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1、优良菌种选育杂交育种,微生物优良生产菌种的特征工业菌种的育种方针自然突变选育诱变选育 杂交育种 细菌 放线菌 霉菌 酵母菌原生质体融合基因工程技术,优良菌种选育要点,4.3 杂交育种,杂交(hybridization)优点:改变亲株的遗传物质基础,扩大变异范围,使两亲株的优良性状集中于重组体内,获得新品种。丰富并促进遗传学理论的发展。,选择原始亲本诱变筛选直接亲本直接亲本之间亲和力鉴定杂交筛选重组体重组体分析鉴定。,微生物杂交育种基本程序,亲本的选择,亲本的标记和亲和力测定,二倍体形成,重组及重组体的分离,原始亲本,直接亲本,微生物杂交育种基本程序,原始亲本：具有不同遗传背景的优质出发菌株。直
2、接亲本：具有遗传标记和亲和能力，直接用于杂交配对的菌株。,杂交过程中亲本的选择,原养型重组体，MM上生长,杂交育种的遗传标记1、营养缺陷型标记 其中A株为生物素、苯丙氨酸和半胱氨酸缺陷,B株为苏氨酸、亮氨酸和硫胺缺陷型。双亲本都不能在基本培养基上生长,但杂交后代基因重组后产生营养互补的原养型重组体可在基本培养基上生长2、抗性标记3、温度敏感性标记4、其他性状标记,A株,B株,4.3 杂交育种,细菌放线菌霉菌酵母菌,细菌杂交方式,F因子：是一种质粒，存在与细胞质中，一般以游离状态，有时又和染色体以结合状态存在，是一种稳定的遗传物质。为环状DNA双链结构。上面有编码细菌产生性菌毛及控制接合过程进行
3、的20多个基因。,机制,(大肠杆菌的接合机制),接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导,接合（Conjugation）,“雄性”菌株（F+），,“雌性”菌株（F-），,有性菌毛,F+,接合（Conjugation）,杂交的方法，直接混合法,分别培养直接亲本菌株,至对数期离心，洗涤，加新鲜培养液混合，离心，放置：让亲本菌株间的染色体进行连接、交换和重组稀释，涂布于平皿筛选,杂交的方法，滤纸上混合,将两个直接亲本菌株,分别培养至对数期取同样量混合，过滤在滤膜上将滤膜（菌面朝上）平放在平板培养基上置于37培养,让亲本菌株间结合，染色体进行连接、交换和重组此法的效率比液体混合法效率高。,4.3 杂交育
4、种,细菌放线菌霉菌酵母菌,、放线菌的杂交育种,基因重组过程近似细菌，育种方法与霉菌相似放线菌的遗传体系和杂交原理：异核现象：同一细胞（菌丝）含不同基因型的染色体接合现象：发生部分染色体转移（交换），形成部分合子异核系的形成：部分合子产生的无性繁殖系。染色体融合能在基本培养基上生长重组体的形成：异核系不稳定。经过重组，分离，得到重组子,部分合子,异核系,重组体,染色体连接,亲本分离子,A,B,A,B,异核体,异核现象,混合培养,放线菌杂交过程,结合现象,染色体重组分离,放线菌的杂交技术,放线菌杂交方法:(一)平板杂交法（测定亲和性）(二)混合培养法(三)玻璃纸法,完全培养基,影印,平板杂交法,大
5、量菌株（A组）与一个共同试验菌株（B）进行杂交用来检测亲和性,基本培养基+Ap,A组Ap-，phe+,BAp+，phe-,影印,A组和B的重组体,原养型重组体，MM上生长,A株,B株,混合培养法和细菌一样,玻璃纸：有微孔可以吸收玻璃纸下的营养,玻璃纸法,AAp-，phe+,BAp+，phe-,玻璃纸,玻璃纸,完全培养基,基本培养基（Ap+）,异核系,在显微镜下收集异核系的菌丛,重组体,基本培养基,4.3 杂交育种,细菌放线菌霉菌酵母菌,、霉菌的杂交育种,在固体培养基上的一些形态,霉菌杂交育种是利用准性生殖过程中的基因重组和分离现象。准性生殖过程：不通过有性生殖的基因重组过程。将不同菌株的优良特
6、性集合到一个新菌株中。原理和技术和放线菌相似,霉菌杂交的原理和杂交技术,异核体的形成：两不同性状细胞（菌丝）连接，导致一细胞存在两个不同遗传型核。杂合二倍体形成；异核体偶尔发生不同核的融合，形成杂合核，为双倍体。体细胞重组：杂合二倍体只具有相对稳定性，繁殖过程发生染色体交换，单倍化，形成各种分离子。,霉菌杂交的过程,杂合二倍体,原养型分离子,异核体,亲本,霉菌杂交的过程,A+B-,A-B+,A+B+,A+B+,A+B+,异核体,同核体:同一种基因型的细胞核 异核体:是指两个基因型不同细胞核处在同一个细胞质里,在生长过程中由对方提供所缺陷的营养因子,因而 营养得到互补。要排除喂养现象 两个具有不
7、同营养标记的亲本同时接种在一个培养基上,互相间没有接触,但十分靠近,在生长过程中,双方产生的代谢产物都为对方提供不能合成的营养物质,通过培养基渗透扩散,得到补充,可以在基本培养基上生长繁殖形成菌落这种现象称为喂养或互养。,亲和力强、明显营养标记亲和力试验可采用衔接法:将两个菌株共同接种于基本斜面培养基中若能形成异核体菌丝丛,则表明此两菌株具有亲和力,该组合即可用于杂交试验。,选择直接亲本,异核体合成方法,(a)完全培养基的混合培养法 两亲本混合接种于液体完全培养基中,适温培养1-2d,待长出菌丝后,用生理盐水洗涤,离心数次,把菌丝撕碎于基本培养基平板上,培养7-8d后,长出异核体的菌丝丛,挑取
8、其上孢子置于基本培养基斜面保存。(b)基本培养基衔接法 两亲本分别接种到基本培养基斜面两端，适温培养后,衔接部分长出异核体菌丝丛。,杂合二倍体的形成和检出,杂合二倍体的形成和诱发：异核体内自发核融合形成杂核二倍体的频率极低,一般为10-6。常以人工诱变方法来提高频率（紫外照射、高温培养、樟脑熏蒸）。杂合二倍体常常在异核体菌落上以角变或斑点形态出现。,杂合二倍体经过染色体杂交和单倍化后产生的子细胞,称为分离子。亲本分离子：基因型和直接亲本一样原养型分离子：同野生型，失去了亲本的营养缺陷型标记，能在基本培养基上生长。进入筛选程序。异养型分离子:与两直接亲本的一个相同,A+B-,A-B+,A+B-,
9、A-B+,A+B-,A-B+,A+B+,A+B-,亲本,杂合二倍体,分离子,分离子,进入筛选程序,+,or,A-B+,名词解释,野生型A+B+A+B+营养缺陷型A+B-A-B+原养型A+B+异养型A+B-A-B+原养型分离子A+B+异养型分离子A+B-A-B+亲本分离子A+B-A-B+,4.3 杂交育种,细菌放线菌霉菌酵母菌,、酵母菌的杂交育种,通常有球状、卵圆状、柱状或假丝状等多种。,啤酒酵母,酵母菌的代表属及利用价值,食品加工,（1）酵母菌属例：啤酒酵母（2）裂殖酵母属（3）假丝酵母属例：热带假丝酵母解脂假丝酵母产朊假丝酵母（4）球拟酵母属（5）红酵母属（6）掷孢酵母属,利用价值：,生产多
10、种药剂,进行石油脱蜡,生产有机酸,处理污水及综合利用,监测重金属,酵母菌的杂交育种,双单特性：存在单倍体和二倍体的生活史,二倍体生活力强，生产能力高，可通过杂交得二倍体来育种。方法：获单倍体细胞进行杂交。杂交方式：孢子与孢子；孢子与单倍体细胞；单倍体细胞间。,酵母菌的生活史,酵母菌的杂交,杂交过程包括遗传标记菌株的选择，子囊孢子诱导、接触、接合、接合子形成，直至二倍体细胞出芽为止的一系列过程。,杂交配对的菌株必须是单倍体,所以首先要得到单倍的子囊孢子，常用的孢子培养基为:无水醋酸钠0.8%,氯化钾O.2%,琼脂2%,制成试管斜面。子囊孢子获得采用蜗牛酶处理,水解子囊壁,然后剧烈振荡,释放出子囊
11、孢子,接着加人液体石蜡,摇匀后孢子就聚集于液体石蜡层。,实验室子囊孢子的获得方法,单倍体接合能力及接合型的鉴定,将获得的单倍体菌株分别与标准a型、型菌株混合培养,与标准a型菌株形成哑铃形接合子的待测菌株为 型。,标准a型,型,杂交将 a 型与 型单倍体菌株混合接种于 YEPD 液体培养基中,于 30 摇床培养,观察接合子的形成情况,培养 20 h 后收集菌体,涂布 YEPD 平板,挑取较大的单菌落,鉴定菌株的产孢能力,能够产孢的菌株为二倍体杂交株,编号保存。,细菌 放线菌 霉菌 酵母菌杂交后,筛选优良菌种,微生物优良生产菌种的特征工业菌种的育种方针自然突变选育诱变选育 原理 基本方法杂交育种 细菌 放线菌 霉菌 酵母菌原生质体融合基因工程技术,优良菌种选育要点,作业为什么对杂交亲本标记？有哪些遗传标记？原养型和野生型的区别？,本科生Bachelor,博士研究生Doctor,硕士研究生Master,老师课题实验结果论文,讲听,解决方案1结果1,解决方案2结果2,
