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1、血涂片的制备与染色,血涂片的制备,制备合格的血涂片，是血液学检查的最基本的技术和方法，血片的质量及染色的好坏，直接影响到细胞形态的观察、和诊断。,（一）载玻片的清洁,1.新玻片：常带有游离碱质，用1mol/L HCl 浸泡24h，清水冲净，干燥备用。2.用过的玻片：肥皂（洗涤剂）水煮沸20 min，再用 热水将肥皂和血膜洗净，清水反复冲洗，干燥备用。3.急用玻片：置0.95L/L乙醇中浸泡1h，蒸馏水洗净后，擦干或烘干备用。,(二)制作血涂片的标本,最好用非抗凝的静脉血和毛细血管血，也可用EDTA抗凝血制备。EDTA抗凝血中，因Ca2+被螯和，阻止PLT的聚集，推片时PLT均匀平铺，显微镜下易
2、于观察其形态，但有时会看到EDTA引起的RBC皱缩及WBC丛集现象，应注意。随着全自动血细胞分析仪的普及，多用EDTA抗凝血。有些血细胞检查流水线，还可自动推片、染色。,(三)血涂片的制备,方法：手工推片法 自动推片法 厚膜涂片法等,取血约50ul,将推玻片向1的方向稍抽回，当血液充满推玻片的宽度后，以一定均匀的速度向2的方向滑动。,注意：血滴大，速度快、角度大-血膜厚,*一张良好的血片要求：,厚薄适宜，头、体、尾分明，边缘整齐，细胞分布均匀；血膜与载玻片的两边和两端分别留有一定的空隙（0.3cm和1.5cm），血膜长度占载玻片的2/3左右。玻片的一端应留有贴标签的地方。,1.5cm,0.3c
3、m,临沂市人民医院,白细胞显微镜分类,制血膜 瑞氏染色 显微镜分类,白细胞分类镜检部位及计数方法,血涂片注意事项,注意血滴大小、推片角度（2530角）速度、用力均匀；注意HCT及血液粘稠度每次使用清洁的推片，以免异常细胞的相互污染。涂片制成后，在空气中挥动，使其迅速干燥，天气寒冷或潮湿时，置37温箱干燥。干燥后编号,2.厚血膜涂片法,末梢血1滴（约20l）于玻片中央，用推片一角将血由内向外旋转涂布，制成厚薄均匀、直径约1.5cm的圆形血膜，自然干燥后，滴加数滴蒸馏水，使RBC溶解，脱去血红蛋白，将水倒掉，血膜呈灰白色，干后染色镜检。特点：血量多，待检成分集中。适用于：疟原虫、微丝蚴等检查,3.
4、自动推片机法,标准化,自动化,智能化,第四部分血细胞常用的染色方法,细胞染色技术,细胞涂片，在光学显微镜观察之前需要固定、染色。固定：将细胞蛋白质和多糖等成分迅速交联和凝固，以保持细胞原有的形态结构不发生变化。染色目的：使细胞的主要结构（细胞质、细胞核、细胞器等）染上不同的颜色，便于显微镜下观察。常用的染色方法：有瑞氏、姬姆萨、巴氏、HE染 色等。,细胞染色法类型,1 普通染色法：如Wright、Giemsa、Papanicolaou、HE染 色法等。2 荧光染色法：如吖啶橙荧光染色，使细胞内DNA呈现黄 绿色荧光，使RNA显桔红色荧光。用于精子 和阴道分泌物的的细胞检查。3 细胞活体染色法：
5、活体染料有灿烂甲酚蓝、新亚甲蓝、中 性红等，如RET染色。4 细胞化学染色法：利用化学反应显示细胞内某些成分的存 在和数量。被显示的物质有核酸、蛋白质、脂类、糖类、酶类及其他物质等。近年来，把单克隆抗体技术、酶标记技术等应用于细胞化学染色中，发展成为细胞免疫化学染色法。能特异、灵敏地显示细胞内的一些抗原和半抗原物质，应用越来越广泛。,碱性染料：为阳离子染料，能接受质子，染细胞核 的染料。如亚甲蓝、天青。,酸性染料：为阴离子染料，能释放质子。主要有荧 烷-氧杂蒽染料和偶氮染料两类，能结合 细胞的碱性成分并染色，如血红蛋白、嗜酸性颗粒成分等。,3.复合染料：同时具有阴、阳离子型的染料如瑞氏染料,（
6、一）瑞氏(Wright)染色,Wright 和Giemsa 都是在Romanowsky染色法基础上演变而来，都是含有伊红和美蓝的复合燃料。瑞氏染色法常用于血液、其他体液、分泌物、排泄物等涂片中各种细胞的染色。特点：将固定和染色和在一起进行，操作简单，染色时间短，对WBC胞质中的特异性颗粒着色较好，但 对核的着色略差。,1.瑞氏染液 由酸性染料伊红和碱性染料美蓝组成的复合染料。伊红是钠盐，有色部分为阴离子，美蓝是氯盐，有色部分为阳离子。美蓝和伊红的水溶液混合后，产生一种不溶于水的伊红化美蓝（ME）中性沉淀，即瑞氏染料。将瑞氏染料用适量甲醇溶解，即成为瑞氏染液 甲醇 ME M+E-,Wright染
7、液配制：,瑞氏染粉 0.1g 甲醇（AR）60.0ml 研磨法；直接溶解法 配好的染液置室温一周后使用，时间越长效果越好，久置时应密封，防止甲醇挥发和氧化，也可加甘油3ml，防挥发且细胞着色清晰,甲醇作用：,作为溶剂:能将瑞氏染料解离成带正电荷的天青B和带负电荷的伊红。固定细胞（脱水）使蛋白沉淀成颗粒状、网状结构，增加与染料的接触面积，提高对染料的吸附作用，增强染色效果。,*2.细胞的着色原理,既有化学的亲和作用，又有物理的吸附作用。不同的细胞因其所含的化学成分不同，对燃料的亲和力也不同。细胞中的碱性物质与酸性染料伊红结合染成红色，该物质又称嗜酸性物质（Hb、嗜酸性颗粒等）。细胞中的酸性物质与
8、碱性染料美蓝结合染成蓝色，该物质又称嗜碱性物质（如嗜碱性颗粒、淋巴细胞胞浆等）中性颗粒呈等电状态，与伊红美蓝均能结合，染成紫红色,3.环境PH值对细胞染色的影响,细胞成分多为蛋白质，蛋白质具有两性电离，环境PH值决定其带电荷的多少，对H+浓度较敏感。PHPI:碱性环境，蛋白质分子带负电荷多，易与 碱性美蓝结合，偏碱：出现异常蓝染。PHPI:酸性环境，蛋白质分子带正电荷多，易与酸 性伊红结合，因此偏酸：氢离子较多，降低对碱性染料 的亲和力，增强伊红着色，出现异常红染。最佳PH：6.46.8，应使用缓冲液。同时使用优质甲醇（AR）和清洁的中性玻片。,【染色方法】,以血涂片为例血膜干后，在两端用蜡笔
9、化线，平放在染 色架上；加染液数滴，固定1min；加等量或稍多的缓冲液，与染液充分混匀，染510min；清水冲去染液，干后镜检。,5.染色结果分析,正常情况下血膜外观:为淡紫红色，显微镜下:RBC:呈粉红色，厚薄均匀处略有碟状感；WBC:浆中颗粒清楚，色彩鲜明，显示出各种细胞特有的 颜色，核为紫红色，染色质结构清楚。偏酸：RBC、嗜酸性颗粒偏红，WBC核淡蓝或不着色。偏碱：细胞灰蓝色，颗粒深暗，嗜酸性颗粒呈暗褐、黑色，中性颗粒变粗，色深，血膜厚处呈绿色。,6.注意事项：a.血膜要干透后才能染色，否则染色时易脱落 b.染色时间与染液浓度、室温及细胞多少有关，一般染液稀释度大、染色时间长些细胞着色
10、匀称鲜艳。c.染液不能过少，以防蒸发沉淀。d.冲洗时不能先倒掉染液，应以流水冲，防染料沉着。冲洗时间也不能长。e.染色过淡，可复染。f.染色过深，可用甲醇数滴稍停，用水冲洗脱色,（二）姬姆萨染色法,【染色原理】与瑞氏法相同，改进了染料的质量，该染料对细胞核和寄生虫着色较好，结构更清晰，胞浆与中性颗粒染色较差。【试剂】贮存液：Giemsa染粉 0.5g 甲醇 33.0ml 纯甘油 33.0ml。将Giemsa染粉置甘油中，60水浴2h溶解后，加入60预热的甲醇，混匀置棕色瓶中，放室温数天后使用。用时以PH6.8 PBS稀释1020倍。,【染色方法】,1 将干燥血膜用甲醇固定35min，2 将固定后的血膜置于稀释的染液中，染1030min。3 取出后用流水冲洗，干后镜检。,（三）瑞氏-姬氏复合染色法,【染色原理】综合两法的优点，细胞核、浆、颗粒等染色效果好，为全国临床检验操作规程首选方法。【染液配制】瑞氏染粉 0.3g 姬氏染粉 0.3g 甲醇(AR)500ml(可加入10ml甘油)研钵研磨,保存于棕色瓶中,早晚各振摇3min,共5天，一周后过滤后使用。【染色方法】干燥血膜置染色架上，滴加染液35滴，覆盖 整个血膜固定1min，再滴加缓冲液（PBS，PH6.8）滴,充分混匀,染min510,流水冲去染液,干后镜检。,
