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1、第五章,蛋白质定量测定技术,细胞与分子生物学实验室 杜卫,根据蛋白质的性质建立的蛋白质定量测定方法,第一节 凯氏定氮法,1883年由丹麦化学家Kjeldahl建立。方法的理论基础：蛋白质中的含氮量约占其总重量的16左右(1219)，因此通过测定物质中的含氮量便可计算出物质中的总蛋白质含量(假设测定物质中的氮全来自蛋白质)。总重(蛋白质含量)=含氮量16=6.25含氮量,一、测定原理 蛋白质样品用浓硫酸消化后，可以转变成硫酸铵，硫酸铵中的NH4+又可通过蒸馏转变成NH3，用硼酸液吸收后，可由标准盐酸滴定，有含氮量求出蛋白质含量量。此方法测定范围为0.2-1.0mg氮。,(一)样品的消化 样品在1
2、05烘箱中恒重后，放入烧瓶，加入浓硫酸、催化剂硫酸铜和提高消化液沸点的硫酸钾，在电炉上消化(放于通风处)。烧瓶内容物先碳化变黑，产生大量泡沫，而后在微沸下持续68小时，待消化液变成褐色，再转变为淡蓝绿色(经过这一步，样品中的氮以NH4+的形式存在于硫酸铵中。,含氮有机物+浓H2SO4(NH4)2SO4+CO2+H2O+SO2 K2SO4 CuSO4,(二)蒸馏 蒸馏装置有多种，可任选一种。加入氢氧化钠，使硫酸铵中的NH 4+转变成氨(NH3)的形式。蒸馏后，被吸收到硼酸液中。,(NH4)2SO4+2NaOH 2 NH4 OH+Na2SO4 NH4 OH NH3+H2O,NH3+H3BO3(NH
3、4)3 BO3 混合指示剂：紫灰色 蓝绿色,(三)滴定 吸收入硼酸液中的样品，用标准的约0.01mol/L的盐酸液滴定。,(NH4)3 BO3+HCl NH4Cl+H3BO3 混合指示剂：蓝绿色 紫灰色（滴定终点）,(四)结果计算 A：滴定样品用去的盐酸的平均毫升数(3个平行样品)；B：为滴定空白用去的盐酸液的平均毫升数；C：为称量样品的克数；N：为滴定使用的盐酸的摩尔浓度；14：为氮的原子量；6.25：由氮换算成蛋白质应乘上的系数。,缺点：操作较烦、要求的技术性高、测定过程所需时间长；优点：它是唯一能测定固态和不溶物中蛋白质含量的方法，而且测定的数值较准确可靠(误差约 2)。,第二节 双缩脲
4、法,一、原理 在强碱条件下，肽键(-CO-NH-)的质子被解离，二价铜离子和失去质子的多肽链中的氮原子相结合产生稳定的紫红色络合物，在540560nm处测定其光吸收值，此值与蛋白质的含量在一定范围内呈直线关系。,二、方法(一)双缩脲试剂 硫酸铜(CuSO45H20)1.5g、酒石酸钾钠(NaKC4H44H2O)6.0g、碘化钾1g，溶于适量水中，边搅拌边加入300ml 10氢氧化钠溶液，用水稀释至1000ml。加入的0.1碘化钾能够防止铜的还原作用(即二价铜离子还原成一价铜离子，以一氧化铜的形式产生沉淀)。此试剂应贮存于塑料瓶，可长期保存，如有黑色或红色沉淀，应弃去不用。,(二)蛋白质标准曲线
5、的绘制 1蛋白质标准溶液：准确称取经过恒重的牛血清白蛋白(或人血清白蛋白、卵清蛋白、酪蛋白)作为标准蛋白质，用水配成10mg/ml的溶液。如果蛋白质不易溶解，可稍加热，或放置过夜，亦可直接用0.05mol/L的氢氧化钠溶液配制。,2标准曲线的绘制 在试管中分别加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6m1标准蛋白质溶液，用水补足至lml，各加入双缩脲试剂4ml，混合均匀，在室温(2025)放置1530分钟，在A540处测定以各管中的蛋白质含量为横坐标，A540值为纵坐标绘制标准曲线。,(三)样品的测定 取 lml未知浓度的样品溶液，同标准溶液一样加入4ml的双缩脲试剂，保温后测定A
6、540处光密度。从标准曲线上查与A540相对应的蛋白质含量。样品浓度若超过标准曲线的范围，测定前可做适当稀释。,优点：1、标准曲线的线性及重复性较好。2、硫酸铵不干扰此显色反应3、结果不因蛋白的种类不同而变化缺点：灵敏度不太高，测量范围在110mg蛋白/m1。在有大量糖类共存或含有脯氨酸的肽中，测定值可能偏低，并且不适用于不溶性样品的测定。,注意：1、Tris、蔗糖、甘油对测定有干扰。但对其浓度稍加控制，并且在标准曲线制作溶液中也含有同样的浓度，干扰问题基本可以解决。2、注意那些在 540nm处有吸收的色素干扰。3、样品中若脂质含量较高，有产生混浊的可能，需加入1.5ml乙醚或石油醚抽提一次，
7、取水层再行测定。,第三节 Fo1in-酚试剂法(Lowry法),原理 本法是双缩脲反应的发展，它结合了双缩脲法中铜盐反应和Folin试剂反应的特点。试剂A相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中的肽键起显色反应；试剂B在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应。此法是通过肽链或极性侧链的铜络合物较慢反应及芳香族氨基酸的残基，酪氨酸、色氨酸的迅速反应，把磷钼酸、磷钨酸发色团还原成暗蓝色(磷钼蓝)，颜色反应和蛋白质含量在一定范围内呈线性关系。,优点：较双缩脲法反应灵敏性提高了100倍；测定范围可在0.03-0.3mg/ml。缺点：对酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，测定的误差大，这是由它的原理所决
8、定的。,干扰因素 1、还原性物质：1）含巯基(-SH)化合物：如2-巯基乙醇、谷胱甘肽、二硫代丁四醇等 2）糖类物质：如蔗糖、果糖、木糖、氨基葡萄糖、甘油等。3）氨基酸类：游离的酪氨酸，色氨酸、胱氨酸、组氨酸等。因和Folin试剂反应，使测定值偏高。,2、核酸的一些组分：如胍、黄嘌呤、尿酸以及酚类，也能和Folin试剂反应。3、其他物质：如尿素、硫铵、乙醇、乙醚、丙酮、硝酸钠等也可产生干扰。,混匀后室温放置20 min,Folin酚试剂法(Lowry法),取7支试管,立即摇匀，30分钟后以1号试管为空白对照，在650nm处比色,操作步骤,制作标准曲线：以A650为纵坐标，标准蛋白浓度为横坐标
9、标准蛋白浓度=标准液(mL)标准液浓度（250ug/ml）/0.5,Quantitative analysis 1,Folin酚试剂法(Lowry法),根据待测样品的读数查找标准曲线求得蛋白质浓度。取血清0.1ml稀释到50ml，使其测定值在标准曲线的直线范围内。,Folin酚试剂法(Lowry法),Quantitative analysis 2,由标准管求测定管法，根据公式计算,血清蛋白含量=,A测定,A标准,标准管蛋白含量,稀释倍数,第四节 紫外分光光度法,一、原理 由于蛋白质中的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸残基中的苯环含有共轭双键，蛋白质溶液在 280nm处有一紫外吸收高峰。在一定浓度范围内
10、，其蛋白质的A280与其浓度成正比。据此可进行蛋白质定量测定。,二、方法 取适量的蛋白质溶液，以同样缓冲液做对照，用光径为lcm的石英比色杯，在280nm处测定光吸收值。280nm下，光吸收为1.0的蛋白质溶液，估算它的浓度为lmg/ml。本方法的测定范围在0.11.0mg蛋白/ml溶液。,优点：本法是对样品溶液直接进行紫外分光光度测定，测定后可完全回收，操作简单，快速，温度的影响也小。只适用于半定量或几个样品中蛋白质的相对定量，特别适用于柱层析的紫外监测，以便迅速判断蛋白质的洗脱分离情况。,缺点：1、与标准蛋白中酪氨酸、和色氨酸含量差异较大的蛋白质，测定时有一定误差。2、若样品中含有嘌呤、嘧
11、啶等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。,用280和260nm的测定法：若样品中含有最大吸收值在260nm处的核酸类物质时，会严重干扰在280nm处测定蛋白质浓度，当这类干扰物质的浓度较大，而核酸含量为蛋白质的20以下时，可测定A280和A260，并根据下列公式计算出蛋白质浓度。蛋白质浓度mg/m11.45A280 0.74A260,以A280为纵坐标，SBA浓度为横坐标，作图,图4紫外280nm光吸收法,第五节 考马斯亮蓝G250染色法,原理 1976年由Bradform建立。考马斯亮蓝G-250具有红色和蓝色两种色调，在酸性溶液中，其以游离态存在呈棕红色，当与蛋白质通过疏水作用结合后，变为
12、蓝色。色素对可见光谱的最大吸收值从465nm转移到595nm处。蛋白质含量与A595值呈正比。在0.0l1.0mg蛋白质/ml范围内。,优点：蛋白质和色素的结合反应很快速，约在2分钟左右的时间内达到平衡，在室温1小时之内是稳定的。缺点：对不同的蛋白质的相互作用有强有弱，还可引起蛋白质的不可逆变性。,器材与试剂,722型可见光分光光度试管16支标准蛋白质溶液：用牛血清清蛋白（BSA），配制成100ug/ml。考马斯亮兰G-250染料试剂：称100mg考马斯亮兰，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。,实验方法,标准方法 取10支试管，分别编号后按 表1-1
13、 剂量依次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮兰染料。每支试管加完后，立即混合。加完染料20min后，使用722分光光度计，在595nm处测量吸光度。用标准蛋白浓度（ug/ml）为横坐标，用A595为纵坐标，得到标准曲线。根据测得的未知样品的A595查表即可求得未知样品的蛋白质含量。,微量法取10支试管，分别编号后按 表1 剂量依次加入稀释的标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮兰染料。其他步骤同上,图 考马斯亮兰标准法,图 考马斯亮兰微量法,第六节 BCA法,BCA(二喹啉甲酸，bicinchoninic acid)是对一价铜离子敏感、稳定和高特异活性的试剂。,原理 在碱性溶液
14、中，蛋白质将二价铜(Cu 2+)还原成一价铜(Cu+)，后者与测定试剂中BCA形成紫色复合物，在562nm处具有最大光吸收。复合物的光吸收强度与蛋白质浓度呈正比。,试剂配制：试剂A：1BCA二钠盐，2碳酸钠，0.16酒石 酸钠，0.4氢氧化钠和0.95的碳酸氢钠，混合后，用50氢氧化钠或固体碳酸氢钠 调pH 11.25。试剂B：4硫酸铜。工作液：100倍体积试剂A与2倍体积试剂B混合。,方法 标准曲线的绘制：在试管中加入含0、20、40、60、80、100g标准蛋白溶液，用水补足到1001。加入2ml的工作液，混匀，37保温30分钟。在562nm处比色测定，绘制标准曲线。待测样品1001，如上测定，从标准曲线上查出相应的蛋白质含量。此法测定范围为10200g蛋白质/ml。,优点：BCA法操作简单，灵敏度虽与Folin-酚试剂法相似，但它的试剂十分稳定，因此对时间控制不需要那么严格。显色后，1小时内读A562值无变化。抗干扰的能力强，如去污剂SDS、Triton X-100、4mol/L盐酸胍、3mol/L尿素对测定均无影响。缺点：反应时间较长，蛋白质发生不可逆变性。,
