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1、新型复合酶在肉鸡饲料中的应用在家禽饲养上，随着玉米供给量的缺口越来越大，人们逐渐利用小麦、大麦和燕麦等饲料原料代替玉米来饲养家禽，但是当这类原料在家禽日粮中含量过多时，往往会造成饲料利用率差、家禽生长不良以及环境污染等问题，这主要与高木质纤维饲料原料中存在非淀粉多糖抗营养因子有关，这些抗营养因子会增加消化道食糜粘性，影响消化道生理形态，阻碍营养物质消化吸收，降低饲料转化率，影响肠道菌群，对家禽的健康成长造成不利的影响。消除抗营养因子的方法很多，主要包括物理方法、化学方法及生物方法。非淀粉多糖酶作为一种“绿色”添加剂，被认为是目前消除非淀粉多糖抗营养因子最有效的方法之一。饲料中的非淀粉多糖降解酶
2、，主要包括木聚糖酶、纤维素酶、木糖苷酶等。从整个世界范围来看，饲料酶的添加率不足60%，而在中国尚不足20%，饲料酶的应用还具有很大的上升空间。研究结果表明，在禾本植物纤维中，反式阿魏酸（4一羟基-3-甲氧基肉桂酸，ferulic acid简称FA）是含量最多的酚酸，在谷物的细胞壁中，反式FA主要是以酯键与半纤维素连接。半纤维素中的FA、双FA含量及连接方式决定了细胞的延长性、可塑性及降解性，因此断裂FA与半纤维素连接的酯键是提高半纤维素降解程度的重要因素。阿魏酸酯酶（EC 3.1.1.73feruloyl esterase，简称FAE），是重要的细胞壁降解酶，其主要生物功能是水解多糖与FA连
3、接的酯键，释放FA。目前国内的发酵饲料中还未有添加FAE的报道。课题组的前期研究结果及已有报道都表明，木聚糖酶及FAE能够共同降解植物细胞壁，同时释放FA和低聚木糖(xylooligosaccharide简称XOS )。XOS其无毒安全的特性，已成为最具潜力的动物保健品和抗生素替代品1。FA具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗突变、抗癌、抗动脉粥样硬化、抗血栓、降低胆固醇和降血脂等生理功能，在日本，反式FA已应用于食品添加剂中I121。随着畜牧业的迅速发展，研发高质量的饲料已经成为国内外研究的热点。另外，随着经济社会的发展，抗生素的危害已经越来越为人们所熟知，抗生素的少用或者不用是必然的发展方向。作者主
4、要报道了实验室自行发酵的FAE及商品饲料酶一溢多酶(主要含木聚糖酶(25000 U/g)、纤维素酶(800 U/g)、甘露聚糖酶（2000 U/g）、B一葡聚糖酶(30000 U/g)、一淀粉酶(300000 U/g)酶解解麦糟的工艺，及将酶解后的麦糟添加于饲料中饲喂肉鸡的实验结果。1.材料与方法1.1材料1.1.1主要试剂反式阿魏酸标准品：Sigma公司产品；阿魏酸甲酯：华侨大学曾庆友老师自行合成：低聚木糖标准品、木二糖标准品：日本和光纯药工业株式会社产品；葡萄糖标准品：上海国药化学试剂有限公司产品；溢多酶AF831:广州溢多利公司产品；玉米及豆粕：厦门市振裕饲料有限公司产品：预混料：厦门百
5、惠行科技有限公司产品；麦糟：厦门青岛啤酒厂产品。1.1.2仪器Agilent 1100高效液相色谱仪：美国安捷伦公司产品；HPX-42A柱：美国Bio-Rad公司产品；ODS-C 18色谱柱：美国Thermo公司产品：SP-2102UV紫外可见分光光度计：L海光谱仪器有限公司产品；超滤膜包Viva.flow 200:北京赛多利斯仪器有限公司产品。1.1.3菌种黑曲霉：作者所在实验室筛选保藏。1.1.4鸡苗青脚麻鸡：厦门五显镇三秀种禽厂提供。1.2培养基及其培养条件1.2.1种子培养基PDA培养基，36培养2d。1.2.2发酵培养基将麦糟烘干过65目筛，按m（麦糟）：m（麦麸）=4：1的比例，每
6、个搪瓷盘中加入麦糟和麦麸的混合物509及75 mL营养盐溶液，混匀，121灭菌30 min。每个搪瓷盘中接种12.5ml菌液，33培养6d。营养盐溶液：蛋白胨29，酵母粉49，NaH2P042H201.52 g,KH2P04 l g,CaC120.3 g,MgS04.7H200.3 g,Na2HP04 12Hz031.4 g,Na2HP04 2H2015.6g，用蒸馏水定容至IL。1.2.3FAE粗酶液制备1)发酵培养基抽提将发酵液加入1000 mL蒸馏水，置于33180 gmin的摇床中振荡2.5 h取出静置，用8层纱布过滤。2)发酵液浓缩在超滤膜相对分子质量为30000，进口压力为0.1
7、MPa，进料速度为200 mL/min,20操作条件下，超滤浓缩，浓缩后的FAE酶活达到20 U/mL以上。以上。1.3各种物质测定方法1.3.1FA测定按文献方法分析I131。1.3.2XOS测定按文献方法分析I13I。1.3.3还原糖测定采用DNS法114l。1.4复合酶酶解麦糟工艺研究1.4.1FAE添加量对麦糟酶解效果的影响称取5g含水量70%的麦糟置于50 mL三角瓶中，固定溢多酶的添加量为质量分数0.012%，分别以0、11、22、33、44、55 U添加浓缩后的粗酶液，50，酶解24 h。酶解后，往每个锥形瓶中加入20 mL的蒸馏水，40，浸提2.5 h后，4，10000 r/m
8、in，离心20min。取上清液测定FA、XOS、还原糖含量。1.4.2不同温度对麦糟酶解效果的影响添加FAE 8.8 U/g麦糟，控制酶解温度为20、30、40、50、600C，其他操作同1.4.1。1.4.3不同酶解时间对麦糟酶解效果的影响酶解温度为40，控制酶解时间为0、0.5、1、1.5、2、2.5、3d，其他操作同1.4.2。1.4.4不同含水量对麦糟酶解效果的影响酶解时问为2.5 d，调节麦糟含水量为30、40、50、60、70%，其他操作同1.4.3。1.4.5不同的酶解方式对麦糟酶解效果的影响麦糟含水量为50%，按(1)一(5)组添加各酶液，其他操作同1.4.4。(1)不加任何酶
9、液，放置60 h；(2)往麦糟中添加溢多酶0.006%，酶解24 h后，添加溢多酶0.006%（g/g麦糟），再酶解36 h；(3)往麦糟中添加FAE 4.4 U/g麦糟，酶解24 h后，添加FAE 4.4 U/g麦糟，再酶解36 h；(4)往麦糟中添加FAE 8.8 U/g麦糟及溢多酶0.012%（g/g麦糟），酶解60 h;(5)往麦糟中添加0.006%溢多酶，酶解12h后，添加FAE4.4 U/g麦糟，酶解12h后；加入溢多酶0.006%，酶解12h后，最后加入FAE 4.4 U/g麦糟，酶解24 h。1.5复合酶对肉鸡生产性能的影晌1.5.1麦糟的处理及饲料配方1)麦糟的处理各组麦糟分
10、别按如下处理：I组，每克含水量50%的麦糟加入0.3 mL蒸馏水：组，每克含水量50%的麦糟加入0.3 mL蒸馏水及溢多酶0.012%；组，每克含水量50%的麦糟加入6.6U FAE粗酶液；组，每克含水量50%的麦糟加入6.6 U FAE粗酶液及0.012%溢多酶；将上述麦糟在40下酶解60 h后，按肉鸡日粮配方添加入饲料中。2)饲料配方及营养水平肉鸡日粮标准参照（NY/r33-2004鸡饲养标准）中肉鸡营养需要，配制成粉状饲料，粗蛋白含量为19%，代谢能为12.34 MJ/kg。3)实验分组选用15日龄青脚麻鸡，称重，选出实验鸡，将肉鸡分为4组，每组5个重复，每个重复8只鸡（公母混合雏），实
11、验组1、2、3、4添加的麦糟分别按上述I、的方法处理，其他成分相同。1.5.2肉鸡饲养及管理试验场地为厦门市“仙灵旗”生态农牧科技有限公司新搭建养鸡场。采用地面平养方式饲养，全天光照，每天饲喂3次，自由采食、饮水，定时对鸡舍进行消毒清扫（每周两次），预饲期3d，实验时间为24 d，按正常肉鸡免疫程序进行免疫。在第17d41 d的早晨9:00空腹称重，记录投料量与剩料量，统计肉鸡的死亡率，计算每只鸡日增重，平均日采食量，料肉比。1.5.3数据统计分析数据采用SPSS 19.0软件的ANOVA进行方差分析，Duncan法进行多重比较，各组数据以平均数标准差表示，2.结果与讨论2.1复合酶酶解麦糟工
12、艺2.1.1添加不同量FAE对酶解效果的影响添加不同FAE酶量对麦糟进行酶解，结果如图1。由图l可知，随着FAE添加量的增大，FA、还原糖和XOS的含量都逐渐增大。添加的FAE酶活为6.60 U/g麦糟时，酶解得到的XOS含量达到最大，为1.76 g/L;添加酶量为8.80 U/g麦糟时，FA含量达到最大，为0.66 mg/L。但是进一步加大酶的添加量FA及XOS的含量却减少，一方面可能是酶液中的FA对酶产生抑制作用，从而影响了酶对麦糟的酶解效果；同时在固定溢多酶的添加量时，只有使得FAE添加的量合适，才能使两者的协同作用达到最大。综合考虑，选择FAE的添加量为6.60-8.80 U/g麦糟，
13、酶解效果较好。2.1.2不同温度对酶解效果的影响在不同温度下进行酶解，结果如图2。由图2可知，随着温度的升高，FA、还原糖及XOS的质量浓度均有所增加，当温度达到40时，FA及XOS的含量都达到最大，分别为0.52 mg/L和2.41 g/L，但是随着温度的继续升高，两者的质量浓度都下降，主要的原因是FAE和木聚糖酶都是不耐热的酶，当温度超过40时，酶活稳定性迅速降低1J5-161。温度达到50时，还原糖的质量浓度达到最大，为4.33 g/L，温度继续升高还原糖含量也下降。由此可知，复合酶最佳的酶解温度为40，此时复合酶的协同效应最佳。2.1.3不同酶解时间对酶解效果的影响对麦糟酶解不同时间，
14、结果如图3。由图3可知，随着酶解时间的延长，各个产物质量浓度均在不断的增加，2d时，还原糖达到最大值，为3.72 g/L，而2d之后随着时间的延长含量逐渐下降。FA及XOS则在2.5 d时达到最大值，分别为0.63 mg/L和1.20 g/L。反应酶解时间超过60 h，各产物的含量均在降低。这是因为随着酶解时间的延长，FA和XOS易被氧化而破坏。由于在2.5 d时，FA及XOS达到最高值，且还原糖含量也处于一个较高值，因此选定2.5 d为最佳的酶解时间。2.1.4不同水分质量分数对酶解效果的影响在不同水分质量分数下对麦糟进行酶解，结果如图4。由图4可知，当麦糟水分质量分数为50%时，酶解得到的
15、FA、还原糖和XOS的含量都达到最大，分别为0.64 mg/L，4.20 g/L和1.95 g/L。当麦糟水分质量分数高于或者小于50%时，FA、XOS和还原糖质量浓度都下降。因此选定50%为最佳的水分质量分数，进行酶解。2.1.5不同酶解方式对酶解效果的影响采用1.4.5的方法进行实验，结果如图5。由图5可知，同时加入溢多酶和FAE的实验组XOS及还原糖质量浓度最高，达到了5.1 g/L和3.87 g/L，FA质量浓度也较高，达到0.98 mg/L，所得的FA、XOS和还原糖含量较未添加任何酶的对照组分别提高了1.88倍，50倍，19.37倍：只加入溢多酶的实验组FA含量最高，达到了2.25
16、 mg/L，但XOS和还原糖质量浓度都很低；只加入FAE的实验组FA、XOS和还原糖质量浓度分别为0.84 mg/L，3.32g/L，2.03 g/L，但是比两种酶都加的效果差；分批加入溢多酶及FAE的各物质含量比起同时添加的质量浓度都低，FA、XOS和还原糖含量为0.91 mg/L，3.63 g/L，2.06 g/L。由此可知两种酶协同降解麦糟比单独添加，降解的效果更为显著，多酶协同降解麦糟具有更大的优越性，两种酶同时添加的效果又比分批添加的效果要好。2.2复合酶对肉鸡死亡率的影响将按5.2.4.1处理后的麦糟，以7%的比例添加入肉鸡基础日粮中，肉鸡饲养成活率结果如表1。饲喂全程中，饲料中未
17、添加任何的抗生素及其他的药，由表l可知各组鸡的病死亡率均为O，差异不显著(P0.05）。（FAE+溢多酶）组对降低料肉比具有极显著的作用(P0.05)。Yu等报道了将FAE、木聚糖酶、纤维素酶及一葡萄糖酶共同作用，燕麦的消化性比不加FAE提高了79%。Bartolome等J5I把来自黑曲霉的FAE或荧光假单胞杆菌的FAE与木聚糖酶共同作用于大麦和小麦的细胞壁，其游离的FA释放量提高了26倍。但单独使用FAE降解植物细胞壁，降解率也是较低的。Topakas等【18】报道FAE与木聚糖酶同时作用从植物细胞壁中释放的FA量是仅木聚糖酶单独作用时的6.3倍。作者主要是在饲料中同时添加溢多酶和FAE，二
18、者对木质纤维的降解具有协同作用，共同促进植物细胞壁的降解提高饲料的饲用效率，促进营养物质的吸收利用，同时产生FA及XOS也具有生理活性。3.结论1)麦糟酶解_T艺最佳酶解条件为：时间2.5 d，操作温度40，水分质量分数为50%，添加酶量为6.6-8.8 U/g麦糟。同时添加FAE和溢多酶，对麦糟的酶解效果较好，所得的FA、XOS和还原糖质量浓度较未添加酶的实验组分别提高了1.88倍，50倍，19.37倍。2)FAE及溢多酶均能够促进肉鸡的生长，但效果不显著，而同时添加FAE及溢多酶组能够显著促进肉鸡的生长，日增重提高4.37%，料肉比降低7.63%。杨道秀，李夏兰，陈培钦，王林林（华侨大学化工学院，福建厦门361021）食品与生物技术学报2013年笫32卷第4期
