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1、2023/3/26,1,医学分子生物学实验技术,2023/3/26,2,第一章 蛋白质的分离与纯化,第一节 蛋白质分离纯化的一般原则,一、蛋白质分离纯化技术及其依据,2023/3/26,3,第一章 蛋白质的分离与纯化,二、蛋白质纯化的一般设计原则,1、目的蛋白的分离和纯化应该尽可能选择来源方便、成本低、易操作的组织或细胞作为原料；,2、要建立一个特异、快速、可重复、经济的目的蛋白活性检测方法；,3、蛋白质分离纯化工艺的设计应该分级分离、先粗后细的原则；,4、纯化条件要尽可能温和。,2023/3/26,4,第一章 蛋白质的分离与纯化,第二节 蛋白质的层析(chromatography)分离,一、
2、层析技术的发展简史及科学意义,二、层析技术的基本原理,固定相：在层析系统分离过程中静止不动的相。,流动相：在层析系统分离过程中在载体上延一定方向移动的相。,2023/3/26,5,2023/3/26,6,2023/3/26,7,塔板理论：,把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，同时引入理论塔板数作为衡量柱效率的指标，即色谱柱是由一系列连续的、相等的水平塔板组成。每一块塔板的高度用 H表示，称为塔板高度，简称板高。,2023/3/26,8,塔板理论假设：1.在柱内一小段长度H内，组分可以在两相间迅速达到平 衡。这一小段柱长称为理论塔板高度H。2.以气相色谱为
3、例，载气进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每次进气为一个塔板体积（Vm）。3.所有组分开始时存在于第0号塔板上，而且试样沿轴（纵）向扩散可忽略。4.分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一塔板上的量无关。,2023/3/26,9,简单地认为：在每一块塔板上，溶质在两相间很快达到分配平衡，然后随着流动相按一个一个塔板的方式向前移动。对于一根长为L的色谱柱，溶质平衡的次数应为：n=L/H n称为理论塔板数。与精馏塔一样，色谱柱的柱效随理论塔板数n的增加而增加，随板高H的增大而减小。,2023/3/26,10,2023/3/26,11,2023/3/26,12,2023/3/26,13,洗脱法也
4、称冲洗法。工作时，首先将样品加到色谱柱头上，然后用吸附或溶解能力比试样组分弱得多的气体或液体作冲洗剂。由于各组分在固定相上的吸附或溶解能力不同，被冲洗剂带出的先后次序也不同，从而使组分彼此分离。流出曲线下图。,层析的展开方式,2023/3/26,14,顶替法是将样品加到色谱柱头后，在惰性流动相中加入对固定相的吸附或溶解能力比所有试样组分强的物质为顶替剂（或直接用顶替剂作流动相），通过色谱柱，将各组分按吸附或溶解能力的强弱顺序，依次顶替出固定相。很明显，吸附或溶解能力最弱的组分最先流出，最强的最后流出。顶替法的流出曲线如下图。,2023/3/26,15,2023/3/26,16,迎头法是将试样混
5、合物连续通过色谱柱，吸附或溶解能力最弱的组分首先一纯物质的状态流出，其次则以第一组分和吸附或溶解能力较弱的第二组分混合物，以此类推。流出曲线如下图。,A+B,A,2023/3/26,17,层析流出曲线及相关术语,色谱流出曲线和色谱峰 由检测器输出的电信号强度对时间作图，所得曲线称为色谱流出曲线。曲线上突起部分就是色谱峰。如果进样量很小，浓度很低，在吸附等温线（气固吸附色谱）或分配等温线（气液分配色谱）的线性范围内，则色谱峰是对称的。,2023/3/26,18,基线 在实验操作条件下，色谱柱后没有样品组分流出时的流出曲线称为基线，稳定的基线应该是一条水平直线。,峰高 色谱峰顶点与基线之间的垂直距
6、离，以（h）表示。,2023/3/26,19,色谱流出曲线色谱流出曲线和色谱峰基线（a）峰高（h）,2023/3/26,20,保留值 死时间t0 不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，它正比于色谱柱的空隙体积，如下图。,因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相流动速度相近。测定流动相平均线速时，可用柱长L与t0的比值计算，即=L/t0,2023/3/26,21,2.保留时间tr 试样从进样到柱后出现峰极大点时所经过的时间，称为保留时间，如下图。,2023/3/26,22,3.调整保留时间tr某组分的保留时间扣除死时间后，称为该组分的调
7、整保留时间，即 tr=tr t0 由于组分在色谱柱中的保留时间tr包含了组分随流动相通过柱子所须的时间和组分在固定相中滞留所须的时间，所以tr实际上是组分在固定相中保留的总时间。保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组分的保留时间常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积来表示保留值。,2023/3/26,23,4.死体积V0 指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和。当后两相很小可忽略不计时，死体积可由死时间与色谱柱出口的载气流速Fco（cm3min-1）计算。V0=t0Fco 式中 Fco为扣除饱和水蒸气压并经温度校正的
8、流速。仅适用于气相色谱，不适用于液相色谱。,2023/3/26,24,5.保留体积Vr 指从进样开始到被测组分在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。保留时间与保留体积关系：Vr=tr Fco6.调整保留体积Vr 某组分的保留体积扣除死体积后，称为该组分的调整保留体积。Vr=Vr V0=tr Fco,2023/3/26,25,7.相对保留值r2,1 某组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比，称为相对保留值。r2,1=tr2/tr1=Vr2/Vr1 由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它在色谱法中，特别是在气相色谱法中，广泛用作定性的依
9、据。,2023/3/26,26,在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（s），然后再求其它峰（i）对这个峰的相对保留值，此时可用符号表示，即=tr(i)/tr(s)式中tr(i)为后出峰的调整保留时间，所以总是大于1的。相对保留值往往可作为衡量固定相选择性的指标，又称选择因子。区域宽度 色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一，用于衡量柱效率及反映色谱操作条件的动力学因素。表示色谱峰区域宽度通常有三种方法。,2023/3/26,27,1.标准偏差 即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半。2.半峰宽W1/2 即峰高一半处对应的峰宽。它与标准偏差的关系为 W1/2=2.3543.峰底宽度W 即色
10、谱峰两侧拐点上的切线在基线上截距间的距离。它与标准偏差的关系是 W=4,2023/3/26,28,2023/3/26,29,从色谱流出曲线中，可得许多重要信息：(i)根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组分的最少个数；(ii)根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析；(iii)根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析；(iv)色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据；(v)色谱峰两峰间的距离，是评价固定相（或流动相）选择是否合适的依据。,2023/3/26,30,三、离子交换层析,离子交换层析(ion exchange chromatography)利用物质的电荷与层析载体(离子交换
11、剂)电荷之间的相互作用达到分离纯化的目的的层析方法称离子交换层析。,离子交换剂：离子交换层析所用的固相基质，由不溶于水的、具有网状结构的高分子聚合物组成。,2023/3/26,31,2023/3/26,32,离子交换层析的操作,1、样品的准备：固体样品必须溶于适当离子强度和pH的缓冲液中。组织液或细胞裂解液用缓冲液稀释后可直接上柱。盐析样品必须除盐后才能进行分离。,2、离子交换剂的处理：根据被分离样品的性质选择合适的离子交换剂，离子交换剂在使用前须先进行处理。,2023/3/26,33,3、层析柱的准备：离子交换层析柱一般选择粗短柱为宜，使得样品在分离的同时进行浓缩。离子交换剂的用量根据样品量
12、和交换剂的交换容量确定。,4、样品分离：上样量的多少与目的蛋白的性质、浓度及交换剂的亲和力有关。在分离过程中，应注意,2023/3/26,34,1）样品的浓度不宜过大2）溶解蛋白质样品的缓冲液的离子强度要低于起始缓冲液3）上样速度不要过快4）上样缓冲液的pH应合适,5、洗脱,2023/3/26,35,6、洗脱液的鉴定和回收,7、离子交换剂的再生与储存,2023/3/26,36,2023/3/26,37,兔球蛋白的木瓜蛋白酶水解物在CM纤维素柱上的层析分离,2023/3/26,38,天花粉各成分用特种离子交换剂层析分离,2023/3/26,39,2023/3/26,40,2023/3/26,41
13、,二、分子筛原理,2023/3/26,42,2023/3/26,43,2023/3/26,44,凝胶过滤的分配系数,2023/3/26,45,主要凝胶过滤介质的牌号及骨架结构,2023/3/26,46,葡聚糖凝胶(G),2023/3/26,47,亲和层析：利用生物分子间特殊的亲和关系进行的分离方法。是蛋白质分离纯化的最有效的方法之一，有时甚至可以仅用一步纯化即可达到纯化目的。只要被分离蛋白、配基和载体之间能形成以下的关系，即可进行亲和层析,2023/3/26,48,2023/3/26,49,基本原理：亲和层析法利用了生命现象中生物分子之间非常特异的相互作用而进行分离纯化的方法。生物体内能发生特
14、异的相互作用的成分有：,酶与酶的底物,酶与酶的抑制剂,酶与酶的变构效应剂,酶与酶的辅酶,激素与细胞膜上的受体,维生素与结合蛋白,核酸,抗原与抗体,外源凝集素与红细胞表面的抗原,2023/3/26,50,2023/3/26,51,电泳 是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动的现象,蛋白质的电泳分离,2023/3/26,52,蛋白质胶体颗粒的沉淀,带正电荷的蛋白质,带负电荷的蛋白质,在等电点的蛋白质,酸,酸,碱,碱,脱水,脱水,脱水,不稳定的蛋白质颗粒（沉淀）,带正电荷的蛋白质（疏水胶体）,带负电荷的蛋白质（疏水胶体）,碱,酸,（亲水胶体）,（亲水胶体）,（亲水胶体）,2023/3/2
15、6,53,带电颗粒在电场中所受到的电场力,F=EQ,根据Stoke定律，球形分子在液体中泳动所受到的阻力,F=6rv,电泳原理：,2023/3/26,54,F=F,即：EQ=6rv 时，,当物质在电场中移动时，受到电场力和液体阻力两方面的力的影响，当电场力和阻力平衡时，带电颗粒作匀速运动，,2023/3/26,55,两个带电颗粒能否分开，由两个颗粒在电泳过程中的迁移率所决定，即,或,2023/3/26,56,迁移率（或泳动度）是指带电颗粒在单位电场强度下泳动的速度，可用下列公式计算：=/E=(d/t)/(V/l)=dl/Vt 为迁移率（cm2V-1min-1）；为颗粒泳动速度（cms-1）；E
16、为电场强度（Vcm-1）；d为颗粒泳动的距离（cm）；l为滤纸有效长度（cm）；V为实际电压（V）；t为通电时间（s或min）。通过测量d,l,V,t,即可计算出被分离物质的迁移率。,2023/3/26,57,影响电泳的因素,1、带电粒子的性质与电泳行为,2、电场强度对带电粒子迁移的影响：电场强度也称电位梯度，是指单位长度（每一厘米）支持物体上的电位降，它对泳动速度起着十分重要的作用。一般，电场强度越高，带电颗粒移动速度越快。,2023/3/26,58,3、溶液的pH对带电粒子迁移的影响：溶液的pH值决定了带电颗粒解离的程度，也决定了物质所带净电荷的多少。,4、电渗对电泳的影响：电渗是在电场中
17、液体对固体的相对移动。,2023/3/26,59,电 渗 作 用,2023/3/26,60,5、离子强度对电泳的影响：电泳液中的离子增加会使电泳迁移率降低，原因是带电的离子会吸引相反符号的离子聚集在其周围，形成一个与运动粒子符号相反的离子氛，它使该离子向相反的方向运动，从而降低了该粒子的迁移率。,2023/3/26,61,6、温度对的电泳的影响：电泳过程中由于通电产生焦耳热，热对电泳有很大的影响。温度每升高1，迁移率约增加2.4%。为降低热效应对电泳的影响，可控制电压或电流，或在电泳系统中安装冷却散热装置。,2023/3/26,62,电 泳 的 分 类 和 特 点,电泳的分类,自由移动界面电泳
18、,区带电泳,稳态电泳,2023/3/26,63,自由移动界面电泳（moving boundary electrophoresis），没有支持物，在一个U形管中进行电泳，目前已被区带电泳所取代。,区带电泳（zone electrophoresis）在一定的支持物上进行的电泳，电泳结果形成一条条的区带而得名。,稳态电泳（steady state electrophoresis）带电颗粒电泳一定时间后达到稳态而停止移动。,2023/3/26,64,2023/3/26,65,聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰
19、胺Acr和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺Bis聚合而成,2023/3/26,66,2023/3/26,67,聚合过程需要有催化剂参加，有两种聚合方式，化学聚合和光聚合。催化剂包括引发剂和加速剂两部分组成。化学聚合反应的引发剂常为过硫酸铵，过硫酸铵首先形成自由基，通过自由基传递，使丙烯酰胺成为自由基，发动聚合反应。加速剂 四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）可加快引发剂释放自由基的速度；光学聚合反应的引发剂为核黄素。,2023/3/26,68,聚丙烯凝胶的特点,在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；,化学性能稳定，与被分离物不发生化学反应；,对pH
20、和温度变化较稳定；,几乎无电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性极好。,样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g。,凝胶孔径可通过选择单体及交联剂的浓度调节。,分辩率高，尤其在不边疆凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。,2023/3/26,69,凝胶孔径及其有关性质,凝胶性能与总浓度及交联度的关系 凝胶的孔径、机械性能、弹性、透明度、黏度和聚合程度取决于凝胶总浓度和Acr与Bis之比。,2023/3/26,70,a/b与凝胶的机械性能密切相关。当（a/b）100时，即使5%的凝胶也呈糊状，易于断裂。欲制备完全透明而又有弹性的凝胶，应控制（a/b）=30左右。T
21、一般为5%10%。,凝胶浓度与孔径的关系 T与c 不仅与凝胶的机械性能有关，还与凝胶的孔径关系极为密切。一般讲，T越大，孔径越小。此外，孔径还同Bis与Acr的比例有关，Bis占Acr总浓度5%时，孔径最小。,凝胶浓度与被分离物相对分子质量有关。,2023/3/26,71,2023/3/26,72,聚丙烯酰胺凝胶电泳,垂直平板电泳,水平板电泳,圆盘电泳,连续电泳,不连续电泳,Disc电泳,2023/3/26,73,丙烯酰胺凝胶电泳的应用,聚丙烯酰胺凝胶电泳根据其有无浓缩效应，可分为连续的和不连续的两类。前者指整个电泳系统中所用缓冲液，pH值和凝胶网孔都是相同的；后者是指在电泳系统中采用了两种或
22、两种以上的缓冲液、pH值和孔径，不连续电泳能使稀的样品在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨能力。,2023/3/26,74,在不连续PAGE系统里，存在三种物理效应,，即电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。、电荷效应：各种蛋白质按其所带电荷的种类及数量，在电场向一定电极，以一定速度泳动。、分子筛效应：区别不同大小分子种类的能力是凝胶所具有的一种筛分大小的能力即分子筛效应。这种效应与凝胶过滤过程中的情况不同。,2023/3/26,75,浓缩效应,2023/3/26,76,2023/3/26,77,2023/3/26,78,2023/3/26,79,9 蛋白质的研究历史与方法,SDSPAGE电泳是应用聚
23、丙烯凝胶电泳测定蛋白质分子量的一种有效的方法。SDS是阴离子变性剂，使蛋白质分子变性为直链状，且其所带阴离子将蛋白质分子所带电荷完全履盖，具有相似的荷质比，电泳过程完全与蛋白质的分子量相关。电泳结束后的凝胶用考马斯亮兰或银染后与已知分子量的蛋白质的标准蛋白比较得出。,2023/3/26,80,2023/3/26,81,9 蛋白质的研究历史与方法,二维电泳是等电聚焦电泳与SDSPAGE电泳结合的双向电泳。电泳过程用柱状等电聚焦电泳后再行SDSPAGE电泳，等电聚焦电泳利用蛋白质等电点进行分离，SDSPAGE根据蛋白质分子量实现分离。因为等电点相同而分子量也相同的蛋白质几乎是不存在的，所以二维电泳
24、可将所有蛋白质分子分开。,2023/3/26,82,2023/3/26,83,2023/3/26,84,2023/3/26,85,等电点聚焦（isoelectric focusing）,原理:在一定抗对流介质（如凝胶）中加入两性电解质载体(Ampholyte,是一种多氨基多羧基的混合物，由异构物和同系物组成，其pK和pI值各自相异却又相近），当直流电通过时，便形成一个由阳极到阴极pH值逐步上升的梯度。两性化合物在此电泳过程中，就被浓集在与其等电点相等的pH区域，从而使不同化合物能按其各自等电点得到分离。应用：高效率分离纯化蛋白质 测定蛋白质分子量,2023/3/26,86,2023/3/26,
25、87,两性电解质(1)Ampholine(瑞典LKB)它是由许多脂肪族的多氨基,多羧基的异构体和同系物组成的,pH范围2.5-4.5，4-6.5，5-8，3.5-9.5.,2023/3/26,88,Servalyte(德国Serva公司)它是在由丙烯基乙胺与乙烯基亚胺缩合并蒸馏得到的多胺混合物中,再引入磺酸基团或磷酸基团合成的.pH范围:2-4,3-5、4-6、5-7、6-8、7-9、9-11、2-11、3-10.,2023/3/26,89,毛细管电泳,毛细管电泳又称毛细管区带电泳，它是在毛细管（2-75m）中装入缓冲液，从其一端注入样品，在毛细管两端加高压直流电实现对样品的分离，分离后的样品依次通过设在毛细管一端的检测器检出。该法克服了传统区带电泳的热扩散和样品扩散的问题，实现了快速和高效分离。,毛细管电泳是近年来发展起来的一项新技术，被认为是90年代最有影响的分离手段之一。目前已广泛用于氨基酸分析、蛋白质高效分离、指纹图谱研究、分离合成的寡核苷酸、DNA序列测定及PCR产物的分析鉴定等。,2023/3/26,90,2023/3/26,91,
