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1、GB 4789.35-2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验 录入时间:2010-4-28 9:02:54 来源：国家卫生部前 言 本标准代替GB/T 4789.35-2008食品卫生微生物学检验 食品中乳酸菌检验。 本标准与GB/T 4789.35-2008相比，主要变化如下： 修改了乳酸菌总数、乳杆菌、双歧杆菌和嗜热链球菌的计数方法。 本标准的附录A为规范性附录。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： GB 4789.35-1996、GB/T 4789.35-2003、GB/T 4789.35-2008。 1 范围 本标准规定了含乳酸菌食品中乳酸菌（lactic aci
2、d bacteria）的检验方法。 本标准适用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的检验。 2 规范性引用文件 本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。 3 术语和定义 3.1 乳酸菌 lactic acid bacteria 一类可发酵糖主要产生大量乳酸的细菌的通称。本标准中乳酸菌主要为乳杆菌属（Lactobacillus）、 双歧杆菌属（Bifidobacterium）和链球菌属（Streptococcus）。 4 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备
3、和材料如下： 4.1 恒温培养箱：361。 4.2 冰箱：25。 4.3 均质器及无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵。 4.4 天平：感量 0.1 g。 4.5 无菌试管：18 mm180 mm、15 mm100 mm。 4.6 无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。 4.7 无菌锥形瓶：500 mL、250 mL。 5 培养基和试剂 5.1 MRS（Man Rogosa Sharpe）培养基及莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）改良 MRS 培养基：见附录 A 中 A.1。 5.2 MC 培养基（Modified Chalmer
4、s 培养基）：见附录 A 中 A.2。 5.3 0.5 %蔗糖发酵管：见附录 A 中 A.3。 5.4 0.5 %纤维二糖发酵管：见附录 A 中 A.3。 5.5 0.5 %麦芽糖发酵管：见附录 A 中 A.3。 5.6 0.5 %甘露醇发酵管：见附录 A 中 A.3。 5.7 0.5 %水杨苷发酵管：见附录A中A.3。 5.8 0.5 %山梨醇发酵管：见附录A中A.3。 5.9 0.5 %乳糖发酵管：见附录A中A.3。 5.10 七叶苷发酵管：见附录A中A.4。 5.11 革兰氏染色液：见附录A中A.5。5.12 莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）：化学纯。6 检验程序 乳酸菌检验程序
5、见图1。7 操作步骤 7.1 样品制备 7.1.1 样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。 7.1.2 冷冻样品可先使其在 25条件下解冻，时间不超过 18 h，也可在温度不超过 45的条件，解冻时间不超过15min。 7.1.3 固体和半固体食品：以无菌操作称取 25 g 样品，置于装有 225 mL 生理盐水的无菌均质杯内， 于 8000 r/min10000 r/min 均质 1 min2 min，制成 1:10 样品匀液；或置于 225 mL 生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min2 min 制成 1:10 的样品匀液。 7.1.4 液体样品：液体样品应先将其充分摇匀
6、后以无菌吸管吸取样品 25 mL 放入装有 225 mL 生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分振摇，制成 1:10 的样品匀液。 7.2 步骤 7.2.1 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 mL，沿管壁缓慢注于装有 9 mL 生理盐水的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成 1:100 的样品匀液。 7.2.2 另取 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做 10 倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用1次 1mL 灭菌吸管或吸头。 7.2.3 乳酸菌计数 7.2.3.1
7、 乳酸菌总数 根据待检样品活菌总数的估计，选择 2 个3 个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取 0.1 mL 样品匀液分别置于 2 个 MRS 琼脂平板，使用 L 形棒进行表面涂布。361，厌氧培养 48 h2 h 后计数平板上的所有菌落数。从样品稀释到平板涂布要求在 15min 内完成。 7.2.3.2 双歧杆菌计数 根据对待检样品双歧杆菌含量的估计，选择 2 个3 个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取 0.1 mL样品匀液于莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）改良 MRS 琼脂平板，使用灭菌 L 形棒进行表面涂布，每个稀释度作两个平板。361，厌氧培养 48 h2 h 后计数平板上的所有菌
8、落数。从样品稀释到平板涂布要求在 15 min 内完成。 7.2.3.3 嗜热链球菌计数 根据待检样品嗜热链球菌活菌数的估计，选择 2 个3 个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取 0.1 mL 样品匀液分别置于 2 个 MC 琼脂平板，使用 L 形棒进行表面涂布。361，需氧培养 48 h2 h 后计数。嗜热链球菌在 MC 琼脂平板上的菌落特征为：菌落中等偏小，边缘整齐光滑的红色菌落，直径 2 mm1 mm，菌落背面为粉红色。从样品稀释到平板涂布要求在15 min 内完成。 7.2.3.4 乳杆菌计数 7.2.3.1 项乳酸菌总数结果减去7.2.3.2 项双歧杆菌与7.2.3.3 项嗜热链球菌计
9、数结果之和即得乳杆菌计数。 7.3 菌落计数可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落 形成单位（colony-forming units，CFU）表示。 7.3.1 选取菌落数在 30 CFU300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于 30 CFU 的平板记录具体菌落数，大于 300 CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。 7.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板
10、后乘以 2，代表一个平板菌落数。 7.3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。 7.4 结果的表述7.4.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每 g（mL）中菌落总数结果。7.4.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算：式中：N样品中菌落数； C平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；n 1第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；n 2第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；d稀释因子（第一稀释度）。7.4.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于 300 CF
11、U，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。 7.4.4 若所有稀释度的平板菌落数均小于 30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计 算。 7.4.5 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于 1 乘以最低稀释倍数计算。 7.4.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在 30 CFU300 CFU 之间，其中一部分小于 30 CFU 或大于 300 CFU 时，则以最接近 30 CFU 或 300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 7.5 菌落数的报告 7.5.1 菌落数小于 100 CFU 时，按四舍五入原
12、则修约，以整数报告。 7.5.2 菌落数大于或等于 100 CFU 时，第 3 位数字采用四舍五入原则修约后，取前 2 位数字，后 面用 0 代替位数；也可用 10 的指数形式来表示，按四舍五入原则修约后，采用两位有效数字。 7.5.3 称重取样以 CFU/g 为单位报告，体积取样以 CFU/mL 为单位报告。8 结果与报告 根据菌落计数结果出具报告，报告单位以CFU/g（mL）表示。9 乳酸菌的鉴定（可选做） 9.1 纯培养 挑取 3 个或以上单个菌落，嗜热链球菌接种于 MC 琼脂平板，乳杆菌属接种于 MRS 琼脂平板，置 36 1 厌氧培养 48 h。 9.2 鉴定 9.2.1 双歧杆菌的鉴定按 GB/T 4789.34 的规定操作。 9.2.2 涂片镜检：乳杆菌属菌体形态多样，呈长杆状、弯曲杆状或短杆状。无芽胞，革兰氏染色阳性。 嗜热链球菌菌体呈球形或球杆状，直径为 0.5m2.0m，成对或成链排列，无芽胞，革兰氏染色阳性。 9.2.3 乳酸菌菌种主要生化反应见表 1 和表 2。
