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1、肺动脉高压分子机制的研究进展 低氧对大鼠远端肺动脉平滑肌细胞内钙离子浓度的影响及机制Recent advance in molecular mechanism of pulmonary arterial hypertension Role of hypoxia on intracellular Ca2+concentration in pulmonary artery smooth muscle cells(PASMCs),Jian Wang(王健)Johns Hopkins University广州医学院,前言(Introduction),我国40岁以上人群COPD总患病率高达8.2%，大部
2、分患者最终经慢性低氧性肺动脉高压（chronic hypoxic pulmonary hypertension,CHPH）而发展成为慢性肺源性心脏病。两个环节:肺血管急性低氧性收缩反应和慢性低氧性肺血管结构重建是CHPH发生的主要机制。,前言(Introduction),急性低氧导致包括大鼠、猪、狗、绵羊、雪貂、牛等多种动物肺动脉的强烈收缩，慢性低氧引起包括人类、大鼠及绵羊肺动脉的结构重建。细胞内Ca2+浓度（Ca2+i）在引起肌细胞的收缩和增殖的复杂机制中起至关重要的作用。,前言(Introduction),Store operated calcium channel(SOCC)主要由经典型
3、瞬时受体电位（TRPC）蛋白家族成员组成,TRPC家族包括TRPC-1至TRPC-7。SOCE和TRPC蛋白在肺动脉平滑肌Ca2+i调节中发挥重要作用。,前言,急性低氧性肺动脉收缩时Ca2+i的增加部分是由于SOCE 通过由TRPC组成的SOCC而造成。慢性低氧大鼠肺动脉平滑肌Ca2+i和SOCE增加，TRPC蛋白参与慢性低氧诱导的肺动脉平滑肌Ca2+i升高。,CHPH,急性低氧,SOCE,Ca2+i,血管收缩,？,？,PA,？,研究目的(Aims),以大鼠远端肺动脉平滑肌、远端PASMCs及CHPH大鼠模型为研究对象，深入探讨性低氧对大鼠远PASMC Ca2+i的影响及机制。,急性低氧对大鼠
4、远端肺动脉平滑肌细胞内钙浓度的影响 Effect of acute hypoxia on calcium singling in pulmonary arterial smooth muscle cells,方法(Methods),酶消化法原代培养大鼠远端PASMCs形态学、免疫学及功能鉴定PASMCs细胞内钙浓度检测系统观测急性低氧(4%O2)对大鼠远端PASMC Ca2+i的影响,Phase contrast microscopy of distal PASMCs cultured for 3-6 days.Cells showed spindle-shaped morphology.,S
5、mooth muscle specific a-actin antibody identified a-actin(shown in red)in 95%cultured cells.The nuclear marker YO-PRO-1 is shown in green.,Immunocytochemistry,Rat Distal PASMCs,Morphology,高钾KRBS溶液对大鼠远端PASMC Ca2+i的影响及5M硝苯地平的干预作用,A：时间曲线，B：峰值。control组n=5,细胞数=138；KCL组n=6，细胞数=171；KCL+Nifed组n=5，细胞数=145。：P
6、0.01 vs control；：P0.01 vs KCL。,急性低氧对大鼠远端PASMCCa2+i的影响,0,10,20,30,time,Ca,2+,i,(,nM,),4%,O,2,16%,O,2,4%,O,2,16%,O,2,-,20,0,20,40,60,80,-,20,0,20,40,60,80,0,10,20,30,time,Ca,2+,i,(,nM,),A,B,A,0,20,40,60,80,100,4%,O,2,16%,O,2,Ca,2+,i,(,nM,),0,20,40,60,80,100,4%,O,2,16%,O,2,Ca,2+,i,(,nM,),B,A：时间曲线，B：峰值。
7、4O2组n=8，细胞数=166；16O2组n=6，细胞数=133，：P0.001。,小结 1(Summary 1),原代培养PASMCs是研究低氧造成肺动脉病理生理及病理改变的首要前提。在低氧及各种血管活性物质刺激下，肺动脉发生的血管收缩反应和结构重建主要定位于肺内远端肺动脉(肺内4级分支以下的肺动脉)。培养细胞呈长梭形，表现典型的血管平滑肌细胞生长特点，即“峰谷”状生长。60mM高钾溶液使培养的PASMCCa2+i增高，5M硝苯地平能完全阻断此反应，说明培养的PASMC表达具有完好功能的VDCC通道。,小结 2,Ca2+是重要的第二信使，调节细胞的许多生理过程，也包括肺血管平滑肌的急性收缩反
8、应和慢性增殖过程。无论外部各种因素调控肺血管平滑肌细胞收缩和增殖的机制如何复杂，最后都归结于各种因素对于肺血管平滑肌细胞Ca2+i的影响。,小结 3,急性低氧能使大鼠、羊、猫、人等肺动脉平滑肌细胞的Ca2+i升高。我们发现：急性低氧也能使大鼠远端PASMC Ca2+i升高，提示急性低氧可能通过升高Ca2+i参与肺动脉平滑肌的急性低氧性收缩反应。,小结,二.急性低氧对大鼠远端肺脉平滑肌细胞内钙浓度影响的机制,方法,5M硝苯地平对急性低氧诱导大鼠远端PASMC Ca2+i升高的影响,A：时间曲线，B：峰值。4O2组n=7，细胞数=146；4O2+Nifed组n=6，细胞数=128，：P0.001,
9、结果(Results),大鼠远端肺动脉平滑肌组织及培养的PASMCs TRPC的 mRNA表达的PCR结果,大鼠远端肺动脉平滑肌组织及培养的PASMC的TRPC1、TRPC4和TRPC6的Western结果,恢复细胞外钙法检测大鼠远端PASMCs SOCE,A：时间曲线，B：峰值。Nifed+CPA组n=8，细胞数=239；Nifed 组n=6，细胞数=168，：P0.001,SOCE,锰荧光焠灭法检测大鼠远端PASMCs SOCE,A：时间曲线，B：峰值。+CPA组n=7，细胞数=177；-CPA组n=5，细胞数=137，：P0.001。,恢复细胞外钙法观测SKF-96365和NiCl2分别
10、对大鼠远端PASMCs SOCE的影响,锰荧光焠灭法观测SKF-96365和NiCl2分别对大鼠远端PASMCs SOCE的影响,SKF,Ni2+and La3+对高钾KRBS溶液诱导大鼠远端PASMCCa2+i升高的影响,急性低氧对大鼠远端PASMC SOCE的影响,不存在CPA的情况下，急性低氧对大鼠远端PASMC锰荧光焠灭的影响,A：时间曲线，B：峰值。16O2（no Mn2+）组n=5，细胞数=141；16O2组n=5，细胞数=114，与16O2（no Mn2+）组比较P0.4；4O2组n=5，细胞数=136，与16O2组比较P0.001。,存在CPA的情况下，急性低氧对大鼠远端PAS
11、MC锰荧光焠灭的影响,A：时间曲线，B：峰值。16O2组n=5，细胞数=119；4O2组n=5，细胞数=112，：P0.001,SKF-96365和NiCl2分别对急性低氧诱导的大鼠远端 PASMCs SOCE的影响,急性低氧使大鼠远端PASMCCa2+i升高，而VDCC拮抗剂硝苯地平只能部分抑制急性低氧引起的PASMCCa2+i升高,提示急性低氧通过激活大鼠远端PASMC的VDCC和另外的非VDCC依赖的通道导致Ca2+内流，进而引起Ca2+i升高。SOCE在调解细胞内钙平衡发挥重要作用,广泛存在于星形胶质细胞、气道平滑肌细胞、心肌细胞、主动脉平滑肌细胞、肺动脉平滑肌细胞及肺动脉内皮细胞等。
12、,小结1,我们运用恢复细胞外钙法和锰荧光焠灭法,发现CPA能使PASMCs中的 Ca2+i迅速显著升高，锰荧光焠灭增强，且能被SOCC拮抗剂显著抑制，表明大鼠远端PASMC存在SOCE。TRPC蛋白参与组成SOCC，大鼠远端肺静脉平滑肌主要表达TRPC-1、TRPC-4和TRPC-6，且尤其以TRPC-1和TRPC-6的蛋白表达最强。,小结2,用含有CPA和硝苯地平的无钙溶液孵育PASMCs，急性低氧不仅能显著增加由恢复细胞外钙所引起的Ca2+i升高，而且能显著增加锰荧光焠灭。以上两种反应均能被SOCC拮抗剂阻断。急性低氧通过增强由SOCC介导的SOCE，进而引起PASMC的Ca2+i升高。,
13、小结3,用不含CPA但含硝苯地平的无钙溶液孵育PASMCs，常氧时，锰荧光焠灭与细胞的荧光自发衰减量没有差异，而在急性低氧时，锰荧光焠灭显著增加，且此反应能被SOCC拮抗剂显著抑制，表明急性低氧能够诱发SOCE。急性低氧时用含有CPA和硝苯地平的无钙溶液孵育PASMC，锰荧光焠灭显著增加，且能被SOCC拮抗剂显著抑制，表明急性低氧能够放大由CPA诱导的SOCE。急性低氧的这些作用可能由于低氧加速了Ca2+从肌浆网清空，也可能是由于低氧增强了与肌浆网钙耗竭信号耦联的SOCC的活性。,小结4,小结,急性低氧,Ca2+i,SOCE,三.慢性低氧对大鼠远端肺动脉平滑肌细胞内钙浓度的影响,方法,常压持续
14、低氧（10%O2）21天的方法建立CHPH大鼠模型，观测MPAP、RVSP、RV/(LV+S)及肺血管形态学改变。分离正常大鼠和CHPH大鼠的远端PASMCs，细胞内钙浓度检测系统检测正常大鼠和CHPH大鼠PASMCs Ca2+i。,结果,n=6，*:P0.01,慢性持续低氧对大鼠MPAP、RVSP及RV/(LV+S)的影响,慢性低氧对大鼠肺内血管结构重建的影响,A:低氧组，B:常氧组,慢性低氧对大鼠远端PASMCCa2+i的影响,常氧组n=5，细胞数=112，低氧组n=5，细胞数=104，：P0.001,0,50,100,150,200,Normoxia,Hypoxia,Basic Ca,2
15、+,i,(,nM,),0,50,100,150,200,Normoxia,Hypoxia,Basic Ca,2+,i,(,nM,),讨论,本实验以10%O2饲养大鼠3周，低氧大鼠MPAPRVSP及RV/(LV+S)较正常大鼠明显增高，肺内血管较正常大鼠明显增厚，提示慢性低氧通过直接或间接作用导致肺血管重构，肺动脉压升高，右心室肥大。常压持续低氧能很好复制CHPH模型。慢性低氧能使大鼠远端PASMCs中 Ca2+i的升高，提示慢性低氧诱导的Ca2+i升高参与慢性肺血管结构重建。,小结,CHPH,四.慢性低氧对大鼠远端肺动脉平滑肌细胞内钙浓度影响的机制,方法,TRPC表达,荧光定量PCR,West
16、ern-blot,CPA诱导,OAG诱导,恢复细胞外钙,锰荧光焠灭,Ca2+i检测系统,结果,TRPC gene&protein expression,慢性低氧对CPA诱导的大鼠远端PASMC Ca2+i变化的影响,慢性低氧对CPA诱导的大鼠远端PASMC锰荧光焠灭的影响,Basal Mn2+quenching(Ca2+entry)in PASMCs,讨论,慢性低氧能上调肺动脉平滑肌TRPC1,TRPC6的mRNA水平和蛋白质水平的表达，但对TTRPC4的表达水平无影响。CHPH大鼠远端肺动脉平滑肌TRPC1,-6表达上调，提示TRPC1,-6可能在慢性低氧诱导的大鼠远端肺动脉平滑肌Ca2+i
17、的改变中扮演重要角色。恢复细胞外钙和锰荧光焠灭实验证实：慢性低氧对大鼠远端PASMCs的SOCE并无影响，可能原因是慢性低氧对编码SOCC通道的基因（TRPC4）的表达没有影响。,讨论,TRPC1-6主要参与组成SOCC,ROCC，ROCC被DAG或OAG激活后导致细胞外Ca2+内流。恢复细胞外钙和锰荧光焠灭实验证实：CHPH大鼠远端PASMCs由低氧诱导的Ca2+内流和锰荧光焠灭较常氧组增强，提示慢性低氧时经由PASMC的SOCC,ROCC的Ca2+内流增加，导致Ca2+i升高。慢性低氧时大鼠远端PASMC的Ca2+i升高主要是由于慢性低氧时TRPC1,-6蛋白表达上调、主要由TRPC1,-
18、6蛋白组成的SOCC and ROCC通道增加，进而导致由Ca2+内流增加。,小结,慢性低氧,Ca2+i,Ca2+内流,TRPC1,-6,结论,1、急性和慢性低氧都能使大鼠远端肺动脉平滑肌细胞内钙浓度升高。2、大鼠远端肺动脉平滑肌主要表达TRPC-1、TRPC-4和TRPC-6，尤以TRPC-1和TRPC-6为主。3、急性低氧不仅自身能够诱发大鼠远端肺动脉平滑肌细胞的SOCE，而且能够放大SOCE，从而引起细胞内钙浓度升高。4、慢性低氧能上调大鼠远端肺动脉平滑肌TRPC1，-6的表达，使主要由由TRPC1蛋白组成的SOCC增加,TRPC6蛋白组成的ROCC增加，导致Ca2+内流增加，从而引起细胞内钙浓度升高。,致谢,Prof.Sylvester and Prof.Shimoda,Prof.Semenza(Johns Hopkins University)钟南山教授,冉丕鑫教授(广州医学院),
