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1、Volume 3动物细胞工程,动物细胞工程是通过对动物细胞及其组分的分工程序操作，研究生命活动的规律，实现对动物的遗传改造，结合非生物材料的手段，生产用于治疗人类疾病或缺陷的人工器官、组织、细胞及代谢产物或用于深入研究的材料等为主要研究内容的一门学科。,Chapter 1动物细胞培养技术,本章主要教学内容：动物细胞培养基本原理体外细胞培养技术动物细胞大规模培养,Section 1动物细胞培养基本原理,一、动物细胞培养的定义 动物细胞培养是指用酶消化法将组织碎块分离成单个细胞，用培养基制成细胞悬液，在体外适宜条件下，使细胞生长繁殖，并保留其一定的结构和功能特性。,体外培养（in vitro cu
2、lture）：就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。分为组织培养、细胞培养和器官培养。体外细胞与体内细胞有何差异？,体外培养的与体内生长细胞的差异 细胞离体后，失去了体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡的相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡，或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。如何分化？,体外培养中细胞的分化 细胞是否表现分化，关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血
3、红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。,二、动物细胞培养的发展历程1907年，美国生物学家Harrison将蛙胚的神经组织培养在淋巴液中，存活数周，并观察到细胞突起的生长过程。1923年，法国学者卡勒尔设计卡氏培养瓶培养鸡胚的心肌组织成功1951年，厄利尔开发了供动物细胞体外培养的培养基,动物细胞基因工程：20世纪80年代以后，随着基因工程技术和细胞融合技术的迅速发展，已经能够把特定的外源基因通过PCR 技术扩增几千倍，并可转染到动物细胞内，使其得到高质量的表达。近年来，已经启用了300升和1000升的培养罐分
4、别用于生产单克隆抗体和灰色脊髓炎疫苗。此外人体器官的培养为器官移植开辟了一条途径。,二、动物细胞培养的特点与微生物细胞培养相比，动物细胞培养有哪些特殊之处？,动物细胞培养与微生物细胞培养相比，主要有以下不同：（1）动物细胞比微生物细胞大，无细胞壁；（2）动物细胞倍增时间长，生长缓慢，易受污染；（3）培养过程需氧量少，对机械搅拌或剪切力敏感；（4）动物细胞间主要以聚集体形式存在；（5）原代细胞一般繁殖50代左右即退化死亡。,（6）大多数哺乳动物细胞只有附着在固体或半固体的表面才能生长；（7）动物细胞对于营养要求更加苛刻，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需要血清；（8）对于培养环境的适
5、应性更差，对环境极其敏感，包括pH、溶解氧、温度、剪切力等都比微生物有更高的要求，一般需严格监控。,三、体外培养的类型体外培养按过程可分为：原代培养（亦称初代培养）和传代培养（亦称继代培养）。原代培养是指将机体取出的细胞或组织进行实效培养的过程。实效培养的细胞大约增殖10代左右，这样的细胞称为原代细胞（primary cell）。从原代培养的细胞继续转接培养称为传代培养。按培养程度：细胞培养、组织培养、器官培养,体外培养种类（培养程度）,细胞系 是指由初代培养产生的能进行无限次代培养的细胞群。大多数细胞在体外培养的条件下，经过有限次的分裂会死亡，例如，人体的成纤维细胞只可以培养几个月，传代50
6、-100次死亡，但偶尔在一定的培养条件下，产生无休止进行繁殖的变异细胞，形成细胞系。,细胞系的特点：（1）可以提供大量的同一类型的细胞，有利于研究工作；（2）可以大量分离细胞产物，用于企业化生产；（3）可以长期冻存于液氮中，需要时可以解冻复苏；（4）细胞系细胞多数为非整倍体，个别为二倍体，如WI-38,常用的细胞系（1）Hela细胞，1951年取自于Henrietta Lacks，她是一名宫颈癌患者，取材8个月后，die，而细胞则延续至今。,Hela细胞,（2）CHO细胞，中国仓鼠卵巢细胞,Chinese Hamster Ovary Cell,（3）COS-7：SV-40感染的非洲绿猴成纤维细
7、胞,COS-7细胞,四、动物细胞（组织）培养的生长特性体外培养细胞类型,1.粘附型细胞粘附有两种含义：（1）细胞之间相互接触；（2）细胞与细胞外基质结合。动物细胞培养中，大多数哺乳动物细胞是必须附壁即附着在固体表面生长，当细胞布满表面后即停止生长，这时若取走一片细胞，存留在表面上的细胞就会沿着表面生长而重新布满创面。,细胞贴壁延展过程,细胞接触抑制,粘附型细胞类型,1 成纤维型2 上皮型3 游走型4 多形型,（一）成纤维细胞型细胞 外形与体内成纤维细胞形状相似，细胞大致呈梭形或不规则形。前者贴壁后呈长梭形，圆形细胞核位于中央，胞质外伸出23个长短不同的突起，生长时呈放射状、漩涡状走向。多数细胞
8、之间排列疏散，有较大的细胞间隙，有时也相互平行排列，成群细胞呈现放射状、旋涡状等形式。起源于中胚层的细胞在体外培养时一般表现为这种形式。人胚肺细胞在显微镜下可观察到典型的成纤维样细胞型。,成纤维型细胞,（二）上皮型细胞 类似上皮细胞的细胞，特点是：扁平状，形态较为规则，细胞贴壁后呈三角形及不规则扁平的多角形，中央有扁圆形核，生长时彼此紧密连接成单层细胞。因为相互拥挤而呈现“铺路石状”，局部可以单层的上皮状“膜片组织”。来源：内胚层、外胚层 皮肤的表皮细胞、消化管与呼吸道的上皮细胞、肺泡上皮细胞、消化腺上皮细胞、血管内皮细胞等。,上皮型细胞,（三）游走型细胞 体外培养的游走型细胞具有类似巨噬细胞
9、样的特征。形态学特征：游走型细胞在支持物上分散生长，一般不连接成片、形成群落；细胞胞质常伸出伪足和突起；在培养器皿壁上生长位置不固定，呈活跃的游走和变形运动，速度快且方向不规则；细胞内易出现色暗的吞噬性颗粒。,该类细胞不很稳定，外形不规则且不断变化，当细胞密度增大、连接成片时，形状类似于成纤维样细胞型或上皮细胞型。表现这种细胞形态的主要是具有吞噬作用的单核巨噬细胞系统的细胞，如颗粒性白细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、肿瘤细胞等。,游走型细胞,（四）多形型细胞 多形型细胞是一些形态上不规则的细胞，但它不像成纤维细胞那样不规则形态由宽扁的胞质突起所致，而是一般分胞体和胞突两部分，其中胞突为细长
10、形，类似丝状伪足；胞体虽然也略呈现多角形，但没有成纤维细胞那样不规则。多形型细胞不常见，只有某些像神经组织细胞等难以确定其稳定形态的，才可归于多形细胞。体外培养呈现多形型细胞的细胞最常见的是神经元和神经胶质细胞。,多形型细胞,影响细胞形态特征的因素 p90血清成分培养基成分及添加成分培养基的酸碱度气相环境、温度等。例如，一些已分化的细胞在有无血清的培养液中生长，形态特征就会有所差异 Hela细胞过酸、过碱时呈梭形,2.非粘附型细胞 体外生长不必贴壁，可在培养液中悬浮生长，因此也叫悬浮型细胞。这类细胞形态学特点：胞体始终为球形 一些在体内原本就以悬浮状态生长的细胞，当接种于体外环境中也可以以悬浮
11、状态生长。包括：血液白细胞、淋巴组织细胞，某些肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞系等都属此类细胞。,非粘附型细胞,悬浮培养类似微生物的深层培养。由于是悬浮生长，细胞密度一般都较高，培养的效率也高、操作也容易。优点：易于大规模生产，便于过程的控制。缺陷：能在悬浮状态下生长的细胞种类有限，不太方便观察。,Section 2体外培养基本技术,一、培养条件1.培养器具 培养瓶、培养板、培养管材料：玻璃、塑料（聚苯乙烯、聚丙烯等）、金属,2.温度 与多数哺乳类动物体内温度相似，培养细胞的最适温度为37，偏离此温度，细胞的正常生长及代谢将会受到影响甚至导致死亡。3.细胞培养的无菌环境,无菌操作技术,体外培养细
12、胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。即便使用设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作不规范,也会导致污染。因而,为在一切操作中最大可能地保证无菌，每一项工作都必须做到有条不紊和完全可靠。,消毒(disinfection)和消毒剂(disinfectant)灭菌(sterilization)防腐(antisepsis)和防腐剂抑菌(bacteriostasis)和抑菌剂(bacteriostatic)无菌(asepsis)无菌技术/无菌操作(antiseptic technique),Terms to remember:,【培养前准备】在开始实验前要制定好实验计划和
13、操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。这可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。,【操作野消毒】无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面次(拖布要专用)，紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75酒精擦洗。然后紫外线消毒30min。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。,【洗手和着装】原
14、则上和外科手术相同。平时仅做观察不做培养操作时，可穿着细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服。在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75酒精消毒手。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。,【火焰消毒】在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。,二、培养基（一）细胞培养基的基本要求：体外培养的细胞直接生活在培养基中，因此培养基应能满足细胞对营养成分、促生长因子、激素、渗透压、pH、
15、无毒、无污染等诸多方面的要求。细胞培养基其组成成分主要有：水、氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子及激素等,1.水与平衡盐溶液（1）培养用水 体外培养的细胞对水质特别敏感，对水的纯度要求较高。配制培养用液应使用经石英玻璃蒸馏器三次蒸馏的三蒸水或超纯水净化装置制备的超纯水。最好用龙头瓶贮存，存放时间一般不应超过2周。（2）缓冲溶液、生理盐水、平衡盐溶液,2.渗透压 细胞必须生活在等渗环境中，大多数培养细胞对渗透压有一定耐受性。人血浆渗透压290mOsm/kg,可视为培养人体细胞的理想渗透压，鼠细胞渗透压在320mOsm/kg左右。对于大多数哺乳动物细胞，渗透压在260320mOsm/kg的范围都
16、适宜。,3.气体 O2参与三羧酸循环，产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种成分。一些细胞在缺氧情况下，借糖酵解也可获取能量，但多数细胞缺氧不能生存。在开放培养时，一般置细胞于95空气加5CO2的混合气体环境中培养。CO2既是细胞代谢产物，也是细胞所需成分，它主要与维持培养基的pH有直接关系。,4.pH 动物细胞大多数pH值约在7.27.4(6.87.6)在封闭式培养过程中CO2与水结合产生碳酸，培养基pH很快下降。为解决这一问题，合成培养基中使用了NaHCO3-CO2缓冲系统，并采用开放培养，使细胞代谢产生的CO2及时溢出培养瓶，再通过稳定调节温箱中CO2浓度（5），与培养基中的NaHCO3处
17、于平衡状态。,（二）天然细胞培养基 天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基，如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。组织培养技术建立早期，体外培养细胞都是利用天然培养基。但是由于天然培养基制作过程复杂、批间差异大，因此逐渐为合成培养基所替代。目前广泛使用的天然培养基是血清，另外各种组织提取液、促进细胞贴壁的胶原类物质在培养某些特殊细胞也是必不可少。,血清(serum)细胞培养的发展，培养基的质量是关键，而在培养基的主要成份中，动物血清对细胞的生长繁殖发挥着重要甚至是难以替代的作用。在动物血清的应用中牛血清是最为广泛的，血清是医药生物技术产品中重要的原材料之一，保证血清质量也是促进
18、生物制品质量提高的重要环节。,1.血清种类:目前用于组织培养的血清主要是牛血清，培养某些特殊细胞也用人血清、马血清等。选择用牛血清培养细胞的原因：来源充足、制备技术成熟、经过长时间的应用考验人们对其有比较深入的理解。牛血清分为：小牛血清、新牛血清、胎牛血清。,2.血清的主要成分 血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物，其组成成份（血清的成份可能有几百种之多）虽大部分已知，但还有一部分尚不清楚，且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性是达到生理平
19、衡的。,3.血清主要作用：提供基本营养物质 氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等，是细胞生长必须的物质。提供激素和各种生长因子激素：胰岛素、肾上腺皮质激素（氢化可的松、地塞米松）、类固醇激素（雌二醇、睾酮、孕酮）等。生长因子：成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子等。,提供结合蛋白：结合蛋白作用是携带重要的低分子量物质 如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等，转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用。提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤。对培养中的细胞起到某些保护作用：有一些细胞，如内皮细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。,4
20、.细胞培养中使用血清的缺点对大多数细胞，在体内状态，血清不是它们接触的生理学液体，只是在损伤愈合以及血液凝固过程中才接触血清，因此使用血清有可能促进某些细胞的生长（成纤维细胞），同时抑制另一类细胞生长（表皮细胞）。血清含一些对细胞产生毒性的物质，如多胺氧化酶，能与来自高度繁殖细胞的多胺反应（如精胺、亚精胺）形成有细胞毒性作用的聚精胺。,动物个体不同，血清产地、批号不同，每批质量差异甚大，其成分不能保持一致。取材中可能带入支原体、病毒，对细胞产生潜在影响，可能导致实验失败或实验结果不可靠性。血清的使用使得实验和生产的标准化困难，其中的蛋白质使得某些转基因蛋白生物药品生产中的分离纯化工作很难完成。
21、价格昂贵，是构成动物细胞培养对生产成本的主要部分之一。,5.血清的质量标准 血清质量高低取决于两方面因素：取材对象取材过程 血清必须严格执行相应的标准,血清质量的鉴定一般包括以下几个方面理化性质：如渗透压、pH值、蛋白电泳图谱、蛋白含量、激素水平、内毒素等 微生物检测：包括细菌、真菌、支原体、病毒等。特别是对支原体、病毒的检测促生长效果：这是血清重要的特性之一，应当以培养的细胞来检测。好的血清应该是透明清亮，土黄色或棕黄色，无沉淀或极少沉淀，比较粘稠。,6.血清的使用与储存 正确的使用及保存血清，才能使血清发挥应有的作用。（1）使用前处理：大部分血清在使用前必须灭活处理，即56，30分钟。灭活
22、的目的是去除血清中的补体成分，避免补体对细胞产生毒性作用。,（2）储存条件 血清一般储存于20，同时应避免反复冻融。购买血清后，首先要灭活处理，然后分装成小包装，储存于20，使用前置于4融化。（3）使用浓度 使用浓度一般为520（合成培养基），最常用是10。过多血清容易使培养中的细胞发生变化。,合成细胞培养基,（三）合成细胞培养基 合成培养基是根据天然培养基的成分，用化学物质模拟合成、人工设计、配制的培养基。1.基本培养基包括：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物、水。,（1）无机盐 细胞生长除需要钠、钾、钙、镁、氮和磷等基本元素，还需要微量元素，如铁、锌、硒、铜、锰、钼、钒等。CaCl2、KC
23、l、MgSO4、NaCl、NaHCO3、NaH2PO4，对调节细胞渗透压、某些酶的活性以及溶液的酸碱度都是必须的。,（2）氨基酸 是细胞合成蛋白质的原料。所有细胞都需要12种必须氨基酸：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、组氨酸、酪氨酸、精氨酸、胱氨酸(L型)。此外还需要谷氨酰胺，它在细胞代谢过程中有重要作用：细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏可导致细胞生长不良甚至死亡。,（3）碳水化合物 是细胞生命的能量来源，有的是合成蛋白质和核酸的成分。培养中的细胞可以进行有氧与无氧酵解，六碳糖是主要能源。此外六碳糖也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。细胞对葡
24、萄糖的吸收能力最高，半乳糖最低。体外培养动物细胞时，几乎所有的培养基或培养液中都以葡萄糖作为必含的能源物质。,（4）维生素 主要扮演辅酶、辅基的角色，必不可少。生物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素、维生素B12都是培养基常有的成分。,2.促生长因子及激素 已证实，各种激素、生长因子对于维持细胞的功能、保持细胞的状态（分化或未分化）具有十分重要的作用。有些激素对许多细胞生长有促生长作用，如胰岛素，它能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸。有些激素对某一类细胞有明显促进作用，如氢化可的松可促进表皮细胞的生长，泌乳素有促进乳腺上皮细胞生长作用等。,3.其他成分酚红：一种pH指示剂，当溶液酸性时p
25、H小于6.8呈黄色；当溶液碱性时pH大于8.4呈红色(红色-pH7.4，橙色-pH7.0，黄色-pH6.5，蓝红色-pH7.6，紫色-pH7.8)。在较为复杂的培养液中还包括核酸降解物(如嘌呤和嘧啶两类)，以及氧化还原剂(如谷胱甘肽)等有的培养液还直接采用了三磷酸腺苷和辅酶A(HS-CoA),（四）无血清技术及无血清培养基 经历了天然培养基、合成培养基后，无血清培养基和无血清培养成为当今细胞培养领域的一大趋势。采用无血清培养可降低生产成本，简化分离纯化步骤，避免病毒污染造成的危害。无血清培养基(serum free medium,SFM)是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合
26、成培养基。,无血清培养基的基本配方：基础培养基及添加组分两大部分 添加组分包括以下几大类物质：促贴壁物质：一般为细胞外基质，如纤连蛋白、层粘连蛋白等 促生长因子及激素：胰岛素、生长激素酶抑制剂：须含胰酶抑制剂，以终止酶的消化作用，达到保护细胞的目的 结合蛋白和转运蛋白：转铁蛋白等 微量元素：硒,使用无血清培养基的优点增加确定性性能更加一致容易进行纯化和下游加工细胞功能的精确评估增强生长和增加产量生理反应性的较好对照增强细胞内中介物的检测,（五）其它动物细胞培养必需的溶液1.平衡盐溶液（balanced salt solution,BSS）组成：主要是由无机盐、葡萄糖组成作用：维持细胞渗透压平衡
27、，保持pH稳定及提供简单的营养。用途：主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。D-Hanks与Hanks：主要区别是前者不含有Ca2+、Mg 2+，因此D-Hanks常用于配制胰酶溶液。两者缓冲能力较弱Earle平衡液：含有较高的NaHCO3(2.2g/L),适合于5%CO2的培养条件，缓冲能力较强。,2.培养基pH调整液 合成培养液大多呈微酸性NaHCO3溶液：NaHCO3是培养基中必须添加的成分，一般情况下按说明书的要求准确添加，以保证培养基在5%CO2的环境下pH达到设计标准。HEPES溶液：是一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞无毒性，主要作用是防止培养基pH
28、迅速变动。,3.消化液（1）胰蛋白酶溶液 组织培养用胰酶溶液一般配制成0.1-0.25%浓度，配制时要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡盐溶液（如前面的D-Hanks），因为这些物质会对胰酶产生抑制作用。（2）乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA）作用机制是破坏细胞间的连接（非酶性解离）。对于一些贴壁特别牢固的细胞，还可以用EDTA和胰酶的混合液进行消化。（3）胶原酶溶液 胶原酶在上皮类细胞原代培养时经常使用,4.抗生素溶液：（1）青链霉素：俗称“双抗溶液”。青霉素主要是对革兰阳性菌（细胞壁）有效，链霉素主要对革兰阴性菌（蛋白质）有效。青霉素：100U/ml，链霉素：100 g/ml（2）卡那霉
29、素 抑制细菌蛋白质的合成，50g/ml（3）制霉菌素 干扰细菌细胞质膜的生成，25 U/ml,5.谷氨酰胺补充液 谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添加。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，4下放置7天即可分解约50%，所以都是在使用前添加。配制好的培养液（含谷氨酰胺）在4放置2周以上时，要重新加入原来量的谷氨酰胺，故需单独配制谷氨酰胺，以便临时加入培养液内。,三、基本方法和传统技术（一）细胞培养的一般过程 1.准备工作 准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试。准备工作对开展细胞
30、培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。,2.取材 在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。,3.接种 将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中即进行细胞的培养。组织块：直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加
31、入培养基。细胞：一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。,4.培养原代培养、继代培养 正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常；有无污染；培养基的pH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示）；培养温度和CO2浓度也要定时检查。,5.冻存及复苏低温生物学 在体外培养工作中，常要将体外培养物进行冷冻保存，在需要时再复温融解进行体外培养（复苏）：冷冻速率、复温速率、冷冻保护剂，冷冻保存温度。冻存：温度一般用液氮的温度196，将细胞收集至
32、冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。,复苏：一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37水中，使之在一分钟内迅速融解，然后将细胞转入培养器皿中进行培养。,总原则：慢冻快溶,（二）细胞培养的基本方法 p961.悬滴培养法 是最早建立的体外培养技术，是组织、器官培养的经典方法，最早是由Harrison于1907年创立的。基本要点是：将组织或器官植块接种在一张盖玻片上，滴上一滴培养液，然后翻转盖玻片使植块及营养液悬挂在盖玻片下，再置放于一凹形载片之上，最后用熔蜡密封后放入培养箱中培养。,A
33、可用于双盖片培养的凹载片。B可用于单盖片培养的凹载片。C适用于在显微镜下直接观察的凹载片。D凹载片的侧面观。,用于悬滴培养的凹载片,方法：A-D在盖玻片上滴加胚胎提取液、血浆、和植块，混匀。培养基凝固后将植块包埋。E在凹载片周围涂凡士林。F将凹载片向下压向盖玻片。G将F反转，盖玻片周围涂熔蜡。H放入培养箱培养。,2.旋转管培养法方法：将培养物接种于一管状培养器皿中，在将其固定在一可以旋转的装置上，旋转培养的一种方法。特点：培养物可交替接触培养液与气体环境，有利于细胞或组织的生长。,3.灌注小室培养法方法：将细胞接种于一个由上下两个盖玻片（分别构成上壁与下壁）与一金属圈（构成侧壁）密封围成的小室
34、内，保持在一定条件下培养。在小室的侧面分别有液体流入和流出的开口，供新鲜培养液流入小室和旧培养液排出。1912年，由Burrows尝试设计。特点：细胞生长较少受到代谢产物的影响,A-排液瓶 B-受液瓶 C-不锈钢灌注小室 D-小孔道E与F、J-2号注射针头 G与H-塑料导管 I-玻璃导管 K与L-14号注射针头,4.培养瓶培养法 将拟培养对象直接接种于培养瓶内，再放入培养箱进行培养。培养瓶材料：早期玻璃培养瓶目前一次性塑料培养瓶形状：扁平,5.盖玻片培养 以盖玻片为生长表面，将拟培养的组织、细胞接种于盖玻片上，然后放进培养瓶中进行培养。特点：方便观察、染色便于长期保存增加培养面积,A内放3张载
35、玻片的试管B玻璃试管C带狭颈的旋转管,6.培养板培养法 具体做法是将培养细胞接种在培养板的孔内，然后在CO2培养箱内培养。最常用的培养板有6孔、24孔和96孔培养板，后者最为常用。一般都是一次性使用。,（三）体外培养细胞的生长和增殖过程三个主要阶段1.原代（初代）培养期 是指将培养物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物的培养过程，指从体内取出组织接种培养到第一次传代培养这个阶段，一般持续1-4周。在这个阶段，细胞比较活跃，有细胞分裂，但不旺盛。,原代培养包括以下几个方面的含义：培养物一经接种到培养器皿（瓶）中就不在分割，任其生长繁殖；原代培养中的“代”并非细胞的“代”数，因为培养过程
36、中细胞经多次分裂已经产生多代子细胞；原代培养过程中不分割培养物不等于不更换培养液，也不等于不更换培养器皿。,机械分散组织细胞方法,消化初代培养法基本步骤（组织块培养、组织消化培养 p99）,原代培养是建立各种细胞系（株）必经的阶段，其是否成功主要与以下五种因素有关：供体年龄供体生理状态组织污染与否培养技术和方法适宜培养基的选择等多种因素,2.传代期 当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。此时就需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行
37、培养。这个过程就称为传代（passage）或者再培养（subculture）。对单层培养而言，80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。一般情况下，当传代10-50次后，细胞增殖逐渐缓慢，以致完全停止。,一般传代培养的步骤：(1)吸出培养瓶内旧培养液；(2)加入胰蛋白酶和EDTA混合液盖满瓶底；(3)25分钟后检查，如有细胞间隙变大，细胞质回缩现象，终止消化；(4)吸出消化液，加入Hanks液，轻轻转动以免细胞流失，洗去残留的消化液。如果单用胰蛋白酶，可直接加入培养液；(5)用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落制成悬液，计数后记录其浓度；(6)重新接种培养,消化法传代培养步骤,细胞培养过程生长曲线
38、,3.衰退期 该阶段细胞仍然生存，但是增殖很慢或不增殖。细胞形态轮廓增强，最后开始衰退凋亡。如成纤维细胞：来自胎儿传代50次后衰老死亡，来自成人传代20次后衰老死亡(与具体年龄有关)；来自小鼠传代14-28次后衰老死亡，来自乌龟传代90-125次后衰老死亡。,细胞衰老过程中会发生一系列的变化，包括：蛋白质：合成速度降低，已有蛋白质结构变化，特异蛋白质成份出现细胞核、线粒体、膜系统、骨架系统等都有结构、功能的改变细胞形态轮廓增强,细胞计数,培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。血细胞计数器：手工计
39、数细胞Coulter计数仪：人工计数,细胞计数：1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。3、静置3分钟。4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：细胞数/ml4大格细胞总数/410000注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。,培养细胞的污染问题及检测,细胞培养的污染问题十分重要，一旦发生污染，将导致前功尽弃。所以细胞培养一定要建立无菌观念。遇到培养污染要分析原因，及时处理。细胞污染的种类可分成细菌
40、、酵母菌、霉菌和病毒。无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等是主要的污染源。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。,细胞污染的种类和判定,细胞培养中常见的污染物有细菌、酵母菌、真菌、支原体和病毒等。在出现以下情况时培养的细胞可能有污染：1)培养液的酸碱度发生异常的改变。2)培养液出现混浊。3)光镜观察到菌丝和颗粒。4)细胞出现死亡或增殖缓慢等。,污染物的检测,1.细菌和真菌污染的检测肉眼直接观察法培养检查法显微镜观察法 检测到阳性结果后，应高压灭菌处理污染的培养物及其用具。,2.支原体检测:支原体污染细胞后，能抑制细胞代谢和生
41、长，改变核酸合成，影响细胞的抗原性，引起细胞染色体改变，干扰病毒的复制，以及具有类病毒作用。在培养细胞初期，由于支原体对细胞的繁殖影响较小而往往被忽略。,污染物的检测,支原体的污染和检测,造成支原体高污染率的原因：1.支原体大小0.10.8 um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um）；2.支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化；3.过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式；4.细胞流通间缺乏物品管理，造成实验室间的相互污染；5.研究或操作人员忽略污染问题；6.已受污染的细胞；7.已受污染的培养基、血清。,支原体之检测：相差显微镜观察法Hayflick培养基直
42、接培养法原理：直接培养支原体于培养基中，观察其生长及菌落生成。特点：是目前最直接与灵敏之步骤，亦是用来评估其它侦测新步骤 之标准步骤。缺点：培养时间长，须35星期才能判断。有些支原体不能在培养基培养出来(例如M.hyorhinis)。需同时培养支原体株作为正反应对照组，可能会造成污染。,DNA荧光染色法 原理利用荧光染剂（bisbenzimide,Hoechst 33258）检测支原体污染。此染剂会结合到DNA之富含A-T区域，因为支原体之DNA中A-T含量占多数（5580%），所以可将其染色而检测。被支原体污染之细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一之荧光小点，即为支原体之DN
43、A，证明有支原体之污染。测试步骤用间接步骤，将待测细胞悬浮液或细胞培养液接种于指示细胞培养液中（indicator cell，例如Vero cell or 3T3 cell），然后培养指示细胞再作萤光染色。正负反应对照组亦可以接种于indicator cell内作为对照。待测细胞亦可作直接测试，但需为吸附型细胞，培养后直接作荧光染色。有些细胞易有荧光背景，而干扰结果判读，则建议使用接种于指示细胞之步骤。特点简单、经济与灵敏，广泛使用，可作为例行之侦测步骤。可以侦测不易培养之支原体，例如M.hyorhinis，较直接培养法快，约一星期即可知道结果。缺点：有时仍会有荧光背景，影响判读。,污染病毒的
44、检测,1）致细胞病变效应（CPE）或集落的检测：采用相差显微镜检测2）血细胞吸附试验；3）鸡胚接种。,细胞间交叉污染,为避免细胞间交叉污染，应注意：了解各细胞系的特征；培养各细胞系的操作手续要快速；培养各细胞系不用同一瓶的培养液和酶等；吸过培养液和细胞悬液的吸管，不能放回储存培养液和酶的瓶内；经常检查培养物特征，注意任何突然的形态学改变，通过染色体或同工酶谱分析，检查是否有交叉污染。,动物细胞培养举例猪骨骼肌卫星细胞培养 肌肉卫星细胞因处于基膜和肌细胞膜之间，紧贴肌细胞表面而得名。,1材料与方法 1日龄猪仔，DMEM培养基，胎牛血清等。颈动脉放血处死，无菌条件下分离半膜肌，剪成1立方毫米的小块，胶原酶消化24小时，吹打分散，得细胞悬液。记数、接种于培养瓶，放入培养箱培养。贴壁后，加入胰蛋白酶消化，除去非成肌细胞，重新接种培养。隔天换液。,2结果,
