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1、产植酸酶枯草芽孢杆菌生物饲料发酵参数的优化摘 要 研究旨在优化产植酸酶枯草芽孢杆菌生物饲料的发酵参数，试验采用 4 因子 5 水平正交设计和二因子有重复观察值的设计方法进行，通过测定发酵底物中的植酸酶活性，确定生物饲料发酵条件参数和发酵底料组成及接种比例。研究结果表明，产植酸酶枯草芽孢杆菌生物饲料优化发酵条件参数为温度 37 ，时间周期 72 h，底物初水分 30 %，初始 pH 7. 0; 底料组成和接种量的优化结果: 底料组成为棉粕 90 %和玉米 10 %; 接种量为 7. 0 mL/100 g。关键词 枯草芽孢杆菌 发酵饲料 发酵参数 棉粕中图分类号: S 816. 7 文献标志码:
2、A 文章编号: 1002 2813 ( 2013) 01 0027 05棉籽饼粕饲料中含有植酸抗营养因子，植酸的存在会对棉籽饼粕作为饲料的生物学效价产生一定的影响力。植酸会对动物在自身所必需的矿物质吸收利用上产生一系列的阻碍作用，如: 引发动物厌食、消瘦和生长缓慢等病症; 其次棉籽中的植酸减少了有效磷的利用率; 再次植酸还会影响动物对蛋白质的消化利用。饲料中添加植酸酶对提高畜禽业生产效益及降低植酸磷对环境的污染有重要意义。研究以产植酸酶枯草芽孢杆菌为菌种，以棉粕、玉米和麸皮为发酵底料，通过正交试验设计法，对枯草芽孢杆菌发酵饲料的发酵温度、时间、底物初始水分和初始 pH 等 4 个参数进行优化;
3、 以棉粕和玉米为发酵底物，通过二因子有重复观察值的设计方法，对发酵底料组成和接种量进行优化，最终确定枯草芽孢杆菌发酵饲料发酵工艺参数，为生产优质生物发酵饲料奠定基础。1 材料与方法1.1 试验样品及处理棉粕、玉米粉和麸皮: 均由新疆石河子天康饲料有限公司提供，粉碎，过 60 目筛。产植酸酶枯草芽孢杆菌生物饲料添加底物 100 g，底物中棉粕玉米粉麸皮为 721。菌株: 产植酸酶枯草芽孢杆菌 Z3，由新疆石河子大学动物营养实验室选育。营养琼脂培养基 ( 涂板用) : 0. 056 MPa 条件下，121 灭菌 15 min。植酸酶液体培养基 ( WBE) : 0. 056 MPa 条件下，121
4、 灭菌 15 min。1.2 种子液培养将枯草芽孢杆菌Z3 接入营养琼脂培养基，37 培养 24 h，挑取 1 环菌苔接入 20 mL ( 50 mL 三角瓶)植酸酶液体培养基，37 ，200 r/min 摇动培养15 h( 一级菌种) ，取 1mL 一级菌种接入 50 mL ( 150 mL三角瓶) WBE 培养基，37 ，200 r/min 摇动培养15 h ( 二级菌种) 。1. 3 枯草芽孢杆菌生物饲料发酵条件参数的优化试验采用 4 因子 5 水平正交设计试验法优化发酵条件参数，水平设置见表 1。根据 DpSV6. 05 统计软件中的正交设计法得到 4 因子 5 水平正交设计方案，见表
5、 3，利用该表来安排试验处理，每处理3 个重复，共计 75 个样本。发酵底物 100 g 放入500 mL 三角瓶中混合均匀，然后按表 3 加入不同体积的蒸馏水调湿，于 0. 056 MPa，121 条件下蒸饲料添加剂28 饲料研究 FEED RESEARCH NO 01，2013气灭菌15 min，冷却后接入1 mL 的二级种子液搅拌均匀，三角瓶 4 层纱布封口，按表 3 所设置的因子培养。发酵结束后，将发酵产物放入烘箱中，45 烘干 48 h，冷却后粉碎，过 60 目筛，装入样品袋，保存于 4 冰箱，待测。表 1 枯草芽孢杆菌固体发酵条件参数因子水平1 2 3 4 5温度/ 29 33 3
6、7 41 45时间周期/h 12 24 48 72 96底物初水分/% 30 40 50 60 70初始 pH 6. 0 6. 5 7. 0 7. 5 8. 01.4 底料组成和接种量的优化试验是在产植酸酶枯草芽孢杆菌生物饲料发酵条件参数优化的基础上进行的，即在确定了最优的生物饲料发酵条件参数后进行。试验采用二因子有重复观察值的设置 2 因子 5 水平共 25 个处理组合，见表 2。发酵底物的处理方法与枯草芽孢杆菌生物饲料发酵条件参数的优化试验相同。培养结束后，测定发酵产物鲜样中植酸酶的活性及枯草芽孢杆菌的数量。表 2 棉粕与玉米比例和接种量的因子与水平因子水平1 2 3 4 5接种量/ (
7、mL100 g 1) 1 3 5 7 9底物比例 ( 棉粕 玉米 ) 1000 9010 8020 7030 60401. 5 测定指标植酸酶活性的测定，测定方法参照 GB/T 18634 2009 进行，并参照 Sa 做了适当修改。将酶液用pH 5. 5 的乙酸钠缓冲液稀释至 1 000 倍，取 1 mL 于37 预热 5 min。然后加入 2 mol 的 5 mmol / L 植酸钠溶液，37 恒温反应 30 min 后立即加入 2 mL 颜色终止液。室温条件下静置 10 min 后，取 3 mL 上清液 415 nm 测光密度 ( OD) 值。空白对照是将酶液和终止液 37 温浴 30
8、min 后再加入底物植酸钠。植酸酶活性单位定义: 样品在植酸钠质量浓度为 5 mmol/L、温度 37 和 pH 5. 50 的条件下，每分钟从植酸钠中释放 1 mol 无机磷，即为 1 个植酸酶活性单位，用 U/g 表示。底物中枯草芽孢杆菌含量的测定: 采用平板计数法。1.6 数据统计方法应用 DpS6. 05 统计软件对表 3 进行正交方差及极差分析，对表 5 二因子有重复观察值的数据进行方差分析和多重比较。2 结果与分析2.1 枯草芽孢杆菌生物饲料发酵条件参数的优化从表 3 的极差 R 值和表 4 的 F 值结果分析可见: 对发酵产物植酸酶活性影响的主次效应因素顺序为温度 时间周期 初始
9、 pH 底物初水分。从表 4 可见: A、B、C 和 D 4 个因素的 F 值均大于 F0. 01( 4，50) 值，表明温度、底物初水分、初始 pH 和时间周期对发酵产物中植酸酶活性均有极显著的影响。各水平重复间的 F 值小于 F0. 05( 2，50) 值，表明各处理间结果差异不显著，重复性好，结果可靠。模型误差 ( e1) 的 F 值大于 F0. 01( 4，50) 值，表明 A、B、C 和 D 4 因素间有极显著的交互作用。从表 3 可见: 植酸酶活性最高的组合 14 ( A3B4C1D3) 植酸酶活性为 94. 048 U/g 。通过对 A、B、C 和 D 4 因素不同水平进行方差分
10、析，结果见表3 ( K 值) 。通过对 A ( 温度) 因素的各水平方差分析，K2与 K3及 K1与 K4水平间差异均不显著，K2和K3与K1、K4及K5水平间差异极显著。K2与K3水平的植酸酶活性高于K1、K4和K5的水平，表明发酵温度 33 和 37 均可，考虑生产实际，选择 37 为最佳温度。通过对 B ( 时间周期)因素的各水平方差分析，K5与 K1、K2、K3和 K4水平间差异极显著，K1与 K4及 K2与 K3水平间差异均不显著，K1和 K4水平的植酸酶活性均高于 K2、K3和 K5的水平，表明发酵时间 12 和 72 h 均可，考虑生存实际确定72 h 为优化结果。通过对 C (
11、 底物初水分) 因素的各水平方差分析，K1、K4和 K5间水平差异不显著，K2、K3和K4水平间差异不显著，K1和 K5与 K2和 K3水平间差异极显著; K1和 K5水平发酵产物中的植酸酶活性均大于 K2、K3和 K4，表明30 % 和 70 % 的水分均可，考虑生产实际，确定发酵产物中水分为 30 % 是最优条件。通过对 D ( 初始pH) 因素的各水平方差分析，K3和 K4与 K1、K2及K5水平间差异极显著，K3和 K4水平间差异不显著，且 K3和 K4水平发酵底物中的植酸酶活性均高于 K1、K2和K5水平，说明pH7.0 和8.0 均适宜，考虑生产实际及枯草芽孢杆菌生长适宜 pH，选
12、择发酵底物 pH7.0为宜。综上所述，试验的统计最优结果为温度 37 ，时间周期72 h，底物初水分30 %，初始 pH7. 0。从表 3 可见: 植酸酶活性最高的组合为组合 14饲料添加剂饲料研究 FEED RESEARCH NO 01，2013 29表 3 枯草芽孢杆菌生物饲料发酵条件参数的正交设计表 L25 ( 45)因素 评价指标 植酸酶活性/ ( Ug 1)试验号 A 温度/B 时间周期/hC 底物初水分/%D 初始 pH 误差项 r1r2r3平均值 位次1 1 ( 29) 1 ( 12) 1 ( 30) 1 ( 6. 0) 1 80. 678 97. 058 86. 698 88.
13、 145 72 1 ( 29) 2 ( 24) 2 ( 40) 2 ( 6. 5) 2 67. 693 68. 113 67. 903 67. 903 243 1 ( 29) 3 ( 48) 3 ( 50) 3 ( 7. 0) 3 74. 728 74. 238 74. 588 74. 518 184 1 ( 29) 4 ( 72) 4 ( 60) 4 ( 7. 5) 4 89. 253 92. 228 91. 528 91. 003 35 1 ( 29) 5 ( 96) 5 ( 70) 5 ( 8. 0) 5 82. 533 63. 633 74. 063 73. 41 206 2 ( 33
14、) 1 ( 12) 2 ( 40) 3 ( 7. 0) 4 101. 013 78. 333 89. 288 89. 545 57 2 ( 33) 2 ( 24) 3 ( 50) 4 ( 7. 5) 5 88. 413 91. 913 89. 428 89. 918 48 2 ( 33) 3 ( 48) 4 ( 60) 5 ( 8. 0) 1 68. 008 75. 638 73. 188 72. 278 219 2 ( 33) 4 ( 72) 5 ( 70) 1 ( 6. 0) 2 90. 478 77. 388 84. 038 83. 968 910 2 ( 33) 5 ( 96) 1 (
15、 30) 2 ( 6. 5) 3 74. 448 91. 948 82. 218 82. 872 1011 3 ( 37) 1 ( 12) 3 ( 50) 5 ( 8. 0) 2 85. 298 90. 758 85. 893 87. 317 812 3 ( 37) 2 ( 24) 4 ( 60) 1 ( 6. 0) 3 77. 843 87. 188 80. 643 81. 892 1213 3 ( 37) 3 ( 48) 5 ( 70) 2 ( 6. 5) 4 95. 028 92. 928 93. 768 93. 908 214 3 ( 37) 4 ( 72) 1 ( 30) 3 ( 7
16、. 0) 5 92. 263 96. 253 93. 628 94. 048 115 3 ( 37) 5 ( 96) 2 ( 40) 4 ( 7. 5) 1 79. 838 71. 473 76. 758 76. 023 1616 4 ( 41) 1 ( 12) 4 ( 60) 2 ( 6. 5) 5 91. 038 70. 948 80. 853 80. 947 1317 4 ( 41) 2 ( 24) 5 ( 70) 3 ( 7. 0) 1 95. 833 81. 763 88. 168 88. 588 618 4 ( 41) 3 ( 48) 1 ( 30) 4 ( 7. 5) 2 97.
17、 513 69. 233 80. 958 82. 568 1119 4 ( 41) 4 ( 72) 2 ( 40) 5 ( 8. 0) 3 76. 653 76. 023 76. 548 76. 408 1520 4 ( 41) 5 ( 96) 3 ( 50) 1 ( 6. 0) 4 67. 378 67. 588 67. 518 67. 495 2521 5 ( 45) 1 ( 12) 5 ( 70) 4 ( 7. 5) 3 88. 378 71. 228 78. 228 79. 278 1422 5 ( 45) 2 ( 24) 1 ( 30) 5 ( 8. 0) 4 69. 758 67.
18、 448 68. 638 68. 615 2323 5 ( 45) 3 ( 48) 2 ( 40) 1 ( 6. 0) 5 67. 378 81. 273 74. 028 74. 227 1924 5 ( 45) 4 ( 72) 3 ( 50) 2 ( 6. 5) 1 70. 178 68. 918 69. 373 69. 49 2225 5 ( 45) 5 ( 96) 4 ( 60) 3 ( 7. 0) 2 77. 983 71. 263 76. 688 75. 312 17K178. 995 7bB85. 046 1aA83. 249 4abA79. 145 1bB78. 904 7K28
19、3. 716aA79. 383bBC76. 821 1dB79. 023 8bB79. 413 4K386. 637 4aA79. 499 7bB77. 747 4cdB84. 402 1aA78. 993 4K479. 201 1bB82. 983 4aAB80. 286 1bcAB83. 758aA82. 113 1K573. 384 1cC75. 022 1cC83. 830 4aA75. 6054cB82. 509 8R 13. 253 3 10. 024 0 7. 009 3 8. 796 7 3. 605 0注: 同列数据肩标相同字母表示差异不显著，肩标不同小写字母表示差异显著，肩
20、标不同大写字母表示差异极显著。表 4 有重复观测值正交试验结果方差分析表 ( 完全随机模型)变异来源 平方和 自由度 均方 F 值 P F0. 01( 4，50) 值 F0. 05( 2，50) 值温度 2 050. 657 5 4 512. 664 4 18. 441 9 0. 000 1 3. 72时间周期 1 180. 512 3 4 295. 128 1 10. 616 5 0. 000 1 3. 72底物初水分 794. 873 2 4 198. 718 3 7. 148 4 0. 000 1 3. 72初始 pH 1 074. 974 6 4 268. 743 7 9. 667 4
21、 0. 000 1 3. 72重复组间 251. 450 9 4 62. 862 7 2. 471 7模型误差 ( e1)1 645. 900 2 8 205. 737 5 7. 934 7 0. 002 2. 56重复误差 ( e2)1 944. 663 75 25. 928 8合并误差 3 590. 563 2 83 27. 798 9( 94. 048 U/g) ，其底物发酵条件为温度 37 ，时间周期 72 h，底物初水分30 %，初始 pH7. 0，与统计最优结果相同。进一步确定枯草芽孢杆菌生物饲料发酵条件参数为温度37 ，时间周期72 h，底物初水分 30 %，初始 pH7. 0。
22、2.2 接种量和底料组成的优化通过枯草芽孢杆菌生物饲料发酵条件参数的优化试验，确定了最优生物饲料发酵参数为温度 37 ，时间周期 72 h，底物初水分 30 %，初始 pH 为7. 0。在确定发酵条件参数的基础上，进行接种量和底料组成的优化试验。2.2.1 接种量和底料组成对发酵底物中植酸酶的影响通过对表 5 中试验数据进行统计处理，得到不饲料添加剂30 饲料研究 FEED RESEARCH NO 01，2013同接种量和不同底料比例对发酵底物中植酸酶活性影响的统计结果，见表 6。结果表明，随着接种量的增加，发酵底物中植酸酶活性呈现逐渐降低又升高又降低的趋势，接种量为 7 mL/100 g 时
23、，植酸酶的平均活性最高 ( 74. 468 7 U/g) ，但与接种量为1、3、5 和 9 mL /100 g 相比差异不显著。随着底料比例的变化，发酵底物中植酸酶活性呈现先是升高又降低又升高再降低的趋势。当棉粕玉米为 9010时，平均植酸酶活性含量达到最高为72. 828 9 U/g，与 1000、8020、7030 和 6040 相比，差异不显著。确定接种量和底料组成的优化试验的优化组合为 E4F2。从表 6 统计分析结果可见: 接种量和底料组成对发酵底物中植酸酶活性均有极显著的影响，其主次因素为接种量( E) 底料组成( F) 互作效应 ( E F) 。由于互作效应差不显著，因此选择 E
24、4F2为最优组合。2.2.2 接种量和底料组成对发酵底物中枯草芽孢杆菌含量的影响通过对表 5 中试验数据进行统计处理，得到不同接种量和不同底料比例对发酵底物中枯草芽孢杆菌含量影响的统计结果，见表 7。结果表明，随着接种量的增加，发酵底物中枯草芽孢杆菌菌数呈现逐渐升高后降低的趋势，且接种量为 7 mL/100 g 时，枯草芽孢杆菌的平均数量最高 ( 956. 133 万 CFU/g) ，与接种量为1、3、5 和9 mL/100 g 相比差异极显著。随着底料比例的变化，发酵底物中枯草芽孢杆菌的数量呈现先升高后降低的趋势，且当棉粕 玉米为90 10 时， 平均枯草芽孢杆菌含量达到最高为639. 22
25、0 万 CFU / g，与 100 0、80 20 和 70 30 差异不显著，与 6040 相比，差异极显著。所以，接种量和底料组成的优化试验的优化组合为 E4F2。从表 7 统计分析结果可见: 接种量对发酵底物中枯草芽孢杆菌的含量具有显著的影响，底料组成对发酵底物中枯草芽孢杆菌的含量影响不显著。其主次因素为互作效应 ( E F) 接种量 ( E) 底料组成 ( F) 。由于互作效应差极显著，应进一步对接种量和底料组成各组合水平间进行多重比较。分析表 5 表明，试验处理 E4F2( 1 916. 7 万 CFU/g)的枯草芽孢杆菌数量高于其他组合，进一步确定优化组合为 E4F2。综上所述，最
26、终确定接种量和底料组成的优化试验的优化组合为 E4F2，即接种量为 7 mL/100 g，底料组成为棉粕玉米为 9010。表 5 二因子用重复观察值结果试验号 组合评价指标 ( 植酸酶活性) 评价指标 ( 枯草芽孢杆菌菌数)r1r2r3平均植酸酶活性/ ( Ug 1)r1r2r3平均菌含量/( 10 万 CFUg 1)1 E1F187. 188 88. 378 89. 148 88. 238aA23 25 28 25. 33deEFG2 E1F279. 943 90. 198 85. 928 85. 357aA4 2 4 3. 33eG3 E1F372. 978 63. 423 60. 588
27、 65. 633aA21 25 27 24. 33eEFG4 E1F468. 183 73. 048 78. 228 73. 153aA9 7 12 9. 33eFG5 E1F568. 078 60. 518 63. 423 64. 007aA6 15 13 11. 33eG6 E2F164. 508 64. 998 67. 378 65. 628aA3 2 3 2. 67eFG7 E2F293. 943 77. 493 74. 063 81. 833aA3 1 3 2. 33eG8 E2F360. 973 62. 863 61. 393 61. 743aA13 12 15 13. 33eG9
28、 E2F482. 218 101. 013 71. 928 85. 053aA108 101 112 107. 00bcBCDEF10 E2F557. 333 61. 813 84. 108 67. 752aA35 21 27 27. 67eEFG11 E3F164. 823 65. 103 64. 298 64. 742aA92 78 87 85. 67bcdBCDEF12 E3F266. 993 68. 183 67. 588 67. 588aA45 33 37 38. 33cdeDEFG13 E3F367. 063 67. 693 67. 168 67. 308aA132 102 116
29、 116. 67bABCD14 E3F467. 693 73. 958 71. 718 71. 123aA8 5 2 5. 00eG15 E3F566. 118 84. 878 62. 898 71. 298aA18 15 17 16. 67eFG16 E4F198. 423 96. 638 93. 593 96. 218aA114 102 123 113. 00bABCD17 E4F299. 263 98. 178 99. 718 99. 053aA197 192 186 191. 67aA18 E4F392. 193 87. 678 86. 523 88. 798aA135 138 143
30、 138. 67abAB19 E4F483. 583 95. 413 91. 108 90. 035aA132 176 146 151. 33abAB20 E4F571. 123 88. 623 67. 238 75. 662aA13 11 17 13. 67cdeCDEFG21 E5F193. 243 87. 468 95. 413 92. 042aA43 36 39 39. 33eFG22 E5F292. 263 94. 678 96. 218 94. 387aA124 108 143 125. 00bABC23 E5F387. 083 88. 133 79. 383 84. 867aA3
31、5 57 53 48. 33cdeCDEFG24 E5F470. 143 71. 263 72. 768 71. 392aA1 2 4 2. 33eG25 E5F597. 513 72. 698 76. 093 82. 102aA43 37 46 42. 00cdeDEFG注同表 3饲料添加剂饲料研究 FEED RESEARCH NO 01，2013 31表 6 不同水平底料组成和接种量对发酵产物中植酸酶活性的影响项目E 接种量 / ( mL100 g 1) F 底物比例 ( 棉粕玉米 )显著水平1 3 5 7 9 SEM 1000 9010 8020 7030 6040 SEM植酸酶活性/(
32、 Ug 1)63. 687 9aA62. 101 1aA59. 774 5aA74. 468 7aA71. 471 7aA1. 11 71. 748 9aA72. 928 9aA63. 282 8aA64. 2674aA59. 275 9aA1. 11PE0. 002 5PE PF0. 999 8PF0. 005 2注同表 3表 7 不同水平底料组成和接种量对优化发酵产物中的枯草芽孢杆菌菌数的影响项目E 接种量 / ( mL100 g 1) F 底物比例 ( 棉粕玉米 )显著水平1 3 5 7 9 SEM 1000 9010 8020 7030 6040 SEM枯草芽孢杆菌/(10万CFUg1
33、)23. 321 7cC34. 2333bcBC49. 144 7bB95. 611 3aA49. 099 7bB1. 11 52. 966 7aA63. 922aA59. 677 7aA48. 833aAB26. 011 3bB1. 11PE0. 022 5PE PF0. 000 1PF0. 388 93 结论产植酸酶枯草芽孢杆菌生物饲料发酵参数的优化组合为 14 ( A3B4C1D3) ，即温度 37 ，时间周期 72 h，底物初水分 30 %，初始 pH 为 7. 0。底料组成和接种量的优化结果为 E4F2，即底料组成为棉粕 90 %，玉米 10 %; 接种量为 7. 0 mL/100
34、g。通信地址: 新疆石河子大学北区动物科技学院14 号楼 404 室檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪832003( 上接第 26 页)和其他手段进行筛选育种，从而得到高产菌株还有待进一步研究。2.3 纤维素酶活力葡萄糖标准曲线为: y = 0. 002 8x 0. 029 9，R2= 0. 996 1。表 3 不同培养时间红曲霉粉纤维素酶活力大小组别 OD 值羧甲基纤维素钠对照值酶液对照值3，5 二硝基水杨酸对照值酶活力/( Ug 1)A 组 1. 774 0. 071 1. 728 0. 1 22. 5B 组 1. 769 0.
35、071 1. 706 0. 1 31. 0C 组 1. 772 0. 071 1. 714 0. 1 28. 5D 组 1. 491 0. 071 1. 438 0. 1 26. 0从表 3 可见: 在消除了羧甲基纤维素钠、粗酶液和3，5 二硝基水杨酸的影响后，对应葡萄糖标准曲线，计算出的纤维素酶活力分别为 22. 5、31. 0、28. 5 和 26. 0 U / g，可以看出，在一定范围内，随着培养时间的延长，纤维素酶活性有升高的趋势，具体趋势如何，有待进一步试验验证。自然界中，纤维素类物质是一类最廉价且最丰富的可再生资源，如果天然存在的这些纤维素可以有效降解，在化石能源日益枯竭的今天，对
36、解决能源危机和环境污染等社会焦点问题具有重大的现实意义，利用纤维素酶的水解作用水解纤维素就是一条很好的环保无污染的利用纤维素的途径。目前，纤维素的微生物降解机制已经被普遍接受，但是纤维素酶的产量和活性都不高，成本却很高，今后，应该加强菌种选育的基础研究工作，分离和筛选出高产纤维素酶的菌种，多菌种共同发酵的时候，更要注意兼容性和混菌发酵效果。3 结论试验结果表明: 在红曲霉 中药合生元制剂干粉和湿粉中，淀粉酶活力在 241 245 U/g，水平相对较高; 蛋白酶活力很低，几乎没有。纤维素酶活力在 22 31 U/g，水平相对较低。通信地址: 吉林省延吉市公园路 977 号延边大学农学院动物科学系动物营养与饲料科学教研室 133000
