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1、紫外-可见分光光度法UV-vis,紫外-可见光区（200-800nm）分子吸收光谱的分析方法。,一、紫外-可见分光光度法的基本原理二、紫外-可见分光光度计三、紫外-可见分光光度分析方法,提要：,紫外-可见分光光度法的基本原理,紫外-可见分光光度法的基本原理,1、紫外可见吸收光谱法 根据溶液中物质的分子或离子对紫外光谱区或可见光谱区辐射能的吸收以研究物质组成和结构的方法。2、可见吸收光谱法分类：比色法、分光光度法,3、物质对光的选择性吸收(1)当一束光照射到某物质或其溶液时，组成该物质的分子、原子或离子与光子发生“碰撞”，光子的能量就转移到分子、原子上，使这些粒子由最低能态（基态）跃迁到较高能态
2、（激发态）：M+h M*这个作用叫物质对光的吸收。,(2)分子、原子或离子具有不连续的量子化能级，仅当照射光光子的能量（h）与被照射物质粒子的基态和激发态能量之差相当或为其整数倍时才能发生吸收。不同的物质微粒由于结构不同而具有不同的量子化能级，其能量差也不相同。所以物质对光的吸收具有选择性。,（3）吸收曲线（吸收光谱）吸光度(A)-波长()曲线称-。光吸收程度最大处的波长叫 最大吸收波长，用max表示。高锰酸钾的max=525nm。浓度不同时，光吸收曲线形状不同，最大吸收波长不变，只是相应的吸光度大小不同。,4、可见吸收光谱法的特点（1）灵敏度高：常用于测定试样中1%-10-3%的微量组分，甚
3、至可测定低至10-4%-10-5%的痕量组分。（2）准确度较高：相对误差为2%-10%。如采用精密分光光度计测量，相对误差可减少至1%-2%。（3）应用广泛：几乎所有的无机离子和许多有机化合物都可直接或间接地用此法测定。（4）操作简便快速，仪器设备也不复杂,5、紫外吸收光谱法的特点（1）紫外光谱可以用于有机化合物的定性分析，通过测定物质的最大吸收波长和吸光系数，或者将未知化合物的紫外吸收光谱与标准谱图对照，可以确定化合物的存在（2）可以用来推断有机化合物的结构，例如确定1,2-二苯乙烯的顺反异构体（3）进行化合物纯度的检查，例如可利用甲醇溶液吸收光谱中在256nm处是否存在苯的B吸收带来确定是
4、否含有微量杂质苯（4）进行有机化合物、配合物或部分无机化合物的定量测定，这是紫外吸收光谱的最重要的用途之一。,紫外-可见分光光度法的基本原理,6、有机化合物的吸收光谱,UV-Vis光谱是分子中的价电子在分子轨道之间的跃迁而产生（包括振动和转动能级的跃迁）。有机化合物中有几种性质不同的价电子，有机化合物的UV-Vis光谱吸收光谱是三种电子跃迁的结果：电子、电子、n电子跃迁,根据分子轨道理论，分子中的电子轨道有 n、和 三种,当分子外层电子吸收紫外可见辐射后，处于低能级的价电子就会跃迁到较高能级。主要有四种跃迁，所需能量E大小顺序为：n n,*跃迁,甲烷125 nm乙烷135 nm,所需能量最大；
5、电子只有吸收远紫外光的能量才能发生跃迁,吸收光谱处于远紫外区，多为饱和烃。,n*跃迁,所需能量较大，但小于*跃迁；含有未共用电子对（n电子）原子的饱和化合物都可发生,如含杂原子的分子：-NH2、-OH、-S、-X中的未成键的n电子吸收波长为150250nm，大部分在远紫外区跃迁的吸收系数较低比较小，一般在100-3000 L/mol cm,H3C-O-H,例:甲醇的吸收峰，除*跃迁外，还有n跃迁（吸收波长在183nm，=150 Lmol-1cm-1）,n 跃迁,所需能量小；多发生在含杂原子的双键化合物：-C=O、-C=N、-C=S、-N=N-，即分子中含有孤对电子和键同时存在时，才发生n 跃迁
6、；吸收波长为200400nm，一般在近紫外区；吸收系数较低,例:丙酮有280nm左右的n 跃迁吸收峰（=1030 Lmol-1cm-1）,跃迁,所需能量较小，吸收波长处于远紫外区的近紫外端或近紫外区含有不饱和键的有机分子易发生这类跃迁 属于强吸收，max 104Lmol-1cm-1，具有共轭双键的化合物 跃迁所需能量降低,例:乙烯*跃迁的max=165nm,=1x104 Lmol-1cm-1丁二烯的*跃迁的max=217nm,=2.1x104 Lmol-1cm-1,有机化合物的紫外-可见吸收光谱分析多以*和 n*这两类跃迁为基础,*比 n*跃迁几率大100-1000 倍*跃迁吸收强，104 n
7、*跃迁吸收弱，500,7、无机化合物的吸收光谱,无机化合物的UV-Vis光谱吸收光谱主要有：电荷迁移跃迁及配位场跃迁,配位场跃迁（d一d、f 一f 跃迁）,在配体存在下过渡金属元素5个能量相等的d 轨道和镧系、锕系7个能量相等的的 f 轨道裂分，吸收辐射后，低能态的d电子或f电子可以跃迁到高能态的d或f轨道上去。绝大多数过渡金属离子都具有未充满的 d 轨道，按照晶体场理论，当它们在溶液中与水或其它配体生成配合物时，受配体配位场的影响，原来能量相同的 d轨道发生能级分裂，产生 d-d 电子跃迁。必须在配体的配位场作用下才可能产生，所以称为配位场跃迁；配体配位场越强，d 轨道分裂能越大，吸收波长越
8、短。吸收系数 max 较小(102)，很少用于定量分析；多用于研究配合物结构及其键合理论。,d 轨道电子云分布及在配场下的分裂示意图,例如：H2O 配位场 NH3 配位场Cu 2+水合离子 794 nmCu 2+氨合离子 663 nm,电荷迁移跃迁,辐射下，分子中原定域在金属M轨道上的电荷转移到配位体L的轨道，或按相反方向转移，所产生的吸收光谱称为电荷迁移光谱。,分子内氧化还原反应；不少过渡金属离子与含生色团反应的试剂所生成的配合物可产生电荷迁移跃迁，Fe2+与邻菲罗啉配合物的紫外吸收光谱属于此。max 较大(104以上)，可用于定量分析。,9、光吸收的基本定律朗白比耳定律:A=lg(I0/I
9、t)=K b c 该公式的物理意义为：当一束平行单色光通过单一均匀的、非散射的吸光物质的理想溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。该定律适用于溶液，也适用于其他均匀非散射的吸光物质（气体、固体），是各类 吸光光度法定量分析的依据。,（1）溶液对光的形为及有关术语当光束照射到物质上时,物质可以产生反射、散射、吸收、透射。如果被照射的是均匀的溶液，那么光的散射可以忽略，所以对于溶液来说，对光的就是产生一部分被溶液吸收，一部分被界面反射，其余光则透过溶液。I0=It+Ia+IrIa-吸收光的强度It-透射光的强度Ir-反射光的强度Io-入射光的强度,It,光通过溶液的情况,（2）溶
10、液对光的形为及有关术语 当一束平行单色光照射溶液时，一部分光被溶液吸收，其余的光透过溶液，我们把透射光强度与入射光强度的比值称为透光度或透光率。用“T”表示。则：T=It/I0 透光度T还常用百分透光率表示：T%=T100%溶液的透光度越大，表示它对光的吸收越小；反之，透光度越小，表示它对光的吸收越大。常用吸光度来表示物质对光的吸收程度，其定义为：A=-gT=lg1/T=lg(I0/It),（3）Lambert定律 该定律是由Lambert于1760年提出的，他在研究物质对光的吸收时发现，如果溶液的浓度一定，则光的吸收程度与液层的厚度成正比，这个关系称为Lambert定律。A=k1b A-吸收
11、度；k1-比例系数；b-液层厚度或收光程长度。,（4）Beer定律 该定律是由Beer于1852年研究发现的，Beer研究了各种无机盐水溶液对红光的吸收，从而得出这样一个结论：当单色光通过液层厚度一定时，溶液的吸光度与溶液的浓度成正比。表示为：A=k2c k2-比例常数；c-溶液浓度。,（5）Lamber-Beer定律 同时考虑溶液的浓度和液层厚度这两个因素，如果同时变化，那么都影响物质对光的吸收，所以两个定律合并在一起，称为Lamber-Beer定律，即表示为：A=abc a 是一个新的比例常数，称为吸光系数。液层厚度用“cm”表示，浓度以“g/L”为单位。因为A是无因次量，则的单位是“L/
12、gcm”。通常浓度以mol/l为单位，此时吸光系数称为摩尔吸光系数，用“”表示，单位为“L/molcm”,所以Lamber-Beer定律也可以表示为：A=bc 物理意义：当束平行单色光通过单一均匀的、非散射的吸光物质溶液时，溶液的吸光度与溶液浓度和液层厚度的乘积成正比。这个定律是各类吸光光度法定量分析的基础。,（6）最重要的引起偏离比耳定律的因素:(一）由于非单色光引起的偏离（二）由于溶液本身的化学和物理因素引起的偏离,（三）比尔定律只适用于稀溶液，是一个有限定条件的定律。在浓度高于0.01mol/L时，吸收组分间平均距离减小，电荷分布改变，发生改变，吸收给定波长的能力改变。,一、主 要 部
13、件,光源,单色器,样品室,检测器,显示器,紫外可见吸收光谱法,1.光源,在整个紫外光区和/或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命,可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在3202500nm 紫外光区：氢、氘灯，发射波长范围在185400nm,D2 灯,H2 灯,200 250 300,/nm,相对辐射功率,2.单色器,入射狭缝：光源的光由此进入单色器；准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束；,色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅；聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；出射狭缝。,将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出
14、任一波长单色光的光学系统。,3.样品室,又称吸收池放置各种类型的比色皿和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池,4.检测器,利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管（CCD）。,检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理,文件存储、峰形处理、对数或微积分函数运算、,5.结果显示记录系统,二、分光光度计的类型 types of spectrometer,1.单光束分光光度计从光源到检测器只有一束单色光。简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度A/T，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器
15、具有很高的稳定性,（一）几种光路类型,准直镜,测量方便，不需要更换吸收池 减少了光源强度不稳定性的影响 实现了快速自动吸收光谱扫描,2.双光束分光光度计,旋转扇面镜，单色光被旋转扇面镜分成交替的两束光，分别通过样品池和参比池,将不同波长的两束单色光(1、2)快束交替通过同一吸收池而后到达检测器。产生交流信号。无需参比池。=12nm。两波长同时扫描即可获得导数光谱。,3.双波长分光光度计,通过切光器使两束不同波长的光交替通过吸收池，测得吸光度差A。AB1和AB2分别为在1和2处的背景吸收，当1和2 相近时，背景吸收近似相等。二式相减，得这表明，试样溶液浓度与两个波长处的吸光光差成正比。特点：不需
16、参比液(消除了由于参比池的不同和制备空白溶液等产生的误差)。,单光束 双光束（空间分隔）双光束（时间分隔）特点：因光束几乎同时通过样品池和参比池，因此可消除光源不稳产生的误差。,4.多光道二极管阵列检测的分光光度计,光经全息光栅表面色散并投射到二极管阵列检测器上，可在极短的时间内获得180820nm的全光光谱。,二极管阵列分光光度计光路图l.光源：钨灯或氘灯 2，5.消色差聚光镜 3光闸 4吸收池 6入口狭缝 7全息光栅 8二极管阵列检测器,第三节 紫外-可见分光光度分析方法,一、定性分析 qualitative analysis,有机化合物对紫外光具有吸收光谱特征：形状、峰的数目、波长位置及
17、max（化合物特性参数），可作为定性依据,反映结构中生色团、助色团特性，不能够完全反映分子特性。结构相同的化合物一定具有相同的吸收光谱，但吸收光谱相同的却不一定是相同的化合物,对比法：试样与其标准品或标准谱图库：46000种 The sadtler standard spectra,Ultraviolet,1.对比吸收光谱特征数据：,2.对比吸光度的比值：,3.对比吸收光谱的一致性：,max：是特征常数而加以区别,max：峰、峰数、峰肩和峰谷,我国药典VB12的鉴别：1.701.88=A361/A278；3.153.45=A361/A550,同样条件下，Overlay,二、单组分的定量分析,依
18、据Beer定律：A=c b，物质在一定波长处的吸光度与它的浓度成正比,波长选择：无干扰处的max处，一般躲开短波端的吸收峰，注意溶剂本身的吸收,1.吸光系数法（绝对法）：,、a或E可从手册查到注意：当单色光不纯、仪器型号的差异等会带来较大误差,2.校正曲线法（相对法）：,固定仪器、工作条件和测定条件，用待测物质的标准品配制一系列浓度不同的标准溶液，绘制Ac标准工作曲线。在相同条件下测定样品溶液的A，从曲线上查或用线性方程计算样品溶液的c,Y=0.010+0.091X，R=0.9996,4.895mmol/L,3.对照法（相对法）：,固定仪器、工作条件和测定条件，分别测量Ax和As：As=b c
19、s Ax=b cx,四、紫外吸收光谱法用于有机化合物 分子结构的研究,有机化合物的紫外吸收光谱可获得的结构信息,（4）共轭体系：200-250nm有强吸收峰(104)，K带230nm 大键，红移并吸收增强。-不饱和醛酮：K带240nm，R带310-350 nm。,（1）200-400nm 无吸收峰：饱和化合物，单烯,（2）含孤立助色团的饱和有机化合物：n*红移,（3）含孤立生色团的有机化合物：n*n*,醛、酮 n*跃迁产生的R带,确认max，并算出，初步估计属于何种吸收带；观察主要吸收带的范围，判断属于何种共轭体系；(3)了解溶剂的极性与pH值的影响,光谱解析注意事项,（5）芳环的特征吸收：具
20、有精细结构的特征 B 带，还有E1和E2带。苯环增加取代基后，红移并吸收增大。吸电子基和斥电子基有所不同 助色团和生色团也不同,(4)立体结构和互变结构的确定,顺式：max=280nm；max=10500反式：max=295.5 nm；max=29000共平面产生最大共轭效应，max大,互变异构：,酮式：max=204 nm；无共轭 烯醇式：max=243 nm,样品的采集,(一)、采样要求 进行食品检验，是在整批被检食品中抽取一部分作为检验样品，而对样品进行检验的结果用来说明整批食品的性状。因此，采样时必须注意样品的代表性和均匀性。要认真填写采样记录。写明样品的生产日期、批号、采样条件、包装
21、情况等，并填写检验项目及采样人。,样品的采集,(二)、采样数量和方法采样数量应能反映该食品的质量和满足检验项目对试样量的需要，一式三份，供检验、复验、备查或仲裁，一般散装样品每份不少于0.5Kg。鉴于采样的数量和规则各有不同，一般可按下述方法进行。,(1)液体、半流体饮食品。如植物油、鲜乳、酒或其它饮料，如用大桶或大罐盛装者，应先行充分混匀后采样。样品应分别盛放在三个干净的容器中，盛放样品的容器不得含有待测物质及干扰物质。,样品的采集,(2)粮食及固体食品应自每批食品的上、中、下三层中的不同部位分别采取部分样品混合后按四分法对角取样，再进行几次混合，最后取有代表性样品。,(3)肉类、水产等食品
22、应按分析项目要求分别采取不同部位的样品或混合后采样。,(4)罐头、瓶装食品或其它小包装食品，应根据批号随机取样。同一批号取样件数，250g以上的包装不得少于6个，250g以下的包装不得少于10个。掺伪食品和食物中毒的样品采集，要具有典型性。,样品的采集,由于食品数量较大，而且目前的检测方法大多数具有破坏作用，故不能对全部食品进行校验，必须从整批食品中采取一定比例的样品进行校验。从大量的分析对象中抽取具有代表性的一部分样品作为分析化验样品，这项工作即称为样品的收集或采样。食品的种类繁多，成分复杂。同一种类的食品，其成分及其含量也会因品种、产地、成熟期、加工或保藏条件不同而存在相当大的差异；同一分
23、析对象的不同部位，其成分和含量也可能有较大差异。,样品的采集,从大量的、组成成分不均匀的被检物质中采集能代表全部被检物质的分析样品(平均样品)，必须采用正确的采样方法。如果采取的样品不足以代表全部物料的组成成分，即使以后的样品处理、检测等一系列环节非常精密、准确，其检测的结果亦毫无价值，甚至导出错误的结论。可见，采样是食品分析工作非常重要的环节。,样品的采集,正确采样，必须遵循以下两个原则：第一，采集的样品要均匀一致、有代表性，能够反映被分析食品的整体组成、质量和安全状况；第二，在采样过程中，要设法保持原有的理化指标，防止成分逸散或带入杂质。,样品的采集,1.采样步骤样品通常可分为检样、原始样
24、品和平均样品。采集样品的步骤一般分五步，依次如下。(1)获得检样 由分析的整批物料的各个部分采集的少量物料成为检样。(2)形成原始样品 许多份检验综合在一起称为原始样品。如果采得的检验互不一致，则不能把它们放在一起做成一份原始样品，而只能把质量相同的检样混在一起，作成若干份原始样品。,样品的采集,(3)得到平均样品 原始样品经过技术处理后，再抽取其中一部分供分析检验用的样品称为平均样品。,样品的采集,(4)平均样品三分 将平均样品平分为三份，分别作为检验样品(供分析检测使用)、复验样品(供复验使用)和保留样品(供备查或查用)。(5)填写采样记录 采样记录要求详细填写采样的单位、地址、日期、样品
25、的批号、采样的条件、采样时的包装情况、采样的数量、要求检验的项目以及采样人等资料。,2.采样的一般方法采样通常有两种方法：随机抽样和代表性取样。,(三)、检验样品的制备和保存因为采样得到的样品数量不能全用于检验，必须再在样品中取少量样品进行检验。检验样品的制备可使用四分法。即将各个采集回来的样品进行充分混合均匀后，堆为一堆，从正中划“十”字，再将“十”字的对角两份分出来，混合均匀再从正中划“十”字，这样直至达到所需要的数量为止即为检验样品。,样品的处理,食品的组成是复杂的，在分析过程中各成分之间常常产生干扰；或者被测物质含量甚微，难以检出，因此在测定前需进行样品处理，以消除干扰成分或进行分离、
26、浓缩。样品处理过程中，既要排除干扰因素，又不能损失被测物质，而且使被测物质达到浓缩，以满足分析化验的要求，保证测定获得理想的结果，因此，样品处理在食品理化检验工作中占有重要的地位。,样品处理的目的有三个：1.使被测成分转化为便于测定的状态；2.消除共存成分在测定过程中的影响和干扰；3.浓缩富集被测成分。,样品处理时按照食品的类型、性质、分析项目，采取不同的措施和方法，常用的方法有：,一、食品中的重金属检测1、食品中检测的重金属通常包括:铅、锌、锰、铜、镉、铬、砷、镍等，这些元素及离子都能采用紫外-可见分光光度法检测。,GB 5009.12-2010 食品安全国家标准 食品中铅的测定GB 5009.75-2014 食品安全国家标准 食品添加剂中铅的测定GB 5009.11-2014 食品安全国家标准 食品中总砷及无机砷的测定GB 5009.76-2014 食品安全国家标准 食品添加剂中砷的测定,二、食品中有机物检测1、GB 5009.33-2016 食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定2、GB/T 18932.6-2002 蜂蜜中甘油含量的测定方法 紫外分光光度法3、GB/T 23195-2008 蜂花粉中过氧化氢酶的测定方法 紫外分光光度法4、SN/T 0857-2000 进出口啤酒中二氧化硫的检验方法 分光光度法,
