生物的电穿孔法一样。磷酸钙转染技术：主要用于动物细胞的转染。将DNA溶液加入到CaCl2中，然后在强烈震荡下加入由Na2HPO4和NaH2PO4组成的磷酸缓冲液，使溶液产生磷酸钙沉淀并将DNA包裹在沉淀中。将这些沉淀加入到细胞中，利用细胞的胞饮作用将DNA导入到细胞中。磷酸钙一方面可以增加细胞的通透性，一方面可以避免DNA被细胞内的核酸酶水解。,磷酸钙介导的转染,重组体+磷酸钙微粒,内吞作用,重组体进入细胞,大颗粒,转染方法,基因枪转染法：利用被电场或机械加速的金属微粒能够进入细胞内的基本原理，先将DNA溶液与钨、金等金属微粒一起保温，使DNA吸附在金属微粒
19、表面，随高速的金属微粒直接进入细胞内。激光微束穿孔法：利用直径很小、能量很高的激光束在细胞表面引起可逆性的穿孔，使DNA进入细胞。显微注射法：利用毛细管直接将DNA注入细胞内。脂质体（liposome）介导法：将DNA包裹在人工制备的磷脂双分子层的膜状结构内，通过脂质体与细胞膜的融合而将DNA导入细胞内。多聚物介导法：利用多聚物如PEG、二乙胺乙基葡聚糖（DEAE葡聚糖）、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等与二价阳离子、DNA混合形成沉淀颗粒，通过细胞的胞饮作用而进入细胞内。,DNA重组的基本模式,重组体克隆的筛选与鉴定,转化后的克隆群体：,阳性重组子的筛选与鉴定,遗传检测法(根据重组载体的标志作筛选)
20、-插入失活法-互补法限制性酶切法PCR法杂交筛选法免疫学方 法核苷酸序列测定法,遗传检测法,菌株为某种抗生缺陷型，而质粒上带有该抗性基因（如氨苄青霉素，卡拉霉素等）这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出。,对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用插入灭活法进行筛选。如pBR322中带有抗氨苄青霉素和抗四环素基因，当将目的基因插入抗四环素基因后，就可引起该基因失活，细菌对氨苄青霉素耐药，而对四环素敏感。在含氨苄青霉素的培养基上能够生长，而在含四环素的培养基上不能生长的细菌即为带重组体的细菌。,如果外源DNA插入，氨卞青霉素抗性基因失活,如果外源DNA插入，四环素抗性基因失活,pBR322质粒结
21、构,pBR322,Amp,Tet,插入片段,Amp平板,Tet平板,-互补法蓝白筛选,现在使用的许多载体（如系列）有含有一个大肠杆菌的短区段，其中含有半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和N端个氨基酸偏码区（全长1201氨基酸）。这个编码区中插入一个多克隆位点。受体菌是Z基因突变型，只含编码半乳糖苷酶端aa的序列。当外源基因插入时，在IPTG（异丙基硫代-D-半乳糖苷）诱导下合成半乳糖苷酶N端片断，和受体菌的C端片断溶为一体后，可产生蛋白质间的互补，形成有活性的半乳糖苷酶，称互补。具有互补的细菌培养在含IPTG及X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）的培养基上。X-gal本身是无
22、色的，在半乳糖苷酶的水解下产生兰色的物质（被水解为无色的半乳糖及深兰色的5-溴-4-氯靛兰），因此会形成蓝色菌落。而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入突变失活，则不能产生互补，因此菌落是白色的。通过颜色不同而区分重组子和非重组子。IPTG起诱导表达的作用，相当于乳糖，但它的诱导效率远高于乳糖。,-互补法,限制性酶切法,经过粗筛后的含重组体的细菌，还需进行限制酶谱分析进一步鉴定。将单一细菌进行扩增后分别提取其DNA，用重组时所用的同一限制酶进行酶切，再将其与不含目的基因的载体一起进行电泳比较分析，如发现出现目的基因片段的电泳带即证明重组体中带有目的基因。,凝胶电泳检测,加样孔,DNA M
23、arker,空质粒,重组质粒,重组质粒酶切,重组质粒的PCR扩增片段,PCR法,利用的目标引物(例如分离目的基因所使用的引物)，抽提需要筛选的克隆的重组DNA作为模板,进行PCR扩增,根据是否扩增出目的片段来确定阳性克隆。,杂交筛选法,为了进一步鉴定重组基因体中的目的基因，可采用与目的基因部分互补的DNA片段作为探针，与含有重组体的细菌菌落进行杂交，经放射自显影，如结果为阳性，即可确定重组体中带目的基因。,32P标记的DNA分子探针杂交放射自显影法,依据：碱基互补配对原则步骤：合成核酸探针（与所需基因互补的核苷酸短链，并用同位素标记）升高温度或改变pH使DNA变性 分子杂交（常用原位分子杂交）
24、如果基因文库中的一个DNA片段能和探针结合形成双链，这一片段即含有所需基因。,分子杂交,免疫化学检测法,滤膜（固定抗体）,+,DNA序列分析法,该方法通常是用在目的基因筛选后最终的鉴定。,ACTGAAGGCT,真核细胞的筛选,新霉素抗性选择系统：新霉素是原核生物的抗生素，对真核生物没有抑制作用，但新霉素的类似物G418对真核细胞及原核细胞均具有抑制作用。新霉素抗性基因（neo）能在真核细胞中表达并能使G418失活（neo基因编码一个磷酸转移酶），细胞可以生长。,真核细胞的筛选标记,新霉素类药物 G418筛选,Am,Neo,P,ori,G418,灭活,（-）,蛋白质合成,tk-细胞突变株筛选转染
25、细胞,选择原理：tk(胸苷激酶)基因的筛选：受体细胞必须是相应的tk-，将细胞培养在含HAT（H：黄嘌呤，A：氨甲喋呤，T：胸苷）的培养基中。在A存在下，核苷酸的从头合成途径被阻断，不能合成AMP、TMP及GMP。这三种核苷酸的合成只能有补偿途径合成，必须具有tk基因的存在细胞才可生长。,氨基喋呤筛选法,氨基喋呤(HAT选择),核酸从头合成,（-）,核酸补救合成（TK酶）,TK-,TK+,DNA重组的基本模式,外源基因在宿主细胞中的表达,重组子,目的基因的mRNA,表达蛋白质,大肠杆菌（E.coli）受体细胞,外源基因在宿主细胞中的表达,原核生物基因结构和表达特点,原核生物染色体DNA是裸露的
26、环形DNA，其转录和翻译是偶联的连续进行。原核生物形成多顺反子mRNA：mRNA在合成过程中和多个核糖体结合，翻译形成多条肽链。一般不含内含子（intron），没有转录及翻译后加工系统。原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成操纵子。操纵子是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位。,原核生物中参与转录的基因结构：启动子(promoter,P)是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。一般长40-60bp，富含A-T碱基对 具有保守序列：-10区（pribnow box）：TATAAT-35区：终止子（terminator，T）:位于基因3端,给予RNA聚合
27、酶转录终止信号的DNA序列,与翻译有关的原核细胞结构：核糖体结合位点 翻译起始密码子AUG 或GUG SD顺序（shine-dalgarno）：AUG上游3-11 bp 长约3-9bp mRNA与16s核糖体亚基间的识别与结合序列,人类对大肠杆菌经过长期的研究，对其特性和遗传背景了解得最清楚，大肠杆菌培养操作简单、生长繁殖快、价格低廉，人们用大肠杆菌用外源基因的表达工具已有几十年的经验积累，大肠杆菌表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。设计外源基因在大肠杆菌表达就需要外源基因在大肠杆菌中表达所
28、需要的元件，包括转录起始必需的启动子、翻译起始所必需的核糖体识别序列等；外源基因表达的产物可能会对大肠杆菌有毒害作用，会影响细菌的生存繁殖，所以大多数表达载体都带有诱导性表达所需要的元件，即有操纵子序列以及与之配套的调控基因等；外源基因还应当插入到适合于表达的位置，所以表达载体中要设有适合的多克隆位点；此外还应具备基因克隆筛选的条件，包括在细胞中复制必需的复制起始序列、筛选标志如抗药性基因等。,外源基因在原核表达系统中表达的必要条件：删除内含子和5非编码区外源基因置于强启动子和SD顺序控制下维持正确开放阅读框架（ORF）mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋白质不被降解,原核表达载体(expres
29、sing vector),特点：带表达构件转录和翻译所需的DNA序列大肠杆菌表达载体：含启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号启动子：trp-lac(tac)启动子、噬菌体PL启动子、T7噬菌体启动子核糖体结合位点(ribosome-binding site,RBS)：起始密码子(ATG)和SD序列转录终止序列,影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素：,启动子,终止子,SD,mRNA,多肽链,启动子的选择和改造 强启动子 可调控启动子,P,启动子：建立表达载体时，选择强启动子。启动子最佳作用距离-转录起始点,常见原核强启动子：Plac：受Lac阻遏蛋白负调，受IPTG的诱导Ptrp：取自大肠
30、杆菌色氨酸操纵子。Ptac:Lac启动子和Trp启动子的杂合启动子。PL和PR启动子：噬菌体早期左/右向启动子，受噬菌体CI基因负调控。温度诱导。,Promoters for E.coli,终止子：强终止子、二聚体终止子,终止子,启动子,转录过度 影响目的基因的转录和翻译效率 干扰基因载体的复制等生物学功能 增加受体细胞的无效能量消耗,SD序列：影响翻译效率,SD序列与16SrRNA的互补性SD的后续序列的核苷酸组成SD与起始密码之间的距离,mRNA,SD,融合型表达载体：-融合蛋白非融合型表达载体：-天然完整蛋白分泌型表达载体：-产物可跨膜分泌至胞周间隙,原核表达载体的类型,融合型表达载体,
31、P,SD,Foreign DNA,融合型表达载体,融合基因,优点：表达效率高产物稳定 易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可鉴定易纯化：利用融合原核多肽的特性,技术关键：克隆基因插入原核序列3端而维持正确阅读框架。选择合适酶切位点加人工合成的DNA接头构建位相载体,位相载体-含有3种读码框的系列载体,Ptac：IPTG诱导GST融合蛋白直接纯化产物切割方便：pGEX-1T凝血酶 pGEX-2T-凝血酶 pGEX-3T-X因子位相载体,融合型载体-pGEX系列,非融合型表达载体,P,SD,Foreign DNA,非融合型表达载体,非融合基因,主要元件：强启动子 SD：ATG：第一个密码子,非融合型表达
32、载体-pPL-Lamda,PL启动子-温度诱导插入位点-HpaI,分泌型表达载体：主要元件：启动子和SD序列 信号肽序列：SD下游，编码信号肽，可引导蛋白跨膜优点：分泌表达，避免降解。,分泌型表达载体-pINIII-ompA1,没有真核转录后加工的功能，不能进行mRNA的剪接，所以只能表达cDNA而不能表达真核的基因组基因；没有真核翻译后加工的功能，表达产生的蛋白质，不能进行糖基化、磷酸化等修饰，难以形成正确的二硫键配对和空间构像折叠，因而产生的蛋白质常没有足够的生物学活性；表达的蛋白质经常是不溶的，会在细菌内聚集成包涵体（inclusion body），尤其当表达目的蛋白量超过细菌体总蛋白量
33、10%时，就很容易形成包涵体。生成包涵体的原因可能有是蛋白质合成速度太快，多肽链相互缠绕，缺乏使多肽链正确折叠的因素，导致疏水基因外露等。细菌裂解后，包涵体的离心后的沉淀中，虽然有利于目的蛋白的初步纯化，但无生物活性的不溶性蛋白，要经过复性（renaturation），使其重新散开、重新折叠成具有天然蛋白构象和良好生物活性的蛋白质，常常是一件很困难的事情。也可以设计载体使大肠杆菌分泌表达出可溶性目的蛋白，但表达量往往不高。,原核表达系统的缺点,具转录后加工系统具翻译后修饰系统可实现真正的分泌表达基因治疗,真核表达系统的必要性及优势,真核基因结构及表达调控特点,真核基因组的复杂性：真核基因组庞大
34、，具大量非编码序列-mRNA丰度不同结构复杂：染色质、核膜、线粒体-表达调控多样不连续性：内含子、外显子没有操纵子结构,据受体细胞及表达载体的不同分为3种：酵母表达系统哺乳动物细胞表达系统昆虫细胞表达系统,要表达真核生物的蛋白质，采用真核表达系统自然应比原核系统优越。真核表达载体至少要含两类序列：原核质粒的序列，包括在大肠杆菌中起作用的复制起始序列、能用在细菌中筛选克隆的抗药性基因标志等，以便插入真核基因后能先在很方便操作的大肠杆菌系统中筛选获得目的重组DNA克隆、并复制繁殖得到足够使用的数量。在真核宿主细胞中表达重组基因所需要的元件，包括启动子、增强子、转录终止和加poly-A信号序列、mR
35、NA剪接信号序列、能在宿主细胞中复制或增殖的序列，能用在宿主细胞中筛选的标志基因、以及供外源基因插入的单一限制性内切酶识别位点等。,真核表达载体,真核表达元件：启动子/增强子克隆位点终止信号和加poly(A)信号剪接识别信号复制与选择元件,外源基因的表达：胞内表达分泌表达：在MCS前加入信号肽序列缺点:不能实现全部的翻译后修饰功能,Example,IPTG-T7 RNA pol-His6-cDNA,Calreticulin as an example(Calreticulin is an ER chaperone)钙网蛋白calreticulin内质网中的一种需Ca2+的凝集素样分子伴侣蛋白,
36、(inhibits T7 pol),Inducibility in E.coli:via T7 RNA polymerase,an inducible,OFF,ON,+IPTG,Lac repressor,LysozymeTo squelch background low level of T7 pol,calreticulin,Lac repressor,(competes with his),Purification of the cloned gene product,(Nitriloacetic acid chelate,NTA),MBP=maltose binding proteinGST=glutathione-S-transferase,Assorted protein tags used for purification,(binds to biotin site),(Gets biotinylated in vivo),(Amp-resistance),(IgG-binding domain from Protein A),Enterokinase:Asp Asp Asp Asp Lys,OR,Tag removal after purification,OR,目的蛋白的分离纯化,亲和柱分子筛离子交换疏水层析抗原抗体,目的蛋白,
