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1、化工产品课程开发设计 -微生物法生产丙烯酸的研究进展学 院:化学生物与材料科学学院专 业： 化学工程与工艺 班 级： 080531 学 号： 姓 名： 指导老师： 第一部分 综述摘要:目前,丙烯酸工业生产都是利用石油产品丙烯氧化得到,石油的不可再生性迫使人们寻找新的替代方法,利用微生物来生产丙烯酸是个有希望的选择。该文回顾了近期利用微生物法生产丙烯酸的研究和进展,介绍了利用不同原料生产丙烯酸的方法,并对微生物法生产丙烯酸的可行性进行了展望。关键词:微生物法；丙烯酸；研究进展 前言丙烯酸是一种重要的化工基础原料,由于丙烯酸及其衍生物生产的聚合物具有无色透明、有粘性、弹性、对光稳定、不易风化等特点
2、。他们被广泛用于涂料、纺织、粘合剂、纸浆处理、上光剂、皮革、纤维、洗涤剂和超吸附材料等。丙烯酸工业生产经历了以乙炔和一氧化碳为原料的Reppe 法、丙烯腈水解法和丙烯氧化法等工艺路线。目前丙烯氧化法成为丙烯酸生产的主要途径。目前丙烯酸(酯) 都是利用石油产品来生产的。由于石油化学品是不可更新能源,并且石油产品在将来会变得更稀有和昂贵,这就迫使人们寻找新的方法来生产丙烯酸。现在,世界上的许多大公司都在努力开发大宗化学品的“绿色生产方法”,即利用生物法生产化学产品,这其中就包括丙烯酸。用微生物法生产丙烯酸适应社会可持续发展的要求,有可能替代目前利用石油化学品生产丙烯酸的方法,有利于能源的合理利用。
3、到目前为止,利用微生物法生产丙烯酸的报道还不多见。本文回顾了利用微生物法生产丙烯酸的研究和进展,介绍了利用不同原料生产丙烯酸的方法,最后对微生物法生产丙烯酸技术进行了展望1. 利用微生物转化丙烯腈生产丙烯酸1.1 该方法的研究现状对该方法的探索有两项研究见诸报导。赵孝先等从长期受工厂污水污染的河水、污泥中分离到5株能把丙烯腈转化成丙烯酸的菌株,并着重对其中的菌株613 (经初步鉴定该菌株属于假单胞菌属) 进行了研究,确定了菌株适宜的培养和酶促反应条件。该菌株最适宜的碳源是蔗糖,必须在有丙烯腈、丙腈或乙腈等存在的条件下培养,才能获得产腈水解酶的菌体,这可能是因为这些腈类化合物是产生腈水解酶的诱导
4、物;但是,腈类化合物的存在又抑制了细菌的生长,不易获得大量菌体。在一定条件下,分批补加底物丙烯腈,反应历时4h ,反应液中的丙烯酸最终浓度为0.526,另有残余丙烯腈0.02,丙烯腈的转化率为96.3% ,没有检出丙烯酰胺及其它副产物。近来,罗晖等采用诱变方法得到一株名为的菌种,该菌经过培养基和培养条件的优化能够产生高酶活的腈水解酶。优化培养条件为:温度28、摇床转速200、种子培养20h后以6%接种量接种于产酶培养基,初始摇瓶装液量为40mL ,酶活达到21.96。在含一定菌体的100mL 反应体系中,经过10h 连续43 次补加底物丙烯腈,能使产物丙烯酸的质量浓度累积到414.5。1.2
5、该方法的优缺点利用微生物转化丙烯腈生产丙烯酸,优点是:腈水解酶专一性强、反应条件温和、流程简单、副产物少、转化率高。缺点是:需要以石油产品为底物生产丙烯酸,这就限制了这种方法的工业化生产,与当前可持续发展的思路不相符。2. 利用微生物转化丙烯酰胺生产丙烯酸进行了的固定化和利用包埋生物催化剂来生产丙烯酸的研究。在乙酰胺中生长时,表现出较高的酰胺酶活性,能够转化丙烯酰胺生成丙烯酸。2.1固定化方法在正常情况下,带负电荷,能够被一些阴离子交换树脂吸附,实验表明,树脂对有很高的吸附能力,每1cm3 树脂可以吸附7. 6mg 左右干重菌体。根据细菌的特性也可以用凝胶来包埋细菌。与琼脂糖相比,由于琼脂成本
6、低、易于处理等而被选为目的凝胶。当细菌被包埋于凝胶中时,反应速率不仅依赖于细菌的选择性活性,而且依赖于载体所产生的扩散限制。随着菌体质量在凝胶中增加,存在一个反应速率点,过了这点,扩散限制就会阻碍反应速率的增加,即使再增加菌体装入量,反应速率也增加很小。这个点一般是每cm3 凝胶装载20mg 干重菌体。2.2 反应器的选择2.2.1在搅拌反应釜中丙烯酰胺到丙烯酸的生物转化为了选择合适的反应器,研究者做了一系列试验,首先选择带搅拌的反应釜作为反应器。把10包埋有菌体的琼脂颗粒(每含有20干重细菌) 加入到一个50的搅拌反应器中, 反应温度是30 , 丙烯酰胺的初始浓度是250,30后大约1/5的
7、初始丙烯酰胺(12. 5) 转化成了丙烯酸(2. 44) 。反应速率随后明显下降,因此210以后丙烯酰胺的水解率只有59 %。结果显示,较高的丙烯酰胺或丙烯酸浓度会抑制固定化生物催化剂的酰胺酶活性。分步加入丙烯酰胺比一次性加入丙烯酰胺能获得更高的丙烯酸浓度,但只是稍微提高丙烯酰胺的水解率(从59 %到66 %) ,这表明丙烯酸是一个主要的抑制剂。2. 2. 2 在柱反应器中丙烯酰胺到丙烯酸的生物转化在连续的柱反应器中,丙烯酰胺溶液在柱中流动,只有柱末端的生物催化剂暴露在高浓度的丙烯酸中,并易于被抑制。与搅拌反应器相比,柱反应器中的酰胺酶活性不会受到很大损失。装填了40用琼脂包埋的的连续柱反应器
8、,保温30 ,浓度为250的丙烯酰胺溶液以1.5流速流过柱反应器,反应30h。这些柱反应器在底物到丙烯酸的转化率大于97 %状态下可以连续操作22h ,此后转化率下降,在30h 达到60 %。与带搅拌的反应器相比,柱反应器有较大的优势,不但转化率高,而且反应时间长,产量也大。2. 3 该方法的优缺点利用转化丙烯酰胺生产丙烯酸,优点是:反应条件温和、转化率较高、反应周期较长,比如周期性的替换柱反应器末端的生物催化剂,就能够延长生产时间。缺点是:需要以乙酰胺为原料表达酰胺酶,以丙烯酰胺为底物来生产丙烯酸,乙酰胺和丙烯酰胺都是价格较高的化工原料,原料成本高,不利于工业化。3. 利用微生物法生产乳酸,
9、再脱水生产丙烯酸3. 1 乳酸发酵用发酵法生产乳酸,其商业化开始于19世纪80年代,因此,这是一个成熟的技术。利用特定的菌株通过发酵法可以生产所需要的乳酸,此方法碳源来源广泛,如玉米、大米、甘薯等淀粉质原料。在厌氧发酵过程中,以葡萄糖作为碳源时,乳酸的转化率可达100 % , 但实际的转化率接近90 % ( 质量)。厌氧发酵中葡萄糖到乳酸的代谢平衡关系如下:（葡萄糖）（乳酸）目前还出现了利用细胞循环膜反应器连续发酵生产乳酸的新技术,相比之分批补料发酵来说,产率有很大提高。3. 2 乳酸的分离纯化发酵过程的成本控制决定于从培养基中回收乳酸方法的发展,因为分离和纯化步骤占产品成本的50 %左右。尽
10、管乳酸与水的沸点有很大不同,但也不可能获得纯的乳酸晶体。原因在于乳酸与水有较高的亲和性,当乳酸浓度高到一定程度时,就会形成乳酸二聚体。在过去的几十年,人们试图降低乳酸的回收成本和对环境的影响。利用不同的分离技术如反应萃取、膜分离、离子交换和反渗透等来进行乳酸分离的研究,并且取得了一定的进步, 但每一种都有各自的优缺点。3. 3 通过化学反应使乳酸脱水生成丙烯酸在乳酸分子上有一个羟基和羧基,所以,能够把乳酸转化成不同的产品,如乙醛、丙烯酸、丙烯乙二醇、戊烷和聚乳酸等。由于这些产物在生物可降解聚合物和其它化合物的生产中的重要应用,所以乳酸除了在食品工业上的传统应用外,还是一种重要的化学品。在这些化
11、合物中,丙烯酸及其酯类衍生物具有特别重要的作用8 。乳酸催化脱水得到丙烯酸,乳酸转化成丙烯酸的反应式如下:3. 4 利用生物转化从乳酸生产丙烯酸乳酸通过化学催化脱水可以生成丙烯酸,但化学过程的缺点是要求高温,并且丙烯酸产率也不高。发现在厌氧发酵过程中,乳酸直接还原可以生成丙烯酸。乳酸在转移酶的催化下先生成乳酰,然后在乳酰脱水酶的催化下生成丙烯酰 ,然后脱去就生成丙烯酸,然而只有在丙酰脱氢酶被阻止时丙烯酸才有可能积累,因为丙酰会催化丙烯酰生成乙酸。有人发现3-丁炔酸() 是一种丙烯酸的结构类似物,能够抑制丙酰脱氢酶的活性。和研究了添加3-丁炔酸对于丙烯酸积累的影响。3. 5 该方法的优缺点利用微
12、生物法生产乳酸,然后再通过化学催化剂或生物催化剂催化乳酸脱水生产丙烯酸的技术。其优点是:乳酸的发酵技术已经很成熟,可以提供充足的高质量乳酸。缺点是:化学催化乳酸脱水生产丙烯酸需要高温、高压,且转化率不高;生物催化的产率也不高,所以直到现在,还没有实现从乳酸到丙烯酸的工业化。4. 利用微生物由糖直接生产丙烯酸4. 1 丙烯酸的产生以上所讨论的技术都是间接微生物法生产丙烯酸,下面介绍几种以糖作为碳源直接生产丙烯酸的方法。提出了一种生产丙烯酸的方法,他们把和 共培养,先把糖转变为丙酸,然后在电子受体如亚甲兰存在时利用继续转化丙酸成为丙烯酸盐,丙酸到丙烯酸盐的转化率在18. 5 %左右。发现在树署粉上
13、生长时可以短暂地积累0. 2的丙烯酸酯。荷兰代尔夫特大学的等设计了以蔗糖作为碳源利用微生物发酵生产丙烯酸的路线。4. 2 丙烯酸的分离由于丙烯酸有抑菌作用,丙烯酸在发酵体系中积累浓度不能太高,必须从反应体系中分离。研究者假设发现一种微生物利用糖作为碳源能够生成50的丙烯酸,据此设计了一个流程,包括所有质量和能量流量,还有装置和控制如图:分离过程采用连续化操作,第二个蒸馏釜的馏出物就是丙烯酸。经济评估表明所设计的流程是可行的,这会激励以微生物生产丙烯酸的研究发展,并且努力设计合理的流程,特别是考虑了可持续发展的设计路线。4. 3 该方法的优缺点微生物直接利用糖类物质生产丙烯酸,优点是:培养、分离
14、工艺流程简单,条件要求低,所需成本低,是最有吸引力的方法。缺点是:目前丙烯酸产率比较低,需要筛选或利用基因克隆技术获得高产丙烯酸的新菌株。5. 微生物法生产丙酸酸的前景近几年,原油价格持续上涨,一度突破70 美元P桶。目前丙烯酸的生产都是利用丙烯氧化得到,丙烯又是以石油为原料生产的,这足以让人们认识到开发可替代化学品的必要性和紧迫性。利用微生法生产丙烯酸是一个非常有希望的途径。从目前已发表的文献来看,还没有报道利用微生物直接或间接生产丙酸酸的可行的工业化路线,存在的主要问题是:(1) 丙烯酸的产率较低; (2) 有些原料不是可再生能源,不利于工业化。作者认为可以从以下两个方面努力,一是研究开发
15、新型的化学催化剂催化乳酸生产丙烯酸,因为乳酸的生产已经很成熟。新型的催化剂应该能够在较低条件下高效转化乳酸生成丙烯酸,如果能够实现乳酸到丙烯酸高效的化学转化,将很有希望实现工业化。二是利用基因工程方法构建一个菌株,这个菌株能够高效转化糖类生产丙烯酸,或者能转化乳酸成为丙烯酸。这个路线应该是微生物法生产丙酸酸的最有吸引力和最具挑战性的思路。由于现代分子生物学和基因克隆技术的发展,很有希望能构建出这样的菌株,那么丙烯酸的生产也将会实现可持续发展。第二部分 生产部分 1. 反应机理丙烯酸是一种用量很大、用途广泛的精细化工产品,作为石油工业的下游产品,主要用于工业上生产丙烯酸酯类、共聚单体丙烯酸丁酯和
16、乙酯,以及用于生产高吸水性树脂,还可用于生产聚丙烯酸酯用作增稠剂、分散剂以及流变控制剂。传统的生产方法是化学法,以石油作为原料生产,但是存在严重的污染问题,目前生物法已有研究报道。生物法采用腈水解酶催化丙烯腈直接转化为丙烯酸,该方法过程简单,副产物少,反应条件温和,符合现代化工发展的趋势。但是,生物法所面临的主要问题是腈水解酶酶活较低,催化不稳定。本研究通过菌种诱变得到一株突变菌株,该菌株可产生较高腈水解酶酶活,可用于生产丙烯酸。利用的菌种,该菌经过培养基和培养条件的优化能够产生高酶活的腈水解酶。优化培养条件为:温度28、摇床转速200、种子培养20h后以6%接种量接种于产酶培养基,初始摇瓶装
17、液量为40mL ,酶活达到21.96。在含一定菌体的100mL 反应体系中,经过10h 连续43 次补加底物丙烯腈,能使产物丙烯酸的质量浓度累积到414.5。1 实验部分1.1 菌种、培养基和主要仪器菌种为本实验室保藏的一株紫红红球菌( Rhodococcus rhodochrous) 。平板培养基(g/ L) :葡萄糖10、酵母粉3、 1、 2、 0.2、琼脂20。初始产酶培养基(g/ L) : 葡萄糖5、酵母粉5、 0.5、 0.5、 0.5 ,pH 7.2。选择性培养基( g/ L) : 葡萄糖5、 1、 2.5、 0.2、1 , 丙烯腈0.2 % , pH7.07.2。气相色谱仪GC-
18、 2010 ,日本岛津公司;8453 紫外可见光分光光度计,Agilent 公司;HYG- A 全温摇瓶柜,太仓市实验设备厂。1.2 分析方法采用气相色谱仪内标法分析底物丙烯腈、产物丙烯酸的浓度,以乙酰胺为内标。分析条件为:进样口为SPL ,温度260 ;FID 检测器,温度260 ;柱温190 ;载气为氮气,流速25 cm/ min ;分流进样,进样量0.4L ,分流比为501。以OD460 (在460 nm 处的吸光度) 测定菌体浓度。参考文献1 赵孝先,毛华,张宁,等. 利用微生物转化丙烯腈生产丙烯酸的研究J . 山东大学学报:自然科学版,1994 ,29 :217 - 223.2 罗晖
19、,王铁钢,于慧敏,等. 腈水解酶的表达和催化研究J . 现代化工,2006 ,26 (2) :109 - 111 ,113.3 John C , David S , Gary W B . Immobilization of Rhodococcus AJ270 and Use of Entrapped Biocatalyst for the Production of Acrylic Acid J . Monat2shefte fur Chemie ,2006 , 131 :655 - 666.4 钱志良,劳含章,王健,等. 工业乳酸发酵的近期进展J . 生物加工过程,2003 , (1) :
20、23 - 27.5 吕九琢,徐亚贤. 乳酸应用、生产及需求的现状与预测J . 北京石油化工学院学报,2004 , (2) : 32 - 38.6 Michael AL , Todd AW, Johnathan EH. Methods of forming alpha , beta -unsaturated acids and estersP . U . S . Pat . 6992209 (2006) .7 Dalal R K, Akedo M, Cooney CL , et al . A microbial route to acrylic ac2id productionJ . Bioso
21、urces Dig. , 1980 , 2 (2) :89 - 97.8 Sanseverino J , Montenecourt B S , Sands J A. Detection of acrylic aicdformation in Megusphuera elsdenii in the presence of 3 - butynoic acidJ . Ap2pl . Microbiol . Biotechnol . , 1989 , 30 :239 - 242.9 OBrien DJ , Konings WN , Van Dijken J P , et al . Microbial
22、export of lactic and 3 - hydroxypropanoic acid : implications for industrial fermentation processesJ . Metab Eng. , 2004 , 6 :245 - 255.10 王铁钢,罗晖,于慧敏,等. 一种腈水解酶的酶学性质研究:第二届全国化学工程与生物化工年会C . 北京:2005. 11.11 赵孝先,毛华,张宁. 利用微生物转化丙烯腈生产丙烯酸的研究J . 山东大学学报,1994 ,29 (2) :43 - 46.12 Nagasawa T,Nakamura T, Yamada H. Production of acrylic acid andmethacrylic acid using Rhodococcus rhodochrous J1 nitrilase J . ApplMicrobiol Biotechnol ,2008 ,34 :322 - 324.
