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1、2011届本科毕业论文（设计）产淀粉酶芽孢杆菌的筛选与鉴定姓 名：_ _系 别：_生命科学学院_专 业：_生物技术10-1_学 号：_100914051_指导教师：_ _2012年 10 月 31 日 产淀粉酶芽孢杆菌的筛选 1 实验意义 从环境中采集样品并从中分离纯化出能产生淀粉酶的芽孢杆菌，用于后期发酵。2 实验器材2.1土样:实验前三天在土壤5-8cm处埋馒头，实验前一天 2.2培养基的配方：筛选培养基: 淀粉 10.0g，酵母膏2.50g，蛋白胨 5g，Na2HPO4 2.50g， MgSO47H2O 0.05g，NaCl 0.05g，琼脂 10.0g，水 500mL，pH7.0 7.
2、42.3 器材：40个培养皿、酒精灯、接种环、14个试管、5个三角瓶（250ml）、 涂布棒、移液管、恒温水浴锅、恒温培养箱、高压灭菌锅、超净工作台2.4试剂2.4.1 淀粉酶活力测定：碘液2.4.2革兰氏染色：卢戈氏碘液、95%乙醇、香柏油、乙醇乙醚3 实验步骤3.1 培养基的制备及其仪器的灭菌 3.1.1量取500ml水，按培养基配方比例依次准确地称取淀粉（先将淀粉用水搅成糊状）、酵母膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中，加少量水熔解,再加入琼脂加热溶化，不行搅拌，最后补充水分，分装入试管内或三角烧瓶内，加塞包扎。3.1.2试管中倒培养基约3ml，再和剩余培养基、平板、移液管用报纸包扎好，于12
3、1， 30分钟高压蒸汽灭菌。 3.1.3倒平板 将灭菌的培养基冷至50左右，在超净工作台上，试管棉塞端搁在玻棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。三角瓶中的培养基倒平板，约10ml，静置待用。4.1 产淀粉酶菌株的分离、纯化41. 1采集土壤样本：用塑料袋在预处理处取样4.1.2 稀释称取土样5g，放入盛有45ml无菌水三角瓶中，使土样和水充分混合加玻璃珠，摇约10分钟，制成土壤悬浮液。然后将菌悬液置于80水浴锅中，20min。用一只无菌吸管吸取0.5ml土壤悬浮液加入盛有4.5ml含有无菌水的试管中充分混匀，此为10-1稀释液，依此稀释10-2、10-3、10-4、10-5几种稀释
4、度的土壤溶液，分别编号为1、2、3、4、5。4.2.1 初步筛选4.2.1.1用稀释样品的不同吸管分别依次从10-5、10-4、10-3样品稀释液中，吸取0.2mL于冷却凝固的平板上（每个梯度重复两次），用涂布棒涂抹均匀。记好编号。倒置于37温箱中培养24小时。4.2.1.2 培养24小时后，取出平板，挑取6株菌落（对光观察菌落旁有小透明圈或表面光滑的菌落），分别为1、2、3、4、5、6，进行三区划线培养24h。再在挑取菌落的旁边注入1-2ml碘液，观察其透明圈，因淀粉遇碘变蓝色，如菌落周围有透明圈，说明该菌能产生淀粉酶使其水解。记下菌株号1、2、3、4、6。观察透明圈一号菌株最大。4.3.1
5、分离纯化 在划线的平板中挑取形态大小相似的菌落，进行斜面划线培养24h，并保存。4.3.2挑取斜面上的菌落，点种到平板中，一平板中接3种不同编号的（，大小尽量一致，写上相应的编号），123号于一个平板，146于一个平板中，分别接3次，培养24h，48h、60h。4.3.3将上述不同时段平板中3种不同单菌落挑取，进行卢戈碘液染色观察其形态和芽孢。4. 3.3.1涂片：用牙签沾取少量菌体，涂在洗净的载玻片上4.3.3.2 染色：滴一滴卢戈碘液于菌体上，染色一分钟，在水龙头下慢慢冲洗染液。4. 3.33镜检：先用低倍观察，再用油镜滴加香柏油观察染色结果。菌体周围为紫色，内部有小部分无色，为芽孢。最后
6、用乙醚乙酯擦净镜头。观察结果： 24h菌体较小，基本无芽孢。48h后观察菌体形态较大，可以看清有芽孢的1和3号。60h后染色观察，菌体变大了。1和3及4号可见芽孢。4.4 高活力淀粉酶菌株的筛选：每染过一次后，就在菌落的周围滴加碘液，用尺子量取淀粉水解圈直径数据如下：12346124h10mm无12mm5mm无无48h无8mm14mm12mm10mm19mm60h无无17mm11mm13mm22mm数据分析：“无”可能由于接种环过热杀死了菌体；还有菌体较小基本无透明圈产生。有数据可知1号菌株生长较好，且透明圈最大。5、菌种保藏 将初步鉴定好的菌种斜面培养基试管收起，在37的恒温培养箱中培养。
