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1、SD大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养的实验研究,第一组：演讲人：,实验目的：,建立一种简便有效的体外分离纯化及培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法，研究BMSCs的生物学特性，为后续细胞移植和基因治疗提供理想的种子细胞。,实验结果：,大鼠BMSCs体外培养生长状况良好，可见BMSCs呈均一的梭形和多角形。流式细胞仪检测显示BMSCs表达CD29、CD90，不表达CD34、CD45。经体外诱导后具有多向分化潜能。,试验方法：,全骨髓贴壁培养法分离大鼠BMSCs，体外培养和连续传代，在倒置相差显微镜下连续观察细胞的形态变化，利用MTT法测定其生长曲线，流式细胞仪鉴定其表面抗原，成骨、成
2、脂肪诱导分化鉴定其多向分化潜能。,结论：,全骨髓贴壁培养法适合体外分离、扩增和纯化大鼠BMSCs，培养的大鼠BMSCs具有间充质干细胞的一般生物学特性，为后续基因修饰BMSCs及其体内移植实验奠定良好的基础。,实验材料：,68 周龄雄性SD大鼠，体质量80100 g，清洁级，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司许可证号为SC-XK(沪)20082-005。胎牛血清(美国Hyclone 公司)，L-DMEM 培养基(美国Gibco公司)，胰酶( 美国Gibco 公司)，CD34-FITC 抗体、CD45-FITC 抗体、CD90-FITC 抗体(英国AbD Serotec公司)，CD29-FITC
3、抗体(美国Biolegend公司),前言：,骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)作为一种组织特异性干细胞，具有高度增殖能力和多向分化潜能，其作为种子细胞在干细胞移植和基因治疗等方面的研究倍受关注。2007年9月至2008年8月我们开展了体外分离纯化及培养扩增大鼠BMSCs 的实验，为进行基因修饰BMSCs及其体内移植的后续实验奠定良好的基础。,试验方法：1、鼠原代BMSCs的分离培养,抽取10%水合氯醛0.2 ml腹腔注射麻醉大鼠后，用75%酒精浸泡大鼠双下肢5min，无菌条件下分离出大鼠双侧的股骨和胫骨，将离体的
4、骨干放入灭菌PBS缓冲液中冲洗后转入含10%胎牛血清的低糖型DMEM培养基的培养皿中。剪去两侧干骺端，暴露骨髓腔，用无菌注射器抽取5ml含10%胎牛血清的低糖型DMEM培养基反复冲洗骨髓腔，直至骨髓腔内所有骨髓液冲净。反复吹打骨髓冲洗液制成单细胞悬液，将此悬液接种于25cm2的塑料培养瓶中，置于37、5%二氧化碳的细胞培养箱内培养。3d后首次换液，以后每3d换液1次。倒置显微镜下逐日观察细胞形态。,2、大鼠BMSCs的传代与纯化,通过全骨髓贴壁培养法，每次换液弃除悬浮细胞。贴壁细胞主要是BMSCs，但可能混有淋巴细胞、单核细胞等造血细胞，710d原代细胞生长融合达80%90%，以0.25%乙二
5、胺四乙酸(EDTA)-胰酶消化后按1:2的比例传代培养。原代细胞传代后的细胞标记为P1 (Passage 1)，反复传代扩增，并依次递增标记。每次传代时用0.25% EDTA-胰蛋白酶(0.04 ml/cm2)消化12 min，加入含10%胎牛血清的低糖DMEM完全培养基终止消化。严格控制胰酶的用量和消化时间，利用BMSCs较易脱落的特点，保证BMSCs在较短的时间内与培养瓶底分开，淋巴细胞、单核细胞则因贴壁性强仍贴附于培养瓶底，从而使BMSCs得到纯化。,大鼠BMSCs生长曲线测定：,为了定量测定大鼠BMSCs的生长状况，对来源于同一动物的原代细胞进行连续培养，分别选取生长良好的P1、P3、
6、P5代BMSCs消化后制备成细胞悬液，调整细胞密度为5104/ml。接种于96孔板，每孔接种200 l 细胞悬液进行培养(每孔1104细胞)。次日起每天选择6个培养孔各自加入MTT溶液(5 mg/ml)20l，37继续孵育4h后终止培养，吸出孔内上清，每孔加入150l二甲基亚砜(DMSO)，室温振荡10 min，使结晶充分溶解。与实验孔平行设不加细胞只加培养液的空白对照1孔。在酶标仪上选择570nm波长，以空白孔调零，测定各孔吸光度(A)值，连续测7d，以时间为横轴，A值为纵轴绘制细胞生长曲线。,2、大鼠BMSCs P4细胞成骨、成脂诱导分化鉴定,(1)向成骨细胞诱导分化：待培养的BMSCs
7、P3细胞生长至80%90%的融合，加入0.25%EDTA-胰酶消化后，以2104/孔的密度接种于6孔培养板，常规培养1d后，诱导分化培养组(实验组)加入2 ml成骨诱导分化培养液，基础培养组(对照组)加入等量基础培养液，每3d换液1次。成骨诱导21d后，进行茜素红染色检测，确定细胞外基质的矿化。(2)茜素红染色：两组细胞分别用PBS冲洗2次，95%乙醇固定5 min，茜素红染液染色5 min，蒸馏水冲洗3 次，倒置相差显微镜下观察细胞的形态和染色结果。(3)向成脂肪细胞诱导分化：待培养的BMSCs P3细胞生长至80%90%的融合，加入0.25% EDTA-胰酶消化后，以2104/孔的密度接种
8、于6孔培养板，常规培养1d后，诱导分化培养组(实验组)加入2ml成脂肪诱导分化培养液，基础培养组(对照组)加入等量基础培养液，每3d换液1次。成脂肪诱导10d后进行油红O染色。(4)油红O染色：两组细胞分别用PBS冲洗3次，10%中性甲醛固定10min，油红O染液浸染10min，60%异丙醇洗去多余染液，PBS冲洗3次，苏木精复染35min，1%盐酸分色及返蓝后，PBS漂洗10min，倒置相差显微镜下观察细胞的形态和染色结果。,大鼠BMSCs的鉴定：1、流式细胞仪鉴定,采用流式细胞仪对大鼠BMSCs进行鉴定。待25cm2塑料培养瓶内P3细胞长至融合至90%左右，吸去培养基，以1PBS洗涤细胞一
9、次，加入0.25%EDTA-胰酶室温消化后加入新鲜含10%胎牛血清的DMEM完全培养基终止消化，并轻轻吹打数次制成单细胞悬液，收集细胞于15ml离心管中1 000 r/min室温离心5 min，弃上清，PBS洗涤两遍并于相同条件下离心，弃上清，于待检测的样本中各加入100 lPBS，轻轻混匀，分别加入CD29-FITC、CD34-FITC、CD45-FITC、CD90-FITC抗体各10l，37避光孵育30min后上机检测。,结果：1、大鼠原代BMSCs的分离培养,经全骨髓贴壁培养法分离得到的骨髓单个核细胞在倒置相差显微镜下呈圆形、透亮、漂浮、折光性强，单个分布。接种1d后，轻晃培养瓶可见大部
10、分细胞随培养液晃动，仅少部分细胞贴壁，可见大部分细胞呈圆形，少量呈不规则形，折光性强。3d后，贴壁细胞逐渐增加，少许伸出伪足呈梭形或三角形，并开始分裂增殖，可见一些小的细胞集落形成(图1A)。45d后，贴壁细胞多呈梭形或多角形，形成不同大小、分散的细胞集落，集落逐渐扩散并相互交连呈网状(图1B)；以后细胞增殖迅速，至接种后第7天，细胞形似短棒状或纤维样，细胞集落数量明显增加，呈放射状或漩涡状排列，集落间渐融合成单层(图1C)；传代至P5以备实验用时细胞形态未见明显变化(图1D图1H)。,2、大鼠BMSCs的传代与纯化,传代细胞呈圆形，很快开始贴壁，36h后基本完成贴壁。贴壁细胞初期伸出伪足呈梭
11、形或多角形，少部分圆形细胞悬浮，折光性差，随换液除去。传代12d后贴壁细胞分布均匀，细胞形态逐渐趋于一致，以梭形为主，胞体饱满，增殖迅速，34d后即可长满培养瓶底。多次传代的BMSCs达融合生长时，细胞形态更趋一致，形成更均匀有序的放射状或漩涡状排列，说明BMSCs得到进一步纯化。,3、大鼠BMSCs生长曲线测定,P1、P3细胞生长曲线基本相同，经过12d的潜伏适应期，第3天开始大量增殖进入对数生长期，P1和P3细胞维持3d左右对数生长期，此后进入平台期。P5细胞生长趋势不同于P1、P3细胞，增殖速度减慢，较之前两者其潜伏适应期延长，而对数生长期缩短。见图2。,4、大鼠BMSCs的鉴定,1、流
12、式细胞仪鉴定大鼠BMSCs P3细胞表面标记流式细胞仪检测显示CD29、CD90阳性率均达97%以上，CD34、CD45阴性率达95%以上(图3)。2、大鼠BMSCs P4细胞成骨、成脂诱导分化鉴定成骨诱导分化鉴定：实验组诱导后第21天茜素红染色显示大量橘红色矿化结节形成(图4A)；对照组染色阴性。成脂诱导分化鉴定：实验组诱导后第10天油红O染色可见胞质内有大小不等的橙红色脂滴(图4B)；对照组染色阴性。,讨论：,1968年Fridenstein等首次对BMSCs进行了描述，提出了在骨髓中存在能贴附塑料培养皿，呈长梭形成纤维细胞样，培养时呈克隆样生长的细胞，将这类细胞称为骨髓间充质干细胞。传统
13、认为BMSCs的主要功能是参与构成造血干细胞生存和分化的微环境。近年研究发现BMSCs具有跨系统、跨胚层的多向分化潜能，在不同诱导条件下可分化为中胚层及神经外胚层组织细胞，如心肌细胞、内皮细胞、成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、神经组织细胞等。BMSCs具有来源充足、取材方便、免疫原性低、易于转入外源基因进行表达等诸多优势，不仅是组织工程的重要种子细胞，还是进行基因治疗的重要载体细胞，在器官移植和一些终末期疾病中亦有广泛的应用前景。但是骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极少，约占骨髓有核细胞的十万分之一。因此建立一种简便有效的体外分离纯化、培养扩增大鼠BMSCs的方法以供研究及
14、应用显得尤为重要。目前分离BMSCs的方法主要有全骨髓贴壁培养法、密度梯度离心法、流式细胞仪分选法和免疫磁珠分选法。尽管利用流式细胞仪和免疫磁珠进行分选可获得高纯度的BMSCs，但对细胞的活性影响较大，加之成本较高和技术难度大，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。,采用密度梯度离心法对细胞活性影响较小，却破坏了BMSCs生长的骨髓微环境，导致细胞增殖能力下降。桂莉等采用Percoll淋巴细胞分离液获得骨髓中的单个核细胞，并结合BMSCs的贴壁特性，获得大鼠BMSCs，虽然细胞均一性更高，但增殖速度较慢。高建鹏等比较贴壁培养法和密度梯度离心法培养大鼠BMSCs的效果，发现贴壁培养法和密度梯度离
15、心法都可以得到纯度较高的MSCs，两种培养方法的效果无明显差异。全骨髓贴壁培养法是根据BMSCs贴壁生长而造血细胞悬浮生长的特性对两者进行分离，由于保存了BMSCs生长所需的骨髓微环境，细胞经换液传代后得到纯化且能保持旺盛的增殖能力。本实验采用全骨髓贴壁培养法成功分离培养出了纯度较高的BMSCs。每次换液去除悬浮生长的造血细胞；传代时利用BMSCs较淋巴细胞、单核细胞易脱落的特点，严格控制胰酶的用量和消化时间，使BMSCs在较短的时间内与培养瓶底分开，淋巴细胞、单核细胞则因贴壁性强仍贴附于培养瓶底，从而使BMSCs得到进一步纯化。随着换液传代次数的增加，BMSCs的纯度也不断增加。在体外分离培
16、养BMSCs的过程中我们也体会到，造血系细胞对骨髓间充质干细胞的生物学特性影响很小，而且全骨髓贴壁培养法操作简单快速，造成污染的环节和机会较少，不需离心，可以更好的保持细胞活性。同时将全骨髓贴壁培养法作为其他培养方法的基础，为后续实验进一步富集BMSCs和进行单克隆培养提供良好的细胞来源。,BMSCs原代细胞对于细胞的接种密度依赖性很强，接种密度过稀，则细胞不能形成有效的相互作用而导致细胞增殖缓慢甚至完全停止生长。因此采用全骨髓贴壁培养法在原代接种时应尽可能获得足够多的骨髓液冲洗以达到BMSCs的良好增殖，我们的体会是将大鼠双侧股骨和胫骨的骨髓液一同冲洗后接种入一个25cm2的塑料培养瓶内以保
17、证接种细胞的密度，与陈凯等报道一致。而赵玉金等则报道采用全骨髓培养获得原代大鼠BMSCs，传代后低密度接种结合机械擦除对所培养细胞进行纯化，可以获得高纯度大鼠BMSCs，且具有更佳的生物学特性。周丽娜等通过对照研究发现采用全骨髓贴壁法培养大鼠BMSCs，培养基内添加表皮生长因子后能够稳定、简便、快速获取大量高纯度大鼠BMSCs。,本研究针对性地观察了P1至P5BMSCs的生长特性，结果发现P5BMSCs增殖速度明显减慢，其细胞倍增时间也明显延长，提示大鼠BMSCs似乎不能在体外无限扩增。进一步研究发现，BMSCs随着传代次数的增加，逐渐出现衰老现象，传到第10代以后，细胞逐渐出现空泡或者折光性
18、降低等改变，其体外增殖的能力也逐渐下降，表现在形态上从梭形或多角形逐渐变得宽大扁平，传代时间延长。而李宁等通过观察不同氧浓度微环境对间充质干细胞增殖的影响，发现适宜的高浓度氧微环境可以促进大鼠BMSCs的增殖。,迄今为止，仍然没有发现BMSCs公认的独特的抗原表型，一般采用联合的抗原表型来鉴定BMSCs。BMSCs不表达造血细胞表面抗原，如造血干细胞标志抗原CD34、白细胞标志抗原CD45等，而表达CD29、CD90等间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志物。本研究分离到的细胞绝大部分表达CD29和CD90，不表达CD34和CD45，表明本实验获得的细胞为纯度较高的大鼠BMSCs。多向分化潜能被认为是骨髓间充质干细胞的最重要的生物学特征。本实验培养的大鼠BMSCs在成骨诱导后，经茜素红染色发现，细胞间出现矿化结节，表明BMSCs已向成骨细胞分化。在成脂诱导后，经油红O染色发现，细胞内出现脂滴，呈典型脂肪细胞表型，表明BMSCs已向脂肪细胞分化。以上结果进一步证明我们所培养的细胞是具有多向分化潜能的骨髓间充质干细胞。,本实验采用全骨髓贴壁培养法体外培养扩增大鼠BMSCs，简单、实用、高效，分离培养的大鼠BMSCs具有骨髓间充质干细胞的一般生物学特性，为下一步对大鼠BMSCs进行基因修饰及其体内移植奠定实验基础。,谢谢观赏!,
