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1、正交设计优化蛹虫草液体菌种培养基的研究引言蛹虫草Cordyceps militaris (L.) Link，别名北冬虫夏草、北虫草，属麦角菌目、麦角菌科、虫草属(Cordyceps)，蛹虫草是该属的模式种1。蛹虫草的宿主主要为鳞翅目的蚕蛾科、舟蛾科、天蚕蛾科等昆虫2，它是由昆虫的蛹体与子座两部分组成的复合体。昆虫的蛹冬季蛰居土里，蛹虫草的菌丝寄生其中吸收营养，最后其体内充满菌丝而死。到了夏季，自其尸体之上生出子座，形似草，夏至前后采集而得。蛹虫草的生态适应幅度大，因而在北回归线以南大多数地区均有分布，从真菌区系上看，蛹虫草是一种世界性分布的广布种，也是我国分布最广的虫草之一。蛹虫草在我国主要分
2、布在吉林、辽宁、陕西、广东、河南等地3，生于针、阔叶林或混交林地表土层中鳞翅目昆虫的蛹体上。国内外研究证实，氨基酸是蛹虫草和虫草具有补益作用的重要物质基础。蛹虫草所含的蛋白质由19种氨基酸组成，不仅含有人体必须的全部8种必需氨基酸，而且含量较高，蛹虫草所含的必需氨基酸占氨基酸总量的35.47%。目前已查明蛹虫草含有21种微量元素，其中硒、铁、锌、锰、钼、钙等有益元素含量丰富；所含维生素类物质，如VA、VB12、VE、VD3、VB1、VB6及VC等含量显著超过天然冬虫夏草。国外研究资料报道，从蛹虫草人工培养液中也分离出虫草素。另外，蛹虫草中还含有麦角甾醇、D-甘露醇、腺嘌呤、尿嘧啶、腺苷、蛹虫草
3、多糖、生物碱等活性物质。近年来研究证明，蛹虫草所含虫草活性成分如虫草酸、虫草素、虫草多糖、超歧氧化酶(SOD)、腺苷等含量明显高于天然冬虫夏草，因此具有十分重要的营养、滋补及药用价值，被誉为是虫草属真菌中的后起之秀。蛹虫草所含虫草活性成分非常丰富，如多糖。多糖作为生命物质基础的重要组成部分，广泛参与细胞的各种生命活动及生理过程的调节。宾文等研究表明，多糖能够调节免疫细胞间信息的传递与感受、细胞的转化、分裂及再生等活动，具有抗炎、抗肿瘤作用2。孟兆丽等通过研究蛹虫草多糖对小鼠的特异性、非特异性免疫的影响，表明多糖对小鼠的特异性、非特异性免疫均有显著增强作用，同时多糖还能通过免疫调节，达到治疗或控
4、制肿瘤的目的；且多糖有促进SOD酶活力的作用，对延缓衰老有显著意义。孟兆丽等还用杯碟法研究了蛹虫草多糖对铜绿假单孢菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌和四链球菌等的抑菌效果，表明蛹虫草多糖对金黄色葡萄球菌、四链球菌等革兰氏阳性菌的生长具有抑制作用，对铜绿假单胞菌和大肠埃希氏菌等革兰氏阴性菌无作用。第四军医大学药理教研室和汉中市医学科学研究所进行的急性和亚急性毒性实验，证明长期服用蛹虫草无蓄积作用，对主要器官亦无明显损害。其水浸液制剂进行的初步实验证明，其部分药理作用与冬虫夏草基本一致，主要有明显地抑制小鼠的自主活动，与戊巴比妥钠有协同催眠效应，拮抗戊四氮及咖啡因引起的惊厥以及增加氯胺酮的中枢抑制效
5、果，亦有提高小鼠耐缺氧能力的作用。说明蛹虫草有与冬虫夏草相同的镇静、催眠、抗缺氧、抗惊厥的药理作用，另蛹虫草有抗实验性心律失常作用4。第四军医大学药理教研室的实验还发现蛹虫草在小剂量时，可表现较强的抗疟活性，与氯喳作用强度相近。已有许多研究认为蛹虫草可作为冬虫夏草的替代品，其虫草素含量为冬虫夏草的数十倍。虫草素具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤，以及抗疲劳、抗衰老、提高人体免疫力等显著功效5。而蛹虫草是获得虫草素的主要来源。由于野生蛹虫草的生长环境不断受到破坏，资源日益贫乏，此时人们开始寻求人工培养蛹虫草的方法，以适应其有效成分的工业化生产。自20世纪50年代以来，国内外众多科研机构，开发部门投入了大量
6、的人力和物力，对蛹虫草的人工栽培技术进行了攻关研究，到80年代中期就成功实现了蛹虫草的人工栽培，从而使我国成为世界上首次利用虫蛹等为原料批量培养蛹虫草子实体的国家。经检测，人工培养蛹虫草的主要营养与药用成分均与野生蛹虫草的含量相当甚至更高。在虫草属中，蛹虫草独特的医疗保健，成为国内外真菌界、医疗界、生物界、食品界等部门多年来研究开发的重点。经过多年研究，蛹虫草已可进行规模化人工培养。人工栽培蛹虫草的基本方法是：（1）采得新鲜野生蛹虫草，从其子实体上用组织分离法培养得到菌种；（2）将菌种接种到消毒灭菌的米饭或小麦粒培养基上，能够得到与自然菌丝形态特征一致的子实体；（3）再将此菌接种到表面消毒的蚕
7、蛹体上，或人工培养基上即可。在蛹虫草的研究和培养过程中，液体菌种的应用越来越普遍6-7。用液体菌种栽培蛹虫草和用试管母种、固体原种栽培相比，菌丝长满料瓶的时间分别缩短15.1 d和9.7 d，生物转化率分别高19.3倍和5.2倍。用试管母种和固体原种栽培蛹虫草，不但菌丝生长慢、子实体产量极低，而且出菇稀疏不整齐，基本上不能收第2潮菇。用液体菌种栽培蛹虫草，不但菌丝生长快、产量高，且出菇整齐，能收2潮子实体，第2潮菇产量约占总产量的24.1%8。 综上所述，为了缩短蛹虫草生产周期，降低生产成本，需进一步加强液体菌种的研究。然而，不同浓度梯度的碳氮源培养的蛹虫草液体菌种，在性状上有何差异，使用效果
8、如何，研究报道较少。本试验对蛹虫草菌种液体培养基进行优化研究。以菌丝球数量、形态和菌丝体干重为指标，首先对培养基的碳、氮源浓度进行单因素试验，再以得到的最优碳、氮源浓度综合KH2PO4、MgSO4进行正交试验，进而得出最优液体菌种培养基配方。该研究筛选出蛹虫草液体菌种培养基最佳碳源和氮源以及最佳配方具有一定的理论与实际意义9。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 供试菌种蛹虫草菌种1.1.2 药品与试剂 马铃薯，葡萄糖，蛋白胨，琼脂，磷酸二氢钾，硫酸镁等。1.1.3 培养基斜面种子培养基：采用PDA培养基。马铃薯 200 g/L，葡萄糖 20 g/L，琼脂 20 g/L，水1000 mL ，p
9、H自然。种子平板培养基：同斜面种子培养基液体基础培养基10.：葡萄糖 20 g/L，蛋白胨10 g/L，KH2PO4 2.0 g/L ，MgSO4 1.0 g/L，水1000 mL。1.1.4 主要仪器设备JA5002 电子天平 上海精密电子仪器有限公司 全自动立式电热压力蒸汽灭菌锅 山东新华医疗器械厂超净工作台 苏州安泰公司制造HHB11电热恒温培养箱 天津三水科学仪器有限公司ZHWY-2102型摇床 上海智诚分析仪器制造有限司循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司HHB11-600S型电热恒温干燥箱 天津市华北仪器有限公司1.2 方法1.2.1 菌种活化称取200 g马铃薯，洗净去皮切
10、碎，加水1000 ml煮沸15-20 min，用4-6层纱布过滤，再加入20 g葡萄糖和20 g琼脂，充分溶解后趁热分装到试管中，每支试管约分装10 mL。然后用双层报纸封口，捆扎成把后用高压灭菌锅灭菌。灭菌过程中，当压力升至于0.05 Mpa排两次冷空气，然后再121温度下灭菌30 min。灭菌结束后，当压力回到0时，取出摆放斜面，充分冷却后置于通风干燥处备用。在超净工作台上进行接种，用接种钩从原始菌种斜面中取一块约6 mm见方的菌种块，转入另一支斜面试管中，置于25 培养箱中培养，待菌丝长满斜面后备用。1.2.2 菌种同步制取PDA平板培养基，当平板内培养基凝固后，在无菌条件下将活化后的蛹
11、虫草斜面菌种接种到PDA平板中央，每皿接种1块直径约6 mm的菌种块，置于25 恒温培养箱中培养，待菌丝长满平皿后备用。菌种同步的目的是为了保证接种时接种量和种子菌龄趋于一致，最大限度地减少实验误差。1.2.3 液体培养基制备 1.2.3.1 碳源实验根据文献报道及前期工作，葡萄糖是蛹虫草菌丝生长的最适碳源。本试验主要进行不同葡萄糖浓度对菌丝生长的研究。在基础培养基的基础上，维持氮源蛋白胨浓度10 g/L和无机盐浓度不变，试验设9个处理，即葡萄糖浓度依次为0、5、10、15、20、25、30、35和40 g/L，分别标注为C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9。每处理3个重复。每
12、个250 mL瓶装液量100 mL。培养基配方见表1。表1 碳源培养基配方 （单位：g/L）试验次数123456789葡萄糖浓度05101520253035401.2.3.2 氮源实验根据文献报道及前期工作，蛋白胨是蛹虫草菌丝生长的最适氮源。本试验主要进行不同蛋白胨浓度对菌丝生长的研究。在基础培养基的基础上，维持碳源葡萄糖浓度20 g/L和无机盐浓度不变，试验设9个处理，即蛋白胨浓度依次为0、2、4、6、8、10、12、14、16 g/L，分别标注为N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9。每处理3个重复。每个250 mL瓶装液量100 mL。培养基配方见表2。表2 氮源培养基配方
13、 （单位：g/L）试验次数123456789蛋白胨浓度02468101214161.2.4 接种待菌丝长满培养皿时，在超净工作台上，用无菌打孔器沿菌落边缘半径相同处取直径约6 mm的菌种块，用接种钩将菌种块接种到三角瓶中，每瓶接4个菌种块。用打孔器的目的是保证每瓶的接种量一致。接种过程中严格按照无菌操作规程进行操作。1.2.5 摇床培养接种后把报纸取下，只保留八层纱布，首先在26 恒温箱中静置培养24小时，以利于菌种萌发。然后置于恒温摇床中进行振荡培养。培养条件为温度26 ，转速150 r/min。48 h以后每天观察菌丝的生长状况。培养5 d后测菌丝体干重。1.2.6 蛹虫草液体菌种数量、大
14、小测定11-12 振荡培养的培养液，24 h后开始产生菌丝球，48 h后每天观测记录菌丝球大小及数量。测量方法：将培养液混匀后，用口径较大的移液管移取一定量的培养液于干净的平板上，观察菌丝球的形态并记录菌丝球的数量和直径，测量时重复3次求平均值。1.2.7 蛹虫草菌丝体干重的测定1.2.7.1 菌丝体的提取工艺发酵醪真空抽滤菌丝体干燥在真空抽滤机上放上干净的滤布，开启抽滤机，将发酵醪倒在滤布上进行抽滤。然后用蒸馏水冲洗3遍，抽滤至不滴水即可，将菌丝体刮移至在已烘干和称重的培养皿上。 1.2.7.2 菌丝体干重的测定13 先将烘干的平板称取重量mL，将分离出的菌丝体放入平板中，于干燥箱中进行烘干
15、，起始温度为35 ，每隔1 h升高5 ，最高温度不超过50 。烘干过程中每隔4 h翻动1次，烘至恒重，冷却称重，记为m2并按照下述公式计算菌丝体干重。菌丝体干重（g/100 mL）= m2（g）-m1（g）1.2.8 液体培养基最佳配方的筛选试验根据碳、氮源单因素筛选试验结果和菌丝球大小及数量的测定结果，以选出的最适葡萄糖浓度和氮源蛋白胨浓度以及无机盐KH2PO4和MgSO4为试验因素，设计L9 （34）正交试验，正交试验因素及水平见表3，配制9种培养基，每组试验设3次重复。以菌丝生物量为检测指标，取平均值，筛选出蛹虫草菌种液体培养基最适配方。表3 L9（34）正交试验因素及水平水平因素A/葡
16、萄糖B/蛋白胨C/ MgSO4（g/L）D/KH2PO4(g/L)1110.51.02221.02.03331.53.02 结果与分析2.1不同碳氮源浓度对蛹虫草菌丝球大小及数量的影响2.1.1 不同浓度梯度碳源培养结果振荡培养5 d后，蛹虫草在不同葡萄糖浓度的培养基上的培养结果见表4和图1。在培养过程中，随着振荡培养时间的延长菌丝球数量逐渐增多。表4 不同培养液中菌丝球形态、大小及数量的比较葡萄糖浓度发酵液颜色菌丝球边缘整齐度菌丝球大小（mm）菌丝球数量（个/3 mL）C1无色不整齐0.5-1.014C2白色不整齐3.0-4.031C3微黄整齐2.0-3.047C4淡黄整齐1.0-2.087
17、C5淡黄整齐1.0-2.0139C6淡黄整齐1.5-2.0113C7黄色整齐2.0-3.072C8黄色整齐2.0-3.060C9深黄不整齐2.0-4.041图1 不同浓度的葡萄糖对蛹虫草菌丝生长的影响1C2C3C4C5C6C7C8C9从表4和图1可以看出，在碳源试验中，当葡萄糖浓度为20 g/L（C5）时，菌丝球大小均匀，体积小而数量多，这样的液体菌种，在接种后生长点多，这是衡量液体菌种优良性状的重要标志之一；而当葡萄糖浓度为0 g/L（C1）时，菌丝球数量太少且边缘不整齐，当葡萄糖浓度为5 g/L（C2）时，菌丝球体积太大，数量少，当葡萄糖浓度为40 g/L（C9）时，菌丝球大小参差不齐而且
18、数量少，其他处理菌丝球数量也较少，它们都不适合做液体菌种。综合菌丝球的数量和菌丝球直径，当葡萄糖浓度为20 g/L（C5）时，培养获得的液体菌种质量最优。2.1.2 不同浓度梯度氮源培养结果及分析。 振荡培养5 d的液体菌种，观测结果见表5和图2。表5 不同培养液中菌丝球形态、大小及数量的比较蛋白胨浓度发酵液颜色边缘整齐度菌丝球大小（mm）菌丝球数量(个/3 mL)N1无色不整齐0.5-1.036N 2乳白不整齐2.0-3.029N 3白色整齐1.5-2.553N 4微黄整齐2.0-2.560N 5淡黄不整齐2.0-3.067N 6黄色整齐1.0-2.0129N 7黄色整齐1.0-2.0136
19、N 8黄色整齐1.0-2.0149N 9深黄不整齐2.0-3.0107图2 不同浓度的蛋白胨对蛹虫草菌丝生长的影响N1N2N3N6N4N7N9N8N5从表5和图2可见，在氮源试验中，以蛋白胨为氮源的浓度的菌种，从菌丝球数量来看，蛋白胨浓度从0 g/L（N1）-14 g/L（N8）,菌丝球数量基本呈递增关系。而当蛋白胨浓度为16 g/L（N9）时菌丝球数量反而减少。从菌丝球大小来看，蛋白胨浓度为0 g/L（N1）、10 g/L（N6）、12 g/L（N7）、14 g/L（N8）时菌丝球体积较小且大小均匀。而其他处理菌丝球大小不均，故它们都不适合做液体菌种。因此，综合考虑菌丝球的数量和直径以及菌种
20、形态，以蛋白胨浓度为10 g/L（N6）、12 g/L（N7）、14 g/L（N8）时的液体菌种较好。2.2 不同碳氮源浓度对蛹虫草菌丝球干重的影响2.2.1 不同碳源浓度对蛹虫草菌丝干重的影响众所周知，生命的基本单元氨基酸、核苷酸是以碳元素做骨架变化而来的。可以说，没有碳，就没有生命。碳元素，是生命世界的栋梁之材，是构成细胞结构最重要结构元素。碳源不仅是食用菌合成菌体细胞的必不可少的原料，而且为微生物生长、物质合成提供能量。不同碳源浓度对蛹虫草菌丝干重的影响试验结果见图3。图3 碳源浓度对菌丝体干重的影响从图3可以看出，当培养基中葡萄糖浓度为0 20 g/L时，在此范围内，菌丝体干重随着葡萄
21、糖浓度提高而逐渐提高，呈递增关系；当葡萄糖浓度为20 g/L时，菌丝体干重得率最高，可达到10.5 g/L。但随着葡萄糖浓度的继续提高，菌丝体干重反而下降。因此，以蛹虫草液体菌种菌丝体干重为指标，最适的葡萄糖浓度为20 g/L。2.2.2 不同氮源浓度对蛹虫草菌丝干重的影响氮源的基本作用是为微生物生长所需的核酸和蛋白质的合成提供原料。而蛋白质是细胞的主要组成成分，核酸是遗传物质，它们都是保持生命的基本物质。因此，氮源是蛹虫草生长所需的主要营养源。不同氮源浓度对蛹虫草菌丝干重的影响试验结果见图4。图4 氮源浓度对菌丝体干重的影响从图4可以看出培养基的蛋白胨含量从014 g/L之间，菌丝体干重呈递
22、进关系，也就是说在此范围内，菌丝生长量是随着含氮量的增加而增加的，而在蛋白胨含量为16 g/L时菌丝体干重基本与蛋白胨含量为14g/L时持平，故综合考虑产量、成本，以蛋白胨浓度为14 g/L为蛹虫草液体菌种培养基的最佳氮源浓度。2.3液体培养基的正交试验结果 根据单因素试验结果，对蛹虫草液体培养基成分进行的四因素三水平的正交试验，实验结果见表6。表6 液体培养基正交试验分析表试验号ABCD菌丝干重（g/100mL）111110.88212220.85313330.81421230.98522310.88623120.95731321.21832131.12933211.12K10.851.02
23、1.010.96K20.940.950.981.00K31.150.960.971.00R0.30.070.040.04从表6可以看出，A因素的R值最大，因素的极差越大，说明该因素的变动对试验结果的影响越大，即A因素（碳源）为最重要的营养因素。根据极值R可见，对菌丝生长影响的排序依次为：A因素B因素C因素=D因素，说明对菌丝体生物量影响最大的因素为葡萄糖浓度，其次是蛋白胨浓度，再次是KH2PO4 和MgSO4。比较不同组合之间蛹虫草菌丝体的干重，培养蛹虫草菌丝的最优组合为A3B1C3D2，100 mL 培养液的菌丝体干重达到1.21 g，明显高于其他组合。因此，最优蛹虫草液体菌种培养基配方为：
24、葡萄糖25 g/L、蛋白胨12 g/L、KH2PO4 2 g/L、MgSO4 1.5 g/L。3 小结与讨论确定培养基配方，制备品质优良的菌种是人工栽培蛹虫草的重要内容14-15。通过单因素试验，筛选出适合蛹虫草菌丝体生长的液体培养基的最佳碳氮源浓度为葡萄糖2 g/L、蛋白胨1.4 g/L。正交试验结果表明，培养基中不同营养物质对蛹虫草菌丝生长的影响效果不同，碳源是最重要的影响因素，不同营养物质对菌丝生长影响作用从大到小依次为A因素B因素C因素=D因素，即碳源氮源无机盐。通过正交试验，优化了蛹虫草液体菌种的培养基配方，以菌丝体干重为指标，蛹虫草液体菌种培养基的最佳配方为葡萄糖25 g/L、蛋白
25、胨12 g/L、KH2PO4 2 g/L、MgSO4 1.5 g/L。不过，本试验只进行了单一的碳源或氮源试验，而采用复合碳氮源进行培养的效果如何，是否更加有利于其蛹虫草菌丝体的生长，以及不同蛹虫草菌株对营养是否具有特异性等问题，都有待在以后的试验中进一步研究。参考文献1敬一兵, 陆鲁生. 虫草M. 昆明:云南科技出版社, 1986, 20-24.2敬一兵. 云南虫草初步研究J. 食用菌, 1986(1): 7-8.3李楠, 龚长虹, 张宏. 北冬虫夏草人工栽培技术研究及保健品研制J. 长春师范学院学报, 2001,20(1): 36-37.4温鲁, 尹起范, 唐玉玲,等. 蚕虫草与有关虫草活
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29、 大学关于收集、保存、使用毕业设计（论文）的规定，即：按照学校要求提交毕业设计（论文）的印刷本和电子版本；学校有权保存毕业设计（论文）的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢利为目的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。作者签名： 日 期： 学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担
30、。作者签名： 日期： 年 月 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。涉密论文按学校规定处理。作者签名：日期： 年 月 日导师签名： 日期： 年 月 日致 谢时间飞逝，大学的学习生活很快就要过去，在这四年的学习生活中，收获了很多，而这些成绩的取得是和一直关心帮助我的人分不开的。首先非常感谢学校开设这个课题，为本人日后从事计算机方面的工作提供了经验，奠
31、定了基础。本次毕业设计大概持续了半年，现在终于到结尾了。本次毕业设计是对我大学四年学习下来最好的检验。经过这次毕业设计，我的能力有了很大的提高，比如操作能力、分析问题的能力、合作精神、严谨的工作作风等方方面面都有很大的进步。这期间凝聚了很多人的心血，在此我表示由衷的感谢。没有他们的帮助，我将无法顺利完成这次设计。首先，我要特别感谢我的知道郭谦功老师对我的悉心指导，在我的论文书写及设计过程中给了我大量的帮助和指导，为我理清了设计思路和操作方法，并对我所做的课题提出了有效的改进方案。郭谦功老师渊博的知识、严谨的作风和诲人不倦的态度给我留下了深刻的印象。从他身上，我学到了许多能受益终生的东西。再次对
32、周巍老师表示衷心的感谢。其次，我要感谢大学四年中所有的任课老师和辅导员在学习期间对我的严格要求，感谢他们对我学习上和生活上的帮助，使我了解了许多专业知识和为人的道理，能够在今后的生活道路上有继续奋斗的力量。另外，我还要感谢大学四年和我一起走过的同学朋友对我的关心与支持，与他们一起学习、生活，让我在大学期间生活的很充实，给我留下了很多难忘的回忆。最后，我要感谢我的父母对我的关系和理解，如果没有他们在我的学习生涯中的无私奉献和默默支持，我将无法顺利完成今天的学业。致 谢四年的大学生活就快走入尾声，我们的校园生活就要划上句号，心中是无尽的难舍与眷恋。从这里走出，对我的人生来说，将是踏上一个新的征程，
33、要把所学的知识应用到实际工作中去。回首四年，取得了些许成绩，生活中有快乐也有艰辛。感谢老师四年来对我孜孜不倦的教诲，对我成长的关心和爱护。学友情深，情同兄妹。四年的风风雨雨，我们一同走过，充满着关爱，给我留下了值得珍藏的最美好的记忆。在我的十几年求学历程里，离不开父母的鼓励和支持，是他们辛勤的劳作，无私的付出，为我创造良好的学习条件，我才能顺利完成完成学业，感激他们一直以来对我的抚养与培育。最后，我要特别感谢我的导师刘望蜀老师、和研究生助教吴子仪老师。是他们在我毕业的最后关头给了我们巨大的帮助与鼓励，给了我很多解决问题的思路，在此表示衷心的感激。老师们认真负责的工作态度，严谨的治学精神和深厚的理论水平都使我收益匪浅。他无论在理论上还是在实践中，都给与我很大的帮助，使我得到不少的提高这对于我以后的工作和学习都有一种巨大的帮助，感谢他耐心的辅导。在论文的撰写过程中老师们给予我很大的帮助，帮助解决了不少的难点，使得论文能够及时完成，这里一并表示真诚的感谢。
