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1、精品论文推荐电针背俞穴改善血管性痴呆大鼠海马区突触结构参数的定量研究1许能贵，唐纯志，闫兵，何利雷广州中医药大学，广州（510405）E-mail：ngxu摘要：目的：观察电针对血管性痴呆（VD）大鼠学习记忆能力和大脑海马神经细胞病理 形态学及突触结构参数的影响。方法：采用 4-血管阻断法制备 VD 模型，用 Morris 水迷宫 测定大鼠学习记忆能力；用病理图象分析系统，计数完整神经细胞数目；应用透射电镜和图 像分析系统测量 Gray 型突触的突触结构参数的变化。结果：模型大鼠表现明显的学习记 忆障碍，在水迷宫实验中，其潜伏期显著延长（P0.01），在原平台象限跨越平台次数与其 余三个象限无
2、显著差异（P0.05）；光镜下可见海马锥体细胞层数减少，排列稀疏、不规则， 细胞体积变小，可见核固缩现象，神经细胞减少严重（P0.01）；电镜下海马 CA3 区 Gray 型突触的突触界面曲率、突触间隙宽度、突触后致密物（PSD）厚度均减小（P0.01）；而 电针组潜伏期明显缩短（P0.05），相同时间内跨越原平台次数明显多于其余三个象限（P0.01）；光镜下变性神经细胞数量显著减少，海马锥体细胞层细胞形态、排列基本正常； 电镜下海马 CA3 区 Gray 型突触的突触界面曲率、突触间隙宽度、突触后致密物（PSD）厚度均增大。结论：电针可抑制海马 CA3 区神经细胞丢失，并调控 Gray 型突
3、触结构参数的变化，从而改善 VD 大鼠学习记忆能力。 关键词：电针，血管性痴呆，海马，突触，结构参数血管性痴呆（VD）为脑血管病后的主要并发症，严重影响老年人的生活质量，而脑血 管病中以缺血性脑血管病发病率居首位1。目前，针灸治疗脑病的临床疗效是确切的，特别 是针灸治疗VD。有研究显示突触丢失是VD形成机制之一，而电刺激和针刺结合可促进新突 触形成，从而改善VD学习记忆能力 2。目前，对电针改善突触超微结构的相关研究中，主 要是观察突触的定性变化，而对突触结构参数的定量分析几乎没有。为此，本文对VD模型 大鼠的学习记忆与大脑海马突触的形态学及超微结构的定量变化及电针对其的干预进行了 实验研究，
4、旨在进一步探索针灸治疗VD的机理，为针灸在此方面的发展提供依据。1 材料与方法1.1 动物模型的制备与分组成年健康 SD 大鼠（SPF 级）50 只，雌雄各半，体重 180220g，由广州中医药大学动 物实验中心提供（动物许可证号：SCXK（粤）2003-0001；使用实验动物质量合格证编号：0010134、0010190）。随机抽取 8 只大鼠作假手术对照组，其余 42 只制造缺血模型。动物采 用国际公认的四血管阻断（4-VO）方法制作模型。用 10%水合氯醛（0.35ml/100g 体重）腹 腔注射麻醉大鼠，背侧颈正中切口，暴露双侧第一颈椎横突冀小孔，用直径 0.5mm 电凝针 插入双侧翼
5、小孔烧灼双侧椎动脉，造成永久性闭塞。庆大霉素注射液局部涂擦伤口后用 1 号缝合线缝合伤口。然后，腹侧颈正中切口，分离双侧颈总动脉，穿线备用，用微动脉夹可 逆性夹闭双侧颈总动脉 5min，共夹闭 3 次，每次间隔 10min，缝合伤口。假手术组仅暴露 4 条血管，不发生脑缺血，其余手术程序同上。术后七天内死亡 15 只，存活只数为 27 只，其 中 2 只因术后出现偏瘫不能进行水迷宫测试而弃之不用。将实际存活的 25 只模型大鼠按雌1本课题得到国家教育部新世纪优秀人才计划资助项目（NCET-04-0831）的资助。- 4 -雄和体重随机分为电针组 9 只，西药组 9 只和模型组 7 只。假手术组
6、死亡 1 只，存活 7 只。常规饲养、观察。1.2 主要仪器SDQ-30 双极射频电凝器（上海手术器械厂）；Morris 水迷宫（广州中医药大学提供）； G860 电针仪（上海）,苏木素（广州化学试剂厂生产，批号：20030913），伊红（南京化学 试剂厂生产，批号：20031108）。生物医学显微镜（南京医学显微镜厂）；病理图象分析系统 (北京航空航天大学生产，2.4 版本)，AO 超薄切片机，JEM-1200EX 透射电镜，全自动图像 分析系统（德国 KONTRON IBAS2.0 版），摄录仪（日本 JVC Ky-F30B 3-CCD）。1.3 治疗方法术后 10 天，刀口完全愈合，饮食
7、正常，无肢体残疾，体重恢复后开始给予电针及西药 尼莫通治疗。假手术组和模型组同等条件下饲养，未予任何治疗。电针组：用 28 号 1 寸毫针，于模型大鼠头部“百会”穴（顶骨正中）斜刺 0.5 寸，背部 膈俞穴（第 7 胸椎下两旁肋间）、脾俞穴（第 12 胸椎下两旁肋间）和肾俞穴（第 2 腰椎下两 旁），以上穴位均参考实验针灸学3，各直刺 0.5 寸，连接电针仪，施以连续波，频率150Hz，强度以大鼠安静耐受为度（约 1mA），每天电针 1 次，留针 20min，连续治疗 15 天。 尼莫通组：大鼠给予尼莫通 12mg/kg，按 20ml/kg 体重灌胃，每日 1 次，连续 15 天。1.4 检测
8、方法1.4.1 行为学观测Morris 水迷宫4学习记忆行为测试：电针及尼莫通治疗结束后，开始水迷宫检测。水迷 宫内水深 41cm，水温 22-26。在水池壁标明 4 个入水点，由此将水池等分为 4 个象限，任 选一象限正中放置平台，没于水下 1cm，水面覆盖塑料泡沫，于治疗结束后（术后第 26 天） 即开始水迷宫试验。程度包括：定位航行试验，将受试大鼠按顺时针方向依次由 E、S、 W、N4 个入水点顺序面向池壁放入水中。记录 2min 内寻找平台的时间（逃避潜伏期,escape latency）。如果大鼠在 2min 内找到平台，记录其实际逃避潜伏期；如果在 2min 内未找到平 台，由试验
9、者将其引上平台并停留 10s，逃避潜伏期记录为 2min。历时 6d，每天 1 次。 空间探索试验（spatial probetest），定位航行试验结束后撤出平台，然后任选一相同入水点将 大鼠放入水中，测其 2min 内跨原平台及其余三个象限相应平台位置的次数和大鼠在水迷宫 外环停留的时间。1.4.2 病理形态学检测在大鼠取完血后，颈椎脱臼处死大鼠，参照“大鼠立体定位图谱” 5，迅速在冰面上取海 马组织，常规石蜡包埋，4m 冠状切片。石蜡组织切片常规脱蜡二次，每次 10min，100、95、85、75梯度酒精水化，双蒸水洗片 2 次，每次 5min，苏木素染色 5min, 双蒸水 洗片 1m
10、in，盐酸乙醇分化 25s，流水冲洗 30min，置伊红液中 2min, 双蒸水洗片 2s，流水冲3min，酒精由低至高梯度脱水，二甲苯透明，干燥后中性树脂封片。HE 染色，普通光镜1040 倍下随机观察每张切片海马 5 个视野内完整神经细胞数目，输入病理图象分析系统， 计数每个屏幕视野下（1313cm）完整神经细胞数目。1.4.3 电镜样品的制备取 4 组大鼠各 3 只 10%水合氯醛腹（0.35ml/100g 体重）腔注射麻醉后，开胸，先以 250ml生理盐水将经左心室灌流大鼠体内血液冲净，再以 150ml 4多聚甲醛灌注固定，开颅取脑，分离海马组织，振动半薄切片，后固定，系列酒精脱水，丙
11、酮脱水，平板包埋，参照大鼠脑 立体定位图定位取 CA3 区，AO 超薄切片机超薄切片，片厚 60nm，将切片捞取至 300 目铜 网上，经柠檬酸铅 56min、醋酸铀 20min 双重电子染色后 JEM1200EX 透射电镜观察照 相，每例大鼠观察 1 张铜网，每张铜网由左上角至右下角斜线上下移动，连续拍摄 10 张照 片，底片放大 2.5 万倍印相。突触电镜照片图像分析与形态计量方法，借助摄录仪和图像分 析系统测量 Gray 型突触的突触间隙宽度、突触后致密物厚度和突触界面弧长和弦长，突 触界面曲率弧长/弦长。1.5 统计方法用 SPSS10.0for windows 统计软件，数据用均数标
12、准差（s）表示。不同组间水迷宫 测试、CO 浓度的比较采用 t 检验，P0.05 为有显著性差异。空间探索实验中各组大鼠跨越 原平台及其余 3 个象限相应平台位置的次数及病理形态学细胞计数采用单因素方差分析（One-way ANOVA），并以 LSD 法进行组间的两两比较。2. 结果2.1 水迷宫试验结果：定位航行试验结果见表 1，空间探索试验结果见表 2。表 14 组大鼠平均潜伏期比较（s）组别例数逃避潜伏期（s）假手术组75.200.81模型组716.899.13电针组95.490.90西药组96.730.97表 24 组大鼠跨越原平台及其余 3 个象限相应平台位置的次数（次，s）组别例数
13、原平台（E）右侧平台（S）左侧平台（W）对侧平台（N）假手术组76.141.572.141.351.861.070.860.69模型组72.290.952.711.801.861.351.861.35电针组95.671.501.331.000.890.781.110.78西药组95.441.511.561.011.331.001.001.00由表 1 可以看出，模型组与假手术组相比，其大鼠平均潜伏期明显增加（P0.01）。电针组、西药组与模型组进行两两比较，结果显示电针组和西药组大鼠平均潜伏期明显短于模 型组（P0.01）。由表 2 可以看出，假手术组、电针组和西药组大鼠在原平台象限跨相应平台
14、次数明显多 于其余三个象限（P0.05）。模型组在原平台象限跨越相应平台次数与另外三个象限的跨越次数无显著差异。将四组大鼠在原平台象限跨越相应平台次数做两两比较，电针组明显多于 模型组（P0.01）。这表明模型组大鼠学习获取能力较差，电针则改善了模型大鼠的学习巩固和再现能力。2.2 脑组织神经细胞变化见图 14，神经细胞计数见表 3。表 3 各组大鼠脑海马正常神经细胞数目的比较（XS） 组别例数海马7假手术组7模型组9 电针组9 西药组45.828.37*20.535.3138.527.08*41.068.12*注:与模型组比较, *P0.001 或*P0.05。VD 模型大鼠脑组织常规石蜡切
15、片，HE 染色后，神经细胞胞浆呈淡红色，核呈蓝黑色。 假手术组皮层脑细胞结构正常，胞核清晰，胞浆丰富，间质无水肿表现，海马锥体细胞 23 层，排列紧密（如图 1），细胞核圆而大，核仁清晰。模型组可见皮层变薄，部分神经元变 性，体积变小，胞核与胞浆界限模糊，核固缩成三角形或不规则形，核仁消失。海马锥体细 胞层数减少，排列稀疏、不规则，细胞体积变小，可见核固缩现象（如图 2）。电针组和尼 莫通组仍有不同程度的神经细胞变性，但变性神经细胞数量显著减少，零星可见一些损伤细 胞，海马锥体细胞层细胞形态、排列基本正常（图 3、4）。经单因素方差分析组间比较各组 大鼠脑海马正常神经细胞的数目有明显差异（P0
16、.01），并作组间两两比较，结果见表 3， 电针组、尼莫通组和模型组海马锥体细胞层均呈现细胞减少，与假手术组比较有显著差异（P0.01 或 P0.05）；模型组神经细胞减少最严重，与电针组及尼莫通组比较有极显著差异（P0.01）。2.3 电镜观察结果见图 58。电针组和假手术对照组大鼠海马 CA3 区细胞形态结构正常，常、异染色质分明；内质网、 线粒体及突触结构正常;神经毡中有许多 Gray 型突触，其突触前膜和突触后膜清晰，突触 后膜有浓密的电子致密物质，突触前终末聚集有较多呈圆形的突触囊泡，在突起中见有排 列有序的微管（图 5、图 7）。血管性痴呆大鼠海马 CA3 区细胞分界清晰、与周围组
17、织结构 有明显界线，整个细胞萎缩、体积缩小、电子密度较大；胞核固缩、形不规则，核质浓缩 变性、电子密度很大，常、异染色质模糊不清；胞质中线粒体减少，线粒体体积缩小，线 粒体嵴溶解、减少、排列紊乱；内质网腔扩张，胞质浓缩、细胞形状不规则；突触减少， 部分突触的突触前膜或突触后膜模糊不清（图 6）。2.4 组大鼠海马 CA3 区 Gray 型突触的突触界面曲率、突触间隙宽度、PSD厚度见表 4。表 4 4 组大鼠海马 Gray 型突触的突触界面曲率、突触间隙宽度、PSD 厚度 （S） 组别Vv（%）间隙（nm）PSD 厚度（nm）假手术组110.6030.4021.894.7252.426.70模
18、型组104.9023.8513.763.1236.697.73电针组 西药组109.4021.54108.7022.8318.762.3319.372.5446.895.6342.965.29注：与假手术组比较：P0.01，有显著性差异。与模型组比较： P0.05，有显著性差异；P0.01， 有显著性差异。由表 4 可看出，模型组大鼠海马 CA3 区 Gray 型突触的突触界面曲率、突触间隙宽度、PSD 厚度均减小（P0.01），电针组大鼠海马 CA3 区 Gray 型突触的突触界面曲率、突触 间隙宽度、PSD 厚度均有所增大（P0.01），提示电针可有效改善突触的结构参数。3. 讨论血管性痴
19、呆（VD）是发生在脑血管病基础上的以记忆、认知功能缺损为主的获得性智 能的持续性损害。中医认为 VD 具有“年老体衰，虚弱邪蚀”，“病位在脑，实系五脏”的本虚 标实之证。百会位居巅顶，为三阳五会，取该穴可振奋人身之正气，醒脑开窍。背俞穴是脏 腑之气输注于背腰部的输穴，不仅可以治疗与其相应的脏腑病症，也可以治疗与五脏相关的 五官九窍、皮肉筋骨等病症。肾为先天之本，脾为后天之本，肾俞、脾俞合用可藏精生髓， 化生血气以养脑；在精血亏虚基础上常常伴有淤血阻滞经络，选取膈俞（血会），既养血又 活血，促进脑内瘀血消散。且膈俞、脾俞和肾俞还是膀胱经所属经穴，而“膀胱足太阳之脉， 起于目内眦其直者，从巅入络脑
20、”，故诸穴合用，可养血生精、藏精生髓、填髓充脑、 醒脑开窍，促进脑组织功能早日恢复。本实验的结果也表明，电针可以促进 VD 大鼠损伤神 经元的恢复，抑制神经细胞的凋亡，从而能够有效改善 VD 大鼠的学习记忆能力。海马是长时程陈述性记忆形成的主要部位，海马 CA3 区是学习记忆的重要部位。突触 是神经系统功能的特征性组织结构之一，是脑内信息加工的主要环节。在学习记忆的过程中均伴有突触形态与功能的变化，突触形态结构的变化，即突触的可塑性，也直接影响到机体 学习记忆的功能。从突触群体来说，可塑性表现为新突触形成（突触密度增大或数量增多）及突触重排等；但从单个的突触来看，其可塑性表现为结构的修饰，即某
21、些结构参数的改变6 。 突触间隙是一个神经元与另一个神经元信息沟通的部位，其大小与形态对突触活动的动力有重要影响。由于突触间隙的存在，以及化学信使有复杂的作用过程，神经讯号通过这类 突触时有明显的突触延搁存在 7,8 。有研究表明，学习记忆减退时突触间隙增大9,10。而本 实验用四血管阻断法导致的学习记忆下降的 VD 大鼠海马 CA3 区 Gray型突触的突触间隙 宽度却减小，其可能是由于阻断两侧椎动脉和夹壁双侧颈总动脉后，部分突触结构受损甚至 丢失，而存留的突触前后膜代偿缩短距离，试图增加突触传递功能。然而，该代偿功能不能 完全补偿因突触丧失引起的缺陷，最终未能改善学习记忆能力。而电针组突触
22、间隙明显增大， 说明电针可改善受损的突触间隙，使其逐渐恢复接近正常。突触后致密物（PSD）是近年来非常引人注目的一种突触亚结构，它是附于突触后膜胞 浆侧的一种超微结构，在所有的兴奋性突触中都可发现 PSD。目前学者认为 PSD 可能是突 触后膜内侧从胞浆中积累致密物而形成的。由于它的结构和成分多与突触传递功能密切相 关，长期以来一直认为 PSD 结构的改变可能反映了突触功效的变化6。 衰老9或短暂缺血 11使海马突触后膜致密物厚度减小，四血管阻断法导致的 VD 大鼠，海马 CA3 区突触的突 触后膜致密物厚度减小，其形态变化的内在机制可认为是通过蛋白质分子构象的可逆性变化 或蛋白质多聚体的拆卸
23、（解聚）使得 PSD 厚度变薄12。电针组动物 PSD 增大，说明电针可 抑制 PSD 厚度变薄，从而改善突触传递功能。突触界面曲率即是突触前膜与突触后膜隔着突触间隙相对应的界面的曲率，也就是突触 活性区的连接面的曲率。该界面常常有一定的弯曲度，它代表着突触连接面的形状，常常是 中枢突触结构可塑性的特征。VD 大鼠，其突触界面曲率减小，减少了神经元的接触面，大 大降低了神经信息传递的有效性，从而导致学习记忆能力下降。电针后突触界面曲率增大大，- 8 -较大的突触曲率可扩大接触面，保证其释放的递质到达靶部位，减少向周围间隙扩散，提高突触传递效应13，从而增强学习记忆能力。总之，由四血管阻断法造成
24、的 VD 大鼠，其海马 CA3 区 Gray 型突触形态结构发生显 著变化，从而影响突触的功能，导致学习记忆障碍。而针刺和电刺激结合使突触界面曲率、 突触间隙宽度、PSD 厚度均有明显增大，以此改善突触传递信息的功能，从而改善 VD 的学 习记忆能力。另一方面，本实验还提示电针对 Gray 型突触内部分子结构可能发生变化， 因此，进一步从分子水平探讨电针对突触内部结构的变化及其与学习记忆的关系，对于揭示 老年期痴呆学习记忆障碍的神经病理机制具有重要意义，从而为电针改善血管性痴呆学习记 忆能力提供进一步的理论依据。参考文献1 Kannayiram Alagiakrishnan，Kamal Mas
25、aki 著，刘玮，高志强译.血管性痴呆J.国外医学脑血管病分册，2004，12（11）：8742 闫兵，何利雷，许能贵等，电针对血管性痴呆大鼠学习记忆和海马 CA3 区 Gray 型突触超微结构的影 响J，中国临床康复，2006，10（39）：42-453 李忠仁主编，实验针灸学M，北京:中国中医药出版社，2003: 327329.4 Morris R G, Garrud P, Rawlins J N, et al. Place navigation impared in rats with hippocampal lessons J. Nature,1982,297(5868): 681,
26、PMID: 70881555包新民,舒斯云.大鼠脑立体定位图谱M.第 1 版.北京:人民卫生出版社,1991.17-83.6 韩太真, 吴馥梅. 学习与记忆的神经生物学M.北京医科大学，中国协和医科大学联合出版社,2072177 Pappas G D, Waxman S G. Synaptic fine structure: Morphological correlates of chemical and electrotonic transmission, in: G D. Pappas and D P Purpura (eds.). Structure and function of sy
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29、PMID: 1933359The Influences of Electroacupuncture on the Ultra Structure of the Hippocampus of VD RatsXu Nenggui，Tang Chunzhi，Yan Bing，He LileiGuangzhou University of TCM，Guangzhou（510405）AbstractObjective To observe the effect of electro-acupuncture on learn and memory abilities and the pathologymo
30、rphologic of nerve and the structure parameter of synapses in CA3 sector of thehippocampus on vascular dementia (VD) rats.Method: The VD rats were modeled with method of global ischemia reperfusion by 4 vascular occlusion (4-vo). Morris water tests were used for behavioral study. The changes of the
31、ultra structure parameter in CA3 sector of the hippocampus were studied with transmission electron microscope and picture analysis system.Results The model group animals needed more escape time than the control group, and they did not swim longer in platform quadrant than in the others in the Morris
32、 water tests. In the control group and electro-acupuncture group, the modality configuration of cells in CA3 sector of the hippocampus wasnormal, and the normal and abnormal chromatin was obvious. The configuration of endoplasmic reticulum、chondriosome and synapses was normal. The front and back mem
33、brane of the synapses wasclear. In the VD group, the cells were atrophied and dwindled. The front and back membrane of the synapses was illegible. The clearance, PSD and interphase curvature on area of Gray type synapsesin CA3 sector of the hippocampus in VD rats were decreased significantly.In elec
34、tro-acupuncture group, the animals cut the escape time mostly and they swam more times in platform quadrant than inother three quadrants. The clearance, PSD and interphase curvature on area of Gray type synapses inCA3 sector of the hippocampus in electro-acupuncture rats were increased significantly
35、.Conclusion Electro-acupuncture can improve learn and memory ability of VD rats by restraining the disappearance of nerve cells, and influencing the structure parameter of synapses in CA3 sector of the hippocampus.Keywords：Electroacupuncture，Hippocampus，Synapse，Ultra structure附图：图 1 假手术组（HE，1040）图 2 模型组（HE，1040）图 3 电针组（HE，1040）图 4 尼莫通组（HE，1040）图 5 假手术组（25000）图 6 模型组（25000）图 7 电针组（25000）图 8 西药组（25000）注：所示即为突触
