第三章药物物理常数测定课件.ppt

《第三章药物物理常数测定课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第三章药物物理常数测定课件.ppt（94页珍藏版）》请在三一办公上搜索。

1、药物分析,第二章 药物分析中常用仪器分析技术,药物分析中常用仪器分析技术,学习目标：1、初步掌握药物检验中经常使用的物理常数测定方法及仪器；2、初步了解光谱法（紫外-可见分光光度法、红外光谱法；原子吸收分光光度法）在药物检验中的应用；3、初步了解色谱法（薄层色谱法；高效液相色谱法、气相色谱法等）在药物检验中的应用；,第一节 药物物理常数的测定 物理常数是评价药物质量的重要指标，不同性质、纯度的药物有着不同的物理常数值，在分析工作中可选择测定相关的物理常数才进行药物的鉴别，检查。,相对密度 pH值 熔点 馏程 凝点 黏度 旋光度 折光率 吸收系数,主要内容（Ch.P 2010）,1、概念相对密度

2、:指在相同的温度、压力条 件下，某物质的密度与水的密度的比值，除另有规定外，温度为20。,一、相对密度,2、测定相对密度的意义 纯药物的相对密度在特定条件下为不变的常数，药物的纯度改变，相对密度也随之改变，测定相对密度，可以区别或检查药物的纯杂程度。,3、相对密度测定方法中国药典中：比重瓶法 测定一般液体药物的相对密度。韦氏比重秤法 测定挥发性液体药物。,首先将洁净、干燥并精密称定重量的比重瓶，装满供试品，装好温度计，水浴使内容物达到20(或各品种项下规定温度)，用滤纸吸干溢出侧管的液体，立即盖上罩。然后将比重瓶从水浴中取出，再用滤纸将比重瓶的外面擦净，精密称定，减去比重瓶的重量，求得供试品的

3、重量后倾去，洗净比重瓶，装满新沸过的冷水，再照上法测得同一温度时水的重量，计算，即得。,（1）比重瓶法,供试品的相对密度供试品重量/水重量注意：用比重瓶测定时的环境(指比重瓶和天平的放置环境)温度应略低于20或各品种项下规定的温度。,图3-2 比重瓶,取20时相对密度为1的韦氏比重秤，用新沸过的冷水将所附玻璃圆筒装至八分满，置20(或各品种项下规定的温度)的水浴中，将悬于秤端的玻璃锤浸入圆筒内的水中，秤臂右端悬挂游码于1.0000处，调节秤臂左端平衡用的螺旋使平衡，然后将玻璃圆筒内的水倾去，拭干，装入供试液至相同的高度，并用同法调节温度，平衡后读取数值，即得供试品的相对密度。,（2）韦氏比重秤

4、法,该比重秤系在4时相对密度为1，则用水校准时游码应悬挂于0.9982处，并应将在20测得的供试品相对密度除以0.9982。,图3-2 韦氏比重秤,1、概念溶解度：是药品的一种物理性质，通常是指在一定温度下，在一定量溶剂中达饱和时溶解的最大药量，是反映药物溶解性的重要指标。2、意义溶解度在一定程度上也可反映药品的纯度。中国药典2005年版关于药物溶解度有七种提法：（见表3-1）,二、溶解度,表3-1 药物溶解性能含义,以上这些术语仅表示药物大致的溶解性能。准确的溶解度：常用一定温度下100g溶剂中（或100g溶液或100ml溶液）溶解溶质的最大克数来表示。例：咖啡因在20的水溶液中溶解度为1.

5、46，即表示在100ml水中溶解1.46g咖啡因时溶液达到饱和。,3、药物溶解度的粗略试验法（ChP）：除另有规定外，称取研成细粉的供试品或量取液体供试品，于252一定容量的溶剂中，每隔5分钟强力振摇30秒钟，观察30分钟内的溶解情况，如无目视可见的溶质颗粒或液滴时，即视为完全溶解。,药物溶液、分析时所用溶剂的酸碱性可用pH值来表示，pH值常用酸度计来测定。酸度计主要包括:电极和电位计 参比电极：有稳定的已知电位；有甘汞电极、氯化银电极等 指示电极：电极的电位随溶液中氢离子浓 度改变而变化；有玻璃电极、氢醌电极和锑电极等。,三、pH值,中国药典规定：除另有规定外，水溶液的pH值应以玻璃电极为指

6、示电极、饱和甘汞电极为参与电极的酸度计进行测定。测定试样pH值的酸度计应定期进行计量检定，使精密度和准确度符合要求。,仪器校正常用的缓冲液有草酸盐、苯二甲酸盐、磷酸盐、硼砂以及氢氧化钙标准缓冲液。标准缓冲液的配制必须用pH值基准试剂按药典规定的方法配制。（配制标准缓冲液与溶解供试品的水，应是新沸过的冷蒸馏水，其pH值一般应为5.57.0。）标准缓冲液一般可保存23个月，但发现有浑浊、发霉或沉淀等现象时,不能继续使用。,表3-2 不同温度时各种标准缓冲液的pH值表,首先选择与供试液pH值接近的标准缓冲液对仪器进行校正，使其读数与上表数值一致，再应用pH值相差约3个pH单位的另一种的标准缓冲液核对

7、仪器示值，误差应不超过0.02pH单位。若大于此偏差，应小心调节斜率，使示值与第二种标准缓冲液的数值一致。重复上述定位和斜率调节操作，至仪器示值与标准缓冲液规定数值相差不大于0.02pH单位后即可进行样品pH值测定。,样品pH的测定方法,例：对弱缓冲液（如水）的pH值测定时，应先用苯二甲酸盐（4.01)标准缓冲液校正仪器后测定供试液，并重取供试液再测，直至pH值的读数在1分钟内改变不超过 0.05为止；然后再用硼砂标准缓冲液(9.18)校正仪器，再如上法测定；二次pH值的读数相差应不超过0.1；取二次读数的平均值为其pH值。,概念：熔点是固体药物固液两态在大气压力下达成平 衡的温度。由于受药物

8、纯度及测定时温度传导的影响，绝大多数药物在加热熔化表现为一个过程，即从供试品在毛细管内局部液化，出现明显液滴（初熔）至固相消失，供试品全部液化（全熔）的过程，即从初熔到全熔的过程。,四、熔点,有的药物初熔和全熔难以辨别，则以熔化时发生突变的温度作为熔点。有的药物熔融同时分解，则以熔融同时分解的温度作为熔点。因此，一般来说，药物的熔点系指药物由固体熔化成液体的温度，熔融同时分解的温度，或在熔化时自初熔至全熔的一段温度。,根据药物的性状不同，中国药典（2010年版）中收载有三种熔点测定的方法：,第一法 用于测定易粉碎的固体药物。第二法 用于测定不易粉碎的固体药品。第三法 用于测定凡士林或其他类似的

9、物质。,第一法 用于测定易粉碎的固体药物,取供试品，研细，按规定的干燥失重条件干燥，（五氧化二磷干燥或其他适宜的干燥方法）。取供试品适量装入熔点测定用毛细管（内径0.9-1.1mm，壁厚0.10-0.15mm）中，装管高度约3mm，填紧。将温度计插入到传温液中，加热传温液至比规定熔点低限低约10 时，将毛细管插入传温液，贴附在温度计上，使毛细管的内容物正好在温度计汞球的中部，继续加热，调节升温速率1.0-1.5/min，加热时不断搅拌使传温液受热均匀。,观察样品在加热过程中的变化，以局部液化时的温度作为初熔温度，全部液化时的温度作为全熔温度。记录供试品在初熔至全熔时的温度，重复测定三次，取平均

10、值，即得。,第二法 用于测定不易粉碎的固体药品,如脂肪、石蜡、羊毛脂等的测定。将供试品熔化后，吸入两端开口的毛细管（同第一法，但管端不熔封）中，高约10mm，冷却，凝固后照第一法放入传温液中，加热至比规定熔点低约5时，调节升温速度为每分钟不超过0.5，供试品在毛细管中开始上升的温度即为熔点。,第三法 用于测定凡士林或其他类似的物质,将已加热至融熔的供试品粘附于温度计的汞球部，冷却，将温度计插入一外径约为25mm，长150mm的试管中，塞紧，使温度计悬于其中，将试管放入16的水浴中，加热。使水浴温度以每分钟 2的速率升到38，再以每分钟1的速率升温至供试品的第一滴脱离温度计为止，检读温度计上的温

11、度，即可作为供试品的近似熔点，重复测定3次，如3次测得的熔点相差不超过1，即可取平均值作为供试品的熔点，如3次测得的熔点相差超过1，可再测定2次，并取5次的平均值作为供试品的熔点。,传温液的选择视被测药品熔点的高低而定 熔点在80以下者，用水作为传温液；熔点在80以上者，用硅油或液体石蜡作为传温液。测定熔点用的温度计通常选用分浸型温度计（温度计有全浸型和分浸型温度计两种）。温度计使用前还应用熔点标准品进行校正。,测定熔点的方法较多，毛细管法仍是各国药典使用的主要方法。由于测定熔点的方法不同，受传温液、升温的速度等因素的影响，所以应严格按照中国药典的规定进行测定。熔点测定用的对照品无有效期，一般

12、只要外观无变异均可使用。,当用毛细管法测定熔点难以判断时，须用差示热分析法（DSC）予以辅佐。对于一类新药，其熔点须用毛细管法和DSC法两种方法进行测定。,五、馏 程,1、概念 馏程系指一种液体依照中国药典规定方法进行蒸馏，校正到标准压力1013kPa（760mmHg）下，自开始馏出第5滴算起，至供试品仅剩3-4ml或一定比例的容积馏出时的温度范围。,2、测定馏程的意义：某些液体药品具有一定的馏程，不同的药物馏程不同。因此测定馏程可以 区别不同的药物；检查药物的纯杂程度。纯度高的药品，馏程较短；纯度低的药品则馏程较长。,3、馏程的测定方法,馏程的测定采用国产19标准磨口蒸馏装置，用具有0.5m

13、l刻度的量筒收集馏出液。测定时取供试品25ml，经长颈干燥小漏斗加入干燥蒸馏瓶中，加入洁净的无釉小磁片数片，插入温度计，安装好蒸馏装置，加热，使液体沸腾，调节温度使每分钟馏出2-3ml，注意检读自冷凝管开始馏出第5 滴与供试品仅剩3-4ml的温度范围，或一定比例的容积馏出时的温度范围，即为供试品的馏程。,图3-3 馏程测定装置,测定时，气压如在：101.3kPa(760mmHg)以上，每高0.36kPa(2.7mmHg)，应将测得的温度减去0.1；101.3kPa(760rnmHg)以下，每低0.36kPa(2.7mmHg)，应增加0.1,1、概念：指一种物质照药典规定方法测定，由液体凝结为固

14、体时，在短时间内停留不变的最高温度。某些药品具有一定的凝点，若纯度变化，凝点也随之变化。2、测定凝点的意义：区别或检查药品的纯杂程度。,六、凝点,药品准备：取药品适量，（一般来说，如供试品为液体，量取15ml；如为固体，则称取1520g，加微温使熔融）置内管中，使其迅速冷却，测定供试品的近似凝点。再将内管置较近似凝点约高510的水浴中，使凝结物仅剩极微量未熔融。,3、凝点测定方法,仪器准备及测定：烧杯中加入较供试品近似凝点约低5的水或其他适宜的冷却液。用搅拌器不断搅拌供试品，每隔30秒钟观察温度1次，至液体开始凝结，停止搅拌并每隔510秒钟观察温度1次，至温度计的汞柱在一点能停留约1分钟不变，

15、或微上升至最高温度后停留约1分钟不变，即将该温度作为供试品的凝点。,图3-4 凝点测定装置,需要注意的是，有些药品在一般冷却条件下不易凝固，需另用少量供试品在较低温度凝固后，取少量作为母晶加到供试品中，才能测定其凝点。,1、概念：黏度系指流体对流动的阻抗能力。中国药典2010年版把黏度分为：运动黏度、动力黏度和特性黏度2、测定黏度的意义：可以区别或检查其药物的纯杂程度。,七、黏度,动力黏度指液体以1cm/s的速度流动时，在每1cm2平面上所需剪应力的大小，以Pas为单位。运动黏度是液体的动力黏度与其密度的比值，再乘以系数10-6即得，以mm2/s为单位。对于高聚物，溶剂的黏度0常因高聚物的溶入

16、而增大，溶液的黏度与溶剂的黏度0的比值（/0）称为相对黏度（r），当高聚物溶液的浓度较稀时，其相对黏度的对数值与高聚物溶液的浓度的比值，即为该高聚物的特性黏度。,3、黏度的测定方法,黏度的测定用黏度计。中国药典采用的黏度测定方法有三种：第一法是采用平氏黏度计测定牛顿流体（包括纯液体和低分子物质的溶液）的运动黏度。第二法是采用旋转式黏度计测定非牛顿液体（包括高聚物的溶液、混悬液、乳剂分散液体和表面活性剂的溶液）的动力黏度。第三法是采用乌氏黏度计测定特性黏度，常用于右旋糖酐及其制剂等的特性黏度的测定。,A B图3-5 平氏黏度计（A）乌氏黏度计（B）,第一法：平氏黏度计测定牛顿流体的 运动黏度或动

17、力黏度,测定时，取毛细管内径符合要求的平氏黏度计1支，在支管上连接一根橡皮管，用手指堵住宽管管口，倒置黏度计，将主管插入供试液体中，从橡皮管的另一端开始抽气使得供试品充满缓冲球与测定球，并达到测定线m2处，迅速提出黏度计并倒转，抹去黏附于管外的供试品，取下橡皮管使连接于主管管口上，将黏度计垂直固定于恒温水浴中。,黏度计水浴时，水浴的液面高于缓冲球的中部，放置15分钟后，自橡皮管的另一端抽气，使供试品充满测定球，并超过测定线m1，开放橡皮管口，使供试品在管内自然下落，用秒表准确记录液面自测定线m1下降至测定线m2处的流出时间。取两份供试溶液多次测量取平均值，并按下式计算，即为供试品的运动黏度或供

18、试溶液的动力黏度。,运动黏度（mm2/s）Kt 动力黏度（Pas）106Kt 式中 K 为用已知黏度的标准液测得的黏度计常数，mm2/s2；t 为测得的平均流出时间s；为供试溶液在规定温度下的密度，kg/m3。平氏黏度计规格很多，常用的毛细管内径为0.8mm0.05mm，1.0mm0.05mm，1.2mm0.05mm，1.5mm0.1mm 或 2.0mm0.1。,第二法:采用旋转式黏度计测定非牛顿液体动力黏度。,通常是根据在旋转过程中作用于液体介质中的切应力的大小来完成测定的，并下列公式来计算供试品的动力黏度。,式中 K为已知黏度的标准液测得的旋转式黏度计常数；T为扭力矩；为角速度。,常用的旋

19、转式黏度计有同轴双筒黏度计、单筒转动黏度计、锥板型黏度计、转子型旋转式黏度计，可根据供试品的实际情况和黏度范围适当选用。,第三法:采用乌氏黏度计测定特性黏度,测定时，首先将待测药物制成一定浓度的溶液，用3号垂熔玻璃漏斗过滤，取续滤液（7ml以上）沿洁净、干燥乌氏黏度计的宽管内壁注入储器中，将黏度计垂直固定于恒温水浴中，并使水浴的液面高于缓冲球，放置15分钟后，将两根乳胶管分别接于主管和侧管处，夹住侧管管口的胶管，自主管管口处抽气，使供试品溶液的液面缓缓升高至缓冲的中部，依次开放侧管，主管，使供试品溶液在管内自然下落。,供试品在管内下落时，用秒表准确记录液面自测定线m1下降至测定线m2处的流出时

20、间即为供试液的流出时间（T），重复测定两次取平均值，两次测定值相差不得超过0.1秒。再取溶剂经3号垂熔玻璃漏斗滤过后按照相同的方法操作测得溶剂的流出时间（T0），重复测定两次，两次测定值应相同。,按下式计算特性黏数：特性黏数ln r/c，式中r为（T/T0）；c为供试液的浓度g/ml。测定时，通常水浴温度应为250.1。,1、概念：旋光度指偏振光旋转的度数。当平面偏振光通过含有某些光学活性物质的液体或溶液时，能引起旋光现象，使偏振光的平面向左或向右旋转。旋光度有左旋和右旋之分，偏振光向右旋转（顺时针）称为右旋，用符号“+”表示；偏振光向左旋转（逆时针）称为左旋，用符号“-”表示。,八、旋光度,

21、偏振光透过1dm并每1ml中含有旋光性物质1g的溶液，在一定波长与温度下测得的旋光度称为比旋度。2、测定比旋度的意义：区别或检查某些药品的纯杂程度，用以测定药物的含量。,中国药典规定具有旋光性的药品要作比旋度测定，因为具有不同旋光性的药物其药理作用差异很大，因此，对于光学异构体药理作用不同的药物，控制其光学异构体的量非常重要。,3、旋光度的测定,物质的旋光度不仅与其化学结构有关，而且还与被测溶液的浓度、光路长度、测定时定时的温度以及偏振光的波长有关。浓度越大，光路越长，则偏振面旋转的角度也就越大。即在一定的波长和温度下，旋光度（）与浓度（c）、光路长度（l）以及该物质的比旋度 三者成正比关系：

22、,中国药典2010年版采用钠光谱的D线(589.3nm)测定旋光度，除另有规定外，测定管长度为1dm，测定温度为20，在此条件下测定的比旋度用 表示。对于液体供试品：对于固体供试品：式中，为比旋度；为测得的旋光度；l为光路长度（即测定管长度，dm）；d为液体的相对密度；c为每100ml溶液中含有被测物质的重量，g(按干燥品或无水物计算)。,测定药物旋光度时，钠光灯启辉后至少20分钟后发光才能稳定，测定或读数时应在钠光灯稳定后读取，供试的液体或固体物质的溶液若有浑浊或含有混悬的颗粒。应预先滤过取续滤液测定。仪器的各个光学镜片应保持干燥清洁，防止灰尘和油污的污染。测定结束后测试管必须洗净晾干，以备

23、下次再用。,1、概念 光线自一种透明介质进入另一种透明介质时，由于两种介质的密度不同，光的进行方向发生变化，即发生光的折射现象，并且遵从折射定律。根据折射定律，光线入射角的正弦值与光线折射角的正弦值的比值即为折光率。,式中，n是折光率；sini是光线入射角的正弦；sinr是光线折射角的正弦。,九、折光率,中国药典所规定的折光率系指光线从空气中进入供试品的折光率。药物的折光率因温度和光线波长的不同而改变。透光物质的温度升高，折光率变小；光线的波长越短，折光率就越大。2、折光率测定的意义 折光率是液体药物的物理常数，测定折光率可以用于药物真伪的鉴别和纯度检查。,3、折光率的测定 采用阿贝折光仪。中

24、国药典规定在20 时用钠光谱的D线（589.3nm）作为光源测定折光率。在此条件下测得的折光率表示为nD20。由于折光率与温度有关，故阿培氏折光计还装有保温层，可通入一定温度的水保持温度恒定，测定前，折光计读数应用校正用棱镜或水进行校正，测定时，应重复读数三次，三次读数的平均值即为供试品的折光率。水的折光率20时为1.330，25时为1.3325。,图3-6 折射定律示意图,4、注意事项(1)大多数供试品的折射率受温度的影响较大，测定时温度恒定在半小时以上。可用恒温水循环控制温度。(2)上下棱镜应保持洁净应用脱脂棉蘸取丙酮或乙醚擦拭用擦镜纸擦干。不得测定强酸性、强碱性或有腐蚀性的物质。(3)滴

25、加的供试品量应适中，同时勿使气泡进入样品，以免影响折射率的测定。(4)测定挥发性液体时，可关闭上下棱镜，将测定液从进样孔滴人，随加随读数。(5)测定固体样品以及棱镜校正仪器时，不得关闭上下棱镜。(6)测定结束时，必须用能溶解供试品的试剂(如水、丙酮或乙醚)将上下棱镜擦净，晾干，放入仪器箱里，并放人硅胶防潮。,4应用：折射率测定法多用于不同油类、液态药物的区别。,十、吸收系数,1、概念 药物对不同波长的单色光具有选择性吸收，其在最大吸收波长处的吸收系数是该物质的物理常数之一。中国药典使用百分吸收系数（），其定义为：一定波长的单色光透过浓度为1g/100ml，光路长度为1cm 的吸光物质溶液时的吸

26、收度。,2、吸光系数的意义 在给定单色光、溶剂和温度的情况下，吸光系数是药物的特性常数，表明药物对某一特定波长光的吸收能力。不同药物对同一波长的单色光，有着不同的吸光系数。测定吸收系数可以鉴别药物的真伪，也可以反映出药物纯杂的程度。,药品标准中的物理常数是药品的物质常数，不同性质、纯度的药物有着不同的物理常数值，药物分析中常用的物理常数有：相对密度、溶解度、pH值、熔点、馏程、凝点、黏度、旋光度、折光率、吸收系数等。在分析工作中可根据不同药品的特性或检定目的的需求，选择有关物理常数的测定。测定时应严格按照中国药典的要求进行。,小 结,1.药品质量标准中测定物理常数有何意义？2.物理常数的常用测

27、定方法有哪些？,思考题,仪器分析法分类：,1.光学分析法：辐射发射：AES辐射吸收：AAS；IR；UV-VIS；NMR；AFS辐射散射：浊度法；拉曼光谱法辐射衍射法：X射线衍射法；电子衍射法 2.电化学 电导：电导法；电流：电流滴定法；电位：电位分析法；电量：库仑分析法；电流-电压特性：极谱分析法；伏安法。3.色谱法：GC；HPLC；离子色谱；质谱法,第二节 光学分析法,一、紫外-可见分光光度法（一）原理：1、物质对光选择性吸收；2、光的吸收定律：朗伯-比尔定律 光的吸收定律也称为朗伯-比尔定律。朗伯定律是说明光的吸收与吸收层厚度成正比。比尔定律是说明光的吸收与溶液浓度成正比。如果同时考虑吸收

28、层厚度和溶液的浓度对单色光吸收率的影响，则得朗伯-比尔定律。它是吸光度分析的理论基础。,（二）紫外-可见分光光度计在紫外及可见光区用于测定溶液吸光度的分析仪器称为紫外-可见分光光度计（简称分光光度计），目前，紫外-可见分光光度计的型号较多，但它们的基本构造相似，都由光源、单色器、样品吸收池、检测器和测量系统等五大部件组成，框图见图2-5。图2-5 分光光度计组成部件框图,第二节 紫外-可见分光光度法,光源,单色器,吸收池,检测器,测量系统,（三）应用在大多数有机药物分子中，因含有某些能吸收紫外光的官能团而显示吸收的特征光谱，可作为鉴别、检查、含量测定的依据。具有紫外吸收的药物结构：不饱和脂肪族

29、化合物；苯及其衍生物；芳香杂环化合物；,1、鉴别（1）对比吸收光谱特性：最大吸收波长、最小吸收波长、肩峰；（2）对比吸收光谱的一致性；（3）对比吸光度比值的一致性；最大吸收波长的吸光度/最小吸收波长的吸光度值。,2、检查在某波长处药物无吸收，而所含杂质有吸收，可检查某杂质的限度。例：乙醇中苯检查，苯在265nm处有吸收峰，而乙醇无吸收，控制杂质限度10PPm。,3、含量测定（1）百分系数法（2）对照法（3）标准曲线法,第二节 光谱法,二、红外吸收光谱法（一）基本原理红外光谱在可见光区和微波区之间，其波长范围约为0.751000m。根据实验技术和应用的不同，通常将红外光谱划分为三个区域。如下表所

30、示。,（二）红外光谱仪目前生产和使用的红外光谱仪主要有色散型和干涉型两大类。色散型红外光谱仪，又称经典红外光谱仪，其构造系统基本上和紫外-可见分光光度计类似。它主要由光源、吸收池、单色器、检测器、放大器及记录机械装置五个部分组成。图2-6显示了这五个部分之间的连接情况。,红外光谱仪,图2-6双光束红外分光光度计,三、应用分析试样的处理制备样品的要求：试样应该是单一组分的纯物质，纯度应大于98%或符合商业标准。多组分样品应在测定前用分馏、萃取、重结晶、离子交换或其他方法进行分离提纯，否则各组分的红外光谱会相互重叠，难以辩析；试样中应不含游离水。因水本身有红外吸收，会严重干扰样品谱图，还会浸蚀吸收

31、池的盐窗；试样的浓度和测试厚度应选择适当，以使光谱图中大多数峰的透射比在10%80%范围内。,鉴别：（1）利用标准物质进行鉴别（已知化合物）；（2）利用标准图谱进行鉴别；比较峰的位置、峰的强度、峰的形状等。,布洛芬红外标准光谱图,第二节 光谱法,三、原子吸收分光光度法检查项的应用：原子吸收分光光度法用于杂质限量检查时，按下法进行：取供试品按规定配制成供试溶液；另取等量的供试品，加入限量的待测元素溶液，制备成对照溶液。先将对照溶液喷入火焰，调节仪器使具有合适的读数a；在相同条件下测定供试液B，记录其读数b。则 b相当于供试品溶液中待检元素的含量，（ab）相当于对照溶液中按限量加入的待检元素的量。

32、当b（ab）时，表示供试品中所含杂质元素符合规定，反之，为不合格。,第三节 色谱法,一、薄层色谱法(TLC)二、高效液相色谱法(HPLC)三、气相色谱法(GC),一、高效液相色谱法特点 分离效能高、应用范围广，能准确、快速、分离分析同时进行,1、高效液相色谱仪：高效液相色谱仪是实现液相色谱分析的仪器设备，自1967年问世以来，由于使用了高压输液泵、全多孔微粒填充柱和高灵敏度检测器，从而实现了对样品的高速、高效和高灵敏度的分离测定。仪器工作流程 高效液相色谱仪是由色谱柱为中心的分离部分和检测器为中心的检测部分组成，无论哪种仪器，基本都由输液泵、进样器、色谱柱、检测器及计算机等组成，其中输液泵、色

33、谱柱及检测器是仪器的关键。图2-22是普通配制的带有预柱的HPLC的结构图。,图2-22 带有预柱的HPLC的仪器结构图,高效液相色谱法使用步骤：1、溶液（对照品、供试品、流动相）配制：过滤、脱气。2、仪器的准备：脱气。五大系统先后打开。3、测定：系统适用性实验（理论塔板数、分离度、拖尾因子）。4、计算,2、应用（1）鉴别：对照法。（2）检查：面积归一化法供试品溶液经高效液相色谱分离后，测定各杂质及药物的峰面积，计算各杂质峰面积及其总和占总峰面积的百分率，不得超过规定的限量。如盐酸克林霉素中有关物质的检查。,主成分自身对照法,当杂质峰面积与主成分峰面积相差悬殊时，采用该法。检查时，将供试品溶液

34、稀释成一定浓度的溶液，作为对照溶液。分别取供试品溶液和对照溶液进样，将供试品溶液中各杂质峰面积及其总和，与对照溶液主成分峰面积比较，以控制供试品中杂质的量。,内标法测定供试品中杂质的总量限度,采用不加校正因子的峰面积法。选用的内标物质是一种与被测定组分结构不同但很相似的纯物质。,内标法加校正因子测定供试品中某个杂质或主成分含量,按各品种项下规定，精密称（量）取杂质对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量注入仪器，记录色谱图，测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，计算出校正因子。再将含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，测量供试品中杂质（或主成分）和内标物质的峰面积或峰高，采用校正因子的内标法计算公式计算杂质（或主成分）含量。,外标法测定供试品中某个杂质或主成分含量,按各品种项下的规定，精密称（量）取杂质对照品和供试品，分别配制成溶液，精密量取一定量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品和供试品待测成分的峰面积或峰高，采用比较法计算该杂质（或主成分）的含量。,（3）含量测定面积归一化法对照品法（外标法）内标法,