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1、情境2 器官代谢检测,Company Logo,子情境2,子情境1,Company Logo,情景2 器官代谢检测,子情景1 肝功能检测患者的准备与样本采集样本的接受与处理样本的检测实验结果的分析与报告废物处理,Company Logo,患者的准备与样本采集,Company Logo,子情景1 肝功能检测,患者准备：空腹采血(急症检测或监测项目除外）。取血的当晨病人不宜做剧烈的运动，避免情绪激动，取血前应有10分钟的休息。样本由临床护士采集，采血前应向患者作适当解释，以消除疑虑和恐惧，并遵照医嘱作好样本采集前所用的容器以及消毒器材、一次性注射器等备用。首先确认患者姓名，并将标识贴于真空采血管上
2、。一般的医院将“患者姓名+申请序号”作为患者原始样品的唯一识别。对申请者指导：申请者必须对患者讲清楚检验的目的、采血时间及注意事项。在填写检验申请单时，应完整填写申请单中的各项内容，字迹必须清楚，包括患者姓名、性别、出生日期、科别、床号、病案号、住院号、申请日期、申请序号、标本类型、临床诊断或主要症状、申请检验项目及特殊说明如应用的药物等，检验申请单还应具有标本采集日期和时间、接收标本日期和时间等以便相关人员填写相关内容。,Company Logo,子情景1 肝功能检测,样本采集：肝炎标志物静脉采血3ml于绿色盖（肝素抗凝）采血管中。其它项目静脉采血3-4ml于黄色盖（分离胶）采血管中。样本运
3、送及保存：标本采集后应立即送检，不能立即送检的应于2小时内分离血清。标本的运送必须保证运送过程中的安全，防止溢出。溢出后应立即对环境进行消毒处理,Company Logo,子情景1 肝功能检测,样本的接收与拒收的标准：要根据实验室的实际情况制定出符合本室的拒收标准，如血量不足、溶血、标识与申请单不一致等，对拒收的要做好详细的记录，并及时通知临床重新留取标本。急诊样本的处理：急测项目即采、即送、即检、即出结果。检测过样本的保存：检测后的标本在冰箱保存一周后再丢弃（肝炎标志物标本保存一个月），以备需要时查询。,Company Logo,子情景1 肝功能检测,Company Logo,第一节 概 述
4、,Company Logo,一、肝脏结构,（一）解剖学特点,双重血液供应,腹主动脉的分技肝动脉,氧,门静脉,营养,双重输出管道,肝静脉,代谢降解物,下腔静脉,胆道系统,脂溶性物质及其代谢产物,体外,Company Logo,（二）肝脏的显微结构特点,1、组织结构,2、亚细胞结构,（三）细胞的再生,Company Logo,二、肝脏的生物化学功能,排泄功能物质代谢功能生物转化,重要生化功能,Company Logo,（一）排泄功能,主要排泄对象：胆汁酸、胆红素、氨,1、胆汁酸代谢,（1）胆汁的分泌：,胆汁功能：促进脂类的消化吸收，同时能将体内某些代谢产物及生物转化产物不断地排入肠道随粪便排出体外
5、。,胆汁的来源：,肝胆汁 胆囊胆汁 十二指肠,胆汁的成分：,水/胆汁酸（盐）、卵磷脂、蛋白质、脂肪酸和胆固醇,Company Logo,（2）胆汁酸生成及种类：,初级胆汁酸（肝细胞）次级胆汁酸（肠道）,初级游离胆汁酸初级结合胆汁酸（甘氨酸/牛磺酸）次级游离胆汁酸次级结合胆汁酸（甘氨酸/牛磺酸）,Company Logo,（3）胆汁酸肝肠循环：,（4）胆汁酸的功能：,促进脂类消化促进脂类吸收抑制胆固醇从胆汁中析出沉淀,游离型胆汁酸,结合型胆汁酸,Company Logo,2、胆红素代谢,胆色素,尿胆素原 粪胆素原尿胆素粪胆素胆绿素胆红素,未结合胆红素(单核吞噬细胞系统如骨髓、脾脏),结合胆红素（
6、肝脏）,胆素原,Company Logo,部位肝脏细胞,鸟氨酸,瓜氨酸,瓜氨酸,精氨酸代琥珀酸,ATP,AMP+PPi,延胡索酸,鸟氨酸,精氨酸,H2O,尿素,天门冬氨酸,NH3,CO2,氨甲酰磷酸,+H2O,尿素循环,Company Logo,（二）物质代谢功能,1、营养物质代谢,2、激素及维生素代谢,(1)在蛋白质代谢中的作用(2)在氨基酸代谢中的作用(3)在糖代谢中的作用(4)在脂代谢中的作用,激素的灭活主要在肝脏进行,多种维生素能在肝细胞内储存并进行转化,Company Logo,三、肝脏疾病的生化改变,（一）胆红素代谢障碍（黄疸）,定义:,黄疸分类:,黄疸,和阻塞性黄疸,溶血性黄疸,
7、肝细胞性黄疸,高胆红素血症,Company Logo,（二）胆汁酸代谢障碍,1、胆汁酸合成障碍2、胆汁酸向肠道排出障碍3胆汁酸肠肝循环紊乱4胆汁瘀积病变时胆汁酸代谢紊乱,Company Logo,（三）血浆酶异常,1肝脏合成酶类:胆碱脂酶、凝血因子、铜蓝蛋白；2.肝细胞内酶:ALT、AST 3肝脏阻塞性疾病酶活性改变：ALP、GGT4肝硬化疾病酶活性改变：单胺氧化酶（MAO）,（四）血浆蛋白异常,Company Logo,第二节 肝功能试验,血清（浆）蛋白测定血清酶测定血清胆红素测定血清胆汁酸测定血氨测定,Company Logo,酶学分析技术的应用,Company Logo,酶活性测定的基本
8、知识,酶活性的概念 酶活性单位 酶活性单位的计算 酶促反应进程 酶促反应底物动力学,Company Logo,一、酶活性的概念,酶活性即酶促反应速度，指在规定条件下单位时间内底物的减少量或产物的生成量。,底物浓度为S,产物浓度为P,时间为t，反应速度为v,v=-dS/dt 或 v=dP/dt。,注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间内产物的生成量为好。,Company Logo,二、酶活性单位,定义：指在一定条件下使酶促反应达到某一速度时所需要的酶量。酶活性单位是一个人为规定的标准。,惯用单位：酶活性测定方法的建立者所规定的单位。国际单位：1IU指在规定条件（最适pH，最适底物浓度）下，
9、每分钟转化1mol底物的酶量。单位为IU/L。Katal单位：1Katal指在规定条件下，每秒钟转化1mol底物的酶量，1Katal=60106IU。,Company Logo,三、酶活性单位的计算,步骤：,运用公式进行计算。,明确测定方法的酶单位定义，按照酶单位定义确定物质量、体积和时间的单位，,Company Logo,计算公式:,产物的增加量 每单位规定的保温时间 1000（ml）酶单位/升=每单位规定的产物增加量 实际保温时间 实际标本用量（ml）,分光光度法测定的公式：,（A测定 A对照）V总106 每单位规定的保温时间酶单位/升=LV标 实际保温时间,Company Logo,四、
10、酶促反应进程,酶促反应进程曲线,Company Logo,酶量的测定：,通过酶活性测定间接测得酶的含量，因此，要准确测定酶量，应使酶浓度（E）与酶促反应速度成正比，即E-dS/dt或EdP/dt。能够真正代表酶活性大小的是线性期的酶促反应速度，即酶促反应初速度。酶活性测定时首先要确定线性期，在此期测定反应速度才能准确代表酶活性。,酶的含量,酶活性,酶促反应初速度,Company Logo,五、酶促反应底物动力学,中间产物学说：,酶促反应进行时，酶首先与底物结合为中间产物，然后再催化底物反应生成产物。E+S ES E+P,Company Logo,米-曼氏方程：,VmaxSv=S+Km,上式中v
11、代表反应速度，Vmax代表最大反应速度，S代表底物浓度，Km称为米氏常数。,Company Logo,（一）米氏常数的定义,由米-曼氏方程可以导出：,（Vmax-v）SKm=v,当v=1/2Vmax时，Km=S。因此Km值为反应速度相当于最大反应速度一半时的底物浓度。Km值是酶的特征常数，具有重要的应用价值。,Company Logo,（二）Km值的应用,1.鉴定酶的种类,Km值是酶的特征常数，在反应条件一定时，只与酶的种类和底物的性质有关，与酶的浓度无关。不同种类的酶其Km值不同，对于一种未知的酶，可在规定的条件下测定其Km值加以鉴定。,Company Logo,表7-1 某些酶的Km值,酶
12、 底物 Km(mmol/L),乳酸脱氢酶 丙酮酸 0.017己糖激酶 D-葡萄糖 0.05 D-果糖 1.5-半乳糖苷酶 D-乳糖 4.0碳酸酐酶 H2CO3 9.0过氧化氢酶 H2O2 25蔗糖酶 蔗糖 28糜蛋白酶 甘氨酰酪氨酰甘氨酸 108,Company Logo,2.反映酶与底物的亲合力,Km值越大，酶与底物亲合力越小，Km值越小，酶与底物亲合力越大。,3.选择酶的最适底物,Km值取决于酶的种类和底物的性质，在酶一定时，不同底物有不同的Km值。酶活力测定时，应优先选择酶的最适底物，使酶促反应容易进行，并节省底物用量。,Company Logo,4.计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于
13、最大反应速度的比率,根据米-曼氏方程可以计算,5.设计适宜的底物浓度,酶促反应进程曲线表明，只有初速度才能真正代表酶活性，一般要求初速度达到最大速度的90%95%、底物消耗率为1%5%。这样既可以近似地表示酶活性，又不致于使底物浓度过高而造成浪费。,Company Logo,(三)Vmax的应用,定义：Vmax指酶完全被底物分子饱和时的反应速度。,应用：Vmax可用来计算酶的转化率（TN），即单位时间内每分子酶可使底物发生化学反应的分子数，单位为分子数/秒。当反应速度达到最大反应速度时，如果已知酶量，则可计算出酶的转化率：,TN=底物转化量（mol/s）/酶量（mol）,Company Log
14、o,(四)Km和Vmax的测定,1Linweaver-Burk作图法,又称为双倒数作图法,1 Km+S Km 1 1=+v VmaxS Vmax S Vmax,Company Logo,2Cornish-Bowden作图法,又称为直线线性作图法。,Company Logo,酶活性测定方法及酶学分析的类型,酶活性的测定方法工具酶酶偶联测定法底物浓度测定,Company Logo,一、酶活性的测定方法,按照对酶促反应时间的选择不同,连续监测法,固定时间法,Company Logo,（一）固定时间法,分类：,终点法：在反应进行到预定时间后要终止反应。两点法：该方法反应时间的预定是从t1t2。,定义：
15、测定酶促反应开始后一段时间内底物的减少量或产物的增加量。,Company Logo,特点：优点是简单。缺点是难以确定反应时间段酶促反应是否处于线性期。,注意：固定时间法时间段的预定不宜太长，一般以3060分钟为宜。,Company Logo,（二）连续监测法,原理：,定义：测定底物或产物随时间的变化量，又称为速率法。,该方法每隔一定时间（10s60s）测定一次底物或产物的变化量，连续测定多点，然后将测定结果对时间作图，绘制反应速度曲线。,Company Logo,特点：在方法设计上，选择紫外吸收法或色原显色法,缺点：要求高，要求能够精确地控制温度、pH值和底物浓度等反应条件，要求仪器具有恒温装
16、置及自动监测功能，半自动及自动生化分析仪都能达到这些要求。,优点:能动态观测酶促反应进程，可以明显地找到反应的线性期，结果准确可靠，标本和试剂用量少，可在较短时间内完成测定。,Company Logo,表7-2 常用工具酶的名称及其缩写符号,名 称 缩写符号 名 称 缩写符号,乳酸脱氢酶 LDH苹果酸脱氢酶 MDH6-磷酸葡萄糖脱氢酶 G6PD谷氨酸脱氢酶 GLDH葡萄糖氧化酶 GOD胆固醇氧化酶 COD磷酸甘油氧化酶 GPO过氧化物酶 POD,己糖激酶 HK肌酸激酶 CK丙酮酸激酶 PK甘油激酶 GK脂蛋白脂肪酶 LPL胆固醇酯酶 CE脲酶肌酐酶,Company Logo,三、酶偶联测定法,
17、应用：对于底物或产物不能直接测定或难于准确测定的酶促反应。,Ex Ea EiA B C P,式中A为底物，B、C为中间产物，P为产物（必须能够直接测定），Ex为待测酶，Ea、Ei都为工具酶。按照工具酶作用的不同,Ea又称为辅助酶，Ei又称为指示酶，C P称为指示反应。,Company Logo,（一）酶偶联反应的原理,在应用酶偶联法测定时，关键在于确定恒态期，因为只有恒态期才能代表酶活性。如酶促反应底物动力学所述，恒态期可以通过测定指示酶的Km和Vmax等动力学因数加以计算确定。,Company Logo,（二）常用指示酶及其指示反应,1脱氢酶,用作工具酶的脱氢酶都是以NAD(P)H为辅酶的脱
18、氢酶，例如LDH、MDH、G6PD、GLDH等，它们催化下列反应：,P+NAD(P)H+H+PH2+NAD(P)+,可对NAD(P)H在紫外吸收或紫外激发荧光进行测定,应用：ALT、AST、CK等酶活性测定。,Company Logo,2过氧化物酶,POD可催化过氧化氢与某些色原反应，例如与4-氨基安替比林（4-AAP）和酚反应，将其氧化为有色物质，反应如下：,POD 2H2O2+4-AAP+酚 醌亚胺（红色）+4H2O,Trinder反应：,应用：GOD、COD、GPO、甘油氧化酶、尿酸酶（属于氧化酶类）等都可以将各自的底物氧化为过氧化氢，因此都可以与POD偶联，通过Trinder反应加以测
19、定。,Company Logo,四、底物浓度测定,利用酶催化反应的高效率和专一性，可以测定底物浓度。与酶活性测定类似。,Company Logo,同工酶测定,同工酶的定义同工酶产生的机理同工酶的测定方法,Company Logo,同工酶的定义,是催化功能相同，但是分子组成及理化性质不同的一组酶，是在同一种属中由不同基因位点或等位基因编码的多肽链单体、纯聚体或杂多体。,Company Logo,一、同工酶产生的机理,（一）由不同基因位点编码（二）由等位基因编码（三）由多肽链化学修饰产生,Company Logo,二、同工酶的测定方法,（一）按照理化性质不同进行分离鉴定,1电泳法 同工酶氨基酸组成
20、不同，等电点不同，电泳迁移率也就不同，据此可用电泳法分离鉴定。,2层析法,根据同工酶分子荷电量不同，可用离子交换层析法加以分离。,Company Logo,（二）按照底物专一性不同进行鉴定,同工酶底物专一性不同，Km值也不同。如果同工酶之间的Km值差别足够大，可以通过测定其Km值加以鉴定。,（三）按照最适pH不同进行鉴定,同工酶分子氨基酸组成不同，最适pH也不同。如果同工酶最适pH之间的差别足够大，可以通过调节缓冲溶液的pH值加以鉴定。,Company Logo,（四）按照免疫学特性不同进行分离鉴定,（五）按照耐热程度不同进行鉴定,（六）选择性抑制法,Company Logo,酶学分析在临床诊
21、断上的应用,血浆酶的来源酶的区域化分布酶活性测定在临床诊断中的应用同工酶的诊断价值,Company Logo,一、血浆酶的来源,血浆酶,血浆特异酶,非血浆特异酶,外分泌酶,细胞内酶,Company Logo,二、酶的区域化分布,表7-3 诊断常用血清酶的来源,血清酶 符号 来源,鸟氨酸氨基甲酰转移酶 OCT 肝卵磷脂胆固醇酰基转移酶 LCAT 肝 谷氨酸脱氢酶 GLDH 肝山梨醇脱氢酶 SDH 肝丙氨酸氨基转移酶 ALT 肝、肾、心异柠檬酸脱氢酶 ICD 肝、胎盘、心-谷氨酰转肽酶-GT 肝、胆、肾、小肠5-核苷酸酶 5-NT 肝、胆道单胺氧化酶 MAO 肝、肾、脑 天门冬氨酸氨基转移酶 AS
22、T 心、肝、骨骼肌肌酸激酶 CK 骨骼肌、心、脑乳酸脱氢酶 LDH 心、肾、骨骼肌、肝、肺碱性磷酸酶 ALP 小肠、胎盘、肝、肾酸性磷酸酶 ACP 前列腺、红细胞、血小板淀粉酶 AMS 胰、唾液腺脂肪酶 LPS 胰,Company Logo,三、酶活性测定在临床诊断中的应用,（一）在肝脏疾病诊断中的应用（二）在急性心肌梗死诊断中的应用（三）在急性胰腺炎诊断中的应用（四）在骨骼疾病诊断中的应用（五）在肌肉疾病诊断中的应用（六）在前列腺疾病诊断中的应用（七）在肿瘤诊断中的应用,四、同工酶的诊断价值,Company Logo,酶活性测定最适条件的选择,（一）标本,（二）测定条件,底物浓度、酶浓度、温
23、度、酸碱度、辅助因子、激活剂和抑制剂,Company Logo,血清酶测定,（一）氨基转移酶测定,1赖氏法测定ALT,（）原理：,（）方法评价：赖氏法的实验结果需与卡门分光法的结果对比后求出；NaOH的浓度对显色有影响；该法的重复性差。,Company Logo,【参考范围】525卡门氏单位,【临床意义】,(2)慢性活动性肝炎或脂肪肝：,(1)肝细胞损伤的灵敏指标:,ALT轻度增高(100200IU),或属正常范围,Company Logo,2.连续监测法测定ALT,（）原理：采用酶偶联反应,即L-丙氨酸和-酮戊二酸在ALT作用下，生成丙酮酸和L-谷氨酸。丙酮酸再在LD作用下生成L-乳酸，同时
24、NADH被氧化为NAD+,可在340nm处连续监测到NADH的消耗量,从而计算出ALT活性浓度。双试剂法:首先使血清与缺少-酮戊二酸的底物溶液混合，37保温5分钟，将标本中所含的-酮酸(如丙酮酸)消耗完，然后，加入-酮戊二酸启动ALT催化的反应，在波长340nm处连续监测吸光度下降速率。根据线性反应期吸光度下降速率(-A/min)，来计算ALT的活性。,Company Logo,（）方法评价：存在着两个副反应，会使测定结果偏高；A、血清中存在的-酮酸(如丙酮酸)能消耗NADH。B、血清中谷氨酸脱氢酶(GLDH)增高时，在有氨存在条件下，亦能消耗NADH。双试剂法，因温育期长，能有效地消除干扰反
25、应，测定准确性高，是ALT测定的首选方法；血清不宜反复冰冻保存，以免影响酶活性；避免使用溶血标本。,Company Logo,3.赖氏法测定AST,（）原理：血清中的AST可催化门冬氨酸(aspartate)与-酮戊二酸间的氨基移换，生成草酸乙酸(oxaloacetate)和L-谷氨酸。草酸乙酸自行脱羧转变成为丙酮酸。反应60分钟后，加入2，4-二硝基苯肼终止反应，并与酮酸生反应生成两种2，4-二硝基苯腙。在碱性条件下,两种苯腙的吸收光谱曲线有差别，在505nm处差异最大，由草酸乙酸转变成的丙酮酸所生成的苯腙呈色强度显著大于-酮戊二酸苯腙。据此可用比色法测定AST活性。,（）方法评价：赖氏法的
26、实验结果需与卡门分光法的结果对比后求出；该法的重复性差：负干扰现象,Company Logo,【参考范围】828卡门氏单位,【临床意义】,肌炎、胸膜炎、肾炎及肺炎：血清AST也可轻度增高。,心肌梗死：血清中AST活性增高,各种肝病病人：血清AST的升高,Company Logo,4连续监测法测定AST,（）原理：采用酶偶联反应,即L-门冬氨酸和-酮戊二酸在AST作用下，生成草酰乙酸和L-谷氨酸。草酰乙酸在苹果酸脱氢酶作用下生成L-苹果酸，同时伴有NADH转化为NAD+，在340nm监测NADH的转化速率，从而计算出AST的活性。,双试剂法:同测定。,Company Logo,（）方法评价,误差
27、可来自内源性和(或)外源性内源性干扰主要来自血清中高浓度丙酮酸和L-谷氨酸脱氢酶(GLDH)。外源性干扰来自试剂中污染的GLDH和AST。,【参考范围】540 IU/L(连续监测法测定),【临床意义】见赖氏法,Company Logo,(二)ALP测定,化学法,连续监测法：,鲍氏法,金氏法,皮氏法,Company Logo,、金氏法测定ALP,（）原理：ALP在碱性环境中作用于磷酸苯二钠，使之水解释放出酚和磷酸。酚在碱性溶液中与4氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化形成红色醌类化合物，根据红色深浅确定ALP的活力。,(2)方法评价：,磷酸苯二钠比色法与更早的-甘油磷酸钠法相比具有较大的优点，如水解
28、速度快，保温时间较短、灵敏度较高、显色稳定、不需去蛋白、操作简单、快速。但与磷酸对硝基酚连续监测法相比，准确度、精密度较低；操作比较繁琐,，灵敏度低。,Company Logo,【参考范围】成人：313 单位，儿童：528单位,ALP金氏单位定义是100ml血清，37与底物保温15分钟，产生1mg酚为1个金氏单位。,ALP主要用于诊断肝胆和骨骼疾病,【临床意义】,Company Logo,2.连续监测法测定ALP,（1）原理：,以磷酸对硝基酚(p-nitrophenyl phosphate,4-NPP)为底物，2-氨基-2-甲基-1,3-丙醇（2-amino-2-methyl-1-propan
29、ol,AMP）或二乙醇胺为磷酸基的受体。在碱性环境下，ALP催化4-NPP水解产生游离的对硝基酚，对硝基酚(p-nitrophenol，4-NP)在碱性溶液中转变成黄色。根据405nm处吸光度增高速率来计算ALP活性单位。,（2）方法评价：,线性范围可达500U/L，批内CV为2.06%2.36%，批间CV为2.74%。,Company Logo,【参考范围】男性：112岁 15岁 40 150U/L，25岁 40150U/L。,【临床意义】见金氏法,Company Logo,(三)GGT测定法 化学法（重氮反应比色法）和连续监测法。,1.重氮反应比色法测定GGT,原理：,【参考范围】男性 3
30、 17 U/L；女性 2 13 U/L,2.连续监测法测定GGT,(1)原理：,(2)方法评价：,(2)方法评价：,重氮比色法活性单位：100ml血清在37下反应1hr,生成0.5mol的-苯胺为1个GGT活性单位。,男性：1150 U/L；(以-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺为底物)女性：732 U/L 男性：40U/L；女性：30U/L(以-谷氨酰-4-硝基苯胺为底物),【参考范围】,Company Logo,(四)MAO测定,原理:,MAO主要作用于CH2-NH2基团，在氧参与下，氧化脱氨生成相应的卞醛、氨及过氧化氢。以苄氨偶氮-萘酚为底物,在O2和H20参与下，MAO催化生成苄醛偶氮-
31、萘酚、氨及过氧化氢，用环己烷抽提后进行比色测定。,(2)方法评价：,【单位定义】：,1ml血清与底物在37孵育60分钟，催化单胺氧化产生1nmol苄醛偶氮-萘酚为1 个MAO单位。,【参考范围】1240 U/ml(1210340103 U/L)。,【临床意义】：肝硬化时，肝纤维化现象十分活跃，MAO活性明显升高。,Company Logo,血清胆红素测定,重氮盐法,胆红素氧化酶(bilirubin oxidase,BOD)法,高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)、,导数分光光度法,直接分光光度计法,测定方法,Company L
32、ogo,1重氮盐改良J-G(Jendrassik and Grof method,J-G)法,(1)原理:,血清中结合胆红素与重氮盐反应生成偶氮胆红素；同样条件下，游离胆红素需要在加速剂作用下，使游离胆红素分子内的次级键断裂，极性上升并与重氮试剂反应。反应完成后加入终止试剂，继而加入碱性酒石酸钾钠使紫色偶氮试剂转变为蓝色，波长600nm下比色分析，求出血样中总胆红素的含量。,(2)方法评价：,推荐的常规方法，其方法的线性范围较宽，在342mol/L(200mg/L)浓度下有较好的准确性和精确性，高浓度时准确性和精确性降低。因此，建议浓度过高时减少血样用量测定。,Company Logo,【临床
33、意义】,【参考范围】,黄疸的鉴别诊断,总胆红素:5.119.0mol/L(0.31.1mg/dL)直接胆红素:1.716.8mol/L(0.10.4mg/dL),Company Logo,2胆红素BOD测定法,(1)原理:,BOD在不同pH条件下催化不同组份的胆红素氧化生成胆绿素，胆绿素与氧进行非酶促反应转变为淡紫色化合物，胆红素的最大吸收峰在450nm 附近。随着胆红素被氧化,450nm下降，下降程度与胆红素浓度成正比。；在pH8.0条件下,未结合胆红素及结合胆红素均被氧化，用于测定总胆红素,在pH=4.5的酸性条件下，BOD仅能催化结合胆红素和大部分胆红素，而游离胆红素不被氧化，测定其含量
34、代表结合胆红素。,(2)方法评价：,BOD法测定总胆红素的准确性、精密度比改良J-G法好,Company Logo,【参考范围】,血清总胆红素：10.264.10mol/L 血清结合胆红素：2.572.56 mol/L 胆红素mol/L=胆红素mg/L X 17.1,【临床意义】,见重氮比色法,Company Logo,四、血清胆汁酸测定,高效液相色谱法,放射免疫分析法,酶免疫分析法,比色分析测定法,测定方法,Company Logo,(1)酶比色法测定原理,3-HSD,胆汁酸+NAD+3-氧-5类固醇+NADH（1）,NADH+NBT 甲jie（蓝色化合物=540nm）（2）,3-氧-5类固
35、醇+NAD+3-氧-5类固醇+NADH（3）,黄递酶,4-DH,酶比色法,Company Logo,由于胆汁酸在血中含量低，方法检测的灵敏度达不到要求，通过增加3-氧-5-类固醇脱氢酶(4-DH)，胆汁酸经3-HSD催化的产物3-氧代胆酸在4-DH作用下再次脱氢，加大了NADH的生成量，提高了反应的检测能力（见反应式1、2、3）。但以上两种方法都存在一个缺点：生成的蓝色产物是一种染料，易于附着管壁，难于清洗或堵塞管道。,酶循环法测定原理为：,NAD+,Thio-NAD,Thio-NADH,胆汁酸,3-氧代胆汁酸,NADH,3-HSD,Company Logo,(2)酶比色测定法评价：,快速、简
36、便、准确、可靠和适用的优点。它即可以手工操作、也可以在自动化仪器上进行。但试剂价贵、不易保持。对酶量的要求严格，以保证酶促反应在零级反应下进行，酶量不足易产生误差。此外，标准品的制备非常重要。常采用甘氨胆酸溶入小牛血清中制成冻干品。,Company Logo,【参考范围】1 7 mol/L(成人空腹血清总胆汁酸),【临床意义】任何引起肝细胞损伤的病理过程都可能引起血中胆汁酸升高可见于各种类型的肝病、肝硬化、脂肪肝，也见于急慢性胆道阻塞。其中空腹胆汁酸测定是一种敏感、特异性强并相对简单的肝功能试验，是目前公认最敏感的肝功能试验之一。特别适用于可疑有肝病但其它生化试验正常或轻度异常的病人诊断。,C
37、ompany Logo,血氨测定,为一步法，也叫直接测定即不需从全血中分离出氨即可直接测定,两步法，即先从全血中分离出氨,而后再进行测定；,微量扩散法、离子交换法,酶法和氨电极法,Company Logo,原理：血浆中的氨在足量-酮戊二酸和NADPH存在时，经谷氨酸脱氢酶作用生成谷氨酸,并消耗NADPH，NADPH的下降速率与血浆氨浓度成正比。,NH3-酮戊二酸NADPH 谷氨酸NADP+H2O,谷氨酸脱氢酶速率法：,谷氨酸脱氢酶,(2)方法评价：,本法特异性强、分析时间短，是较为理想的氨分析方法。在200mol/L范围内、线性良好。精密度：批内CV=3.9%；批间CV=4.5%。回收率为97
38、.9%102.7%。,Company Logo,【参考范围】,血氨测定在诊断治疗肝性脑病中占有重要作用。,【临床意义】,1872mol/L(酶法),Company Logo,自动生化分析技术的应用,集自动化技术、光学、微电子技术和计算机科学为一体，自动加样、稀释、混匀、反应、比色、分析过程的监控、数据记录、计算、打印、传输等功能。一、类型二、自动生化分析仪分析方法和校准三、自动生化分析仪参数设置：波长、温度、分析方 法、标本量和试剂量、分析时间的设定、线判断范 围性。四、性能评价,Company Logo,一、类型,1、根据仪器结构原理不同：持续流动性（管道式）、分立式、离心式和干片式。2、根
39、据测试速度不同：小型生化分析仪、中型生化分析仪、大型生化分析仪及模块生化分析仪。3、根据自动化程度不同：半自动生化分析仪和全自动生化分析仪。,Company Logo,Company Logo,Aeroset,i8000,i2000,i4000,ci8200,i2000sr,C8000,Company Logo,二、分 析 部 分,样品盘,试剂 1,试剂 2,搅拌器,清洗装置,ISE(选配),样品针,Company Logo,光学系统16个固定波长压电搅拌效果可靠8步清洗确保了清洗 效果,ICTTM技术ISE模块检测Na+、K+、Cl-165个反应杯位试剂R1/65,R2/56,Company
40、 Logo,Company Logo,Company Logo,Company Logo,Company Logo,Company Logo,Company Logo,Company Logo,测光系统：采用无像差凹面全息光栅及高速数字转换的后分 光技术,可任选单波长或两波长测光。吸光度：-0.1 3.2 Abs 最小反应液 200 l，试剂消耗少。16个波长任意选用 340、380、404、412、444、476、500、524、548、572、604、628、660、700、748、804nm 全反应过程测光方式 显示屏上可实时显示和打印每个测定的反应曲线，并可储存反应曲线。,Compan
41、y Logo,数据处理：多种校准方式(校准物最多9个)线性、对数函线、指数函数、样条函数等 样品空白和试剂空白测定:既可进行同杯，也可进行不同杯样品空白的测定，对测定结果进行样品空白补偿，可明显提高测定结 果的准确性。,Company Logo,二、自动生化分析仪分析方法和校准,1、分析方法种类 终点法：一点终点、两点终点。速率法：两点速率法、速率A法。2、自动生化分析仪的校准方法：线性法(标准法或K因素法），适于物质浓度和 吸光度呈比例变化。浓度因素 x 吸光度 曲线拟合法（非线性法）：多点定标绘制非线 性标准曲线,Company Logo,三、自动生化分析仪参数设置,波长：范围宽达 340
42、-804 nm,16个波长任意选用340、380、404、412、444、476、500、524、548、572、604、628、660、700、748、804nm。温度：37 水浴恒温系统加热迅速,温控均匀受环境温度变化影响小水浴添加剂及流动活水循环防止细菌生长分析法:一点终点、两点终点、两点速率法、速率A法。,Company Logo,标本量和试剂量：23l(反应杯光径长 5mm,减少反应液体积);试剂量80150l。分析时间的设定：反应时间最长10 min,33 个吸光度读数点。线性判断范围,Company Logo,Company Logo,小结：,生物化学检验研究内容离心机使用注意事
43、项分光光度技术原理 思考题：如何利用Beer定律对物质进行定量分析？,Company Logo,思考题：,如何利用Beer定律对物质进行定量分析？答：根据比尔定律，特定波长的光通过溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度成正比。待测物经过一定的化学反应生成的产物，对特定波长的光具有吸收峰，通过测定已知浓度校准品,得出标准曲线，从而对物质进行定量检测。这是生化检验最常用的一种方法。,Company Logo,肝功能检测实践,Company Logo,丙氨酸氨基转移酶活性测定,Company Logo,简 述,转氨酶是催化-氨基酸和-酮酸之间氨基移换反应的一组。其中，丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天门冬氨酸
44、氨基转移酶（AST）最具有临床意义，是临床实验室中最常用的检测项目之一。转氨酶广泛存在于肝脏、心肌、骨骼肌、肾、脑、胰、脾、肺、白细胞和红细胞中。这些组织损伤或坏死时，酶从这些组织细胞中释出，致使血清中ALT或AST活性升高。,Company Logo,简 述,各种肝炎急性期，许多药物引起的肝脏及各种肝细胞坏死均可见ALT显著增高，因而，ALT检测是肝细胞损伤的灵敏指标。肝脏疾病及其它疾病引起的肝脏损伤均可引起ALT不同程度的增高。1998年IFCC批准37条件下的酶活性测定的推荐方法，是目前公认的国际参考方法，同时推荐应用酶校准品校准各实验室酶活性测定结果，提高了实验室间测定结果的可比性。,
45、Company Logo,原 理,L-丙氨酸+-酮戊二酸 ALT 丙酮酸+L-谷氨酸丙酮酸+NADH+H+LDH L-乳酸+NAD+H2O谷丙转氨酶催化丙氨酸的氨基转移，生成丙酮酸。该产物与NADH在LDH的催化下反应生成乳酸和NAD+。NADH在340nm处有特异吸收峰，其被氧化的速率与血清中的ALT活性成正比，在340nm处测定NADH下降速率，即可测出ALT活性。,Company Logo,试剂与仪器,1.试剂：液体双试剂，可直接使用。试剂主要成分：R1：Tris 缓冲液（PH=7.5）100mmol/L L-丙氨酸 500mmol/L LDH 1200U/L R2：-酮戊二酸 15mm
46、ol/L NADH 0.18mmol/L2.试剂的储藏和稳定性：试剂在2-8避光保存，可稳定至有效期；启用后在2-8稳定4 周；若试剂混浊或以水为空白在340nm处吸光度值小于1.0时，则不能使用。,Company Logo,操作步骤,全自动分析法：速率法实验参数（双试剂）：反应方式：RATE DOWN 主/副波长：340nm/404nm测定读点：21-26 样品量：10lR1试剂量：200l R1位置：D-4R2试剂量：50l R2位置：D-4定标方式：FACTOR 酶测定因数：4180单位：U/L R1:R2=4:1,Company Logo,操作步骤,半自动分析法（单试剂）：速率法实验参
47、数：反应方式：RATE DOWN 主/副波长：340nm/404nm样品量：20l工作试剂：400l（R1:R2=4:1）定标方式：FACTOR 酶测定因数：3376单位：U/L,Company Logo,计 算,ALT（U/L）=A/min=A/min4180（全自动）=A/min3376（半自动）式中：TV=总反应体积（l）SV=样品体积（l）=NADH在340nm处的毫摩尔消光系数6.22 P=比色杯光径（1cm）,TV1000 SV P,Company Logo,临床意义,ALT活性增高1.肝脏疾病：传染性肝炎、肝癌、中毒性肝炎、脂肪肝。2.胆道疾病：胆囊炎、胆道结石、胆管炎、癌性肝外
48、胆道梗阻等。3.心血管疾病：急性心肌梗死、心肌炎、心力衰竭合并肝淤血和脑出血等。4.药物和毒物影响：氯丙秦、异烟肼、奎宁、水杨酸制剂及乙醇铅、汞、有机磷等。,Company Logo,临床意义,其它：如低血糖、低胆固醇及前白蛋白降低是肝功能严重损害的指标。ALT活性降低 磷酸吡哆醛缺乏症。,Company Logo,临床意义,AST/ALT的比值对判断病情预后比单纯测定ALT更有意义。在病毒性肝炎中，比值1；比值1.2提示肝细胞严重损坏，预后差；恢复期比值逐渐上升。AST/ALT的比值已恢复正常后，能说明肝细胞破坏开始修复。,Company Logo,注意事项,1.血清中含有酮酸能消耗NADH
49、，使结果偏高；血清中谷氨酸脱氢酶增高时，在有氨的条件下，亦消耗NADH，使结果偏高。2.标本不能溶血，3.血清不宜反复冷冻保存，以免影响酶的活性。4.宜用血清标本测定。草酸盐、枸橼酸盐抗凝剂虽不抑制酶活性，但可引起血浆轻度浑浊，不宜使用。,Company Logo,标本采集与要求,标本采集：血清、肝素抗凝血浆。室温下放置30-45分钟后离心分离出血清（血浆）。标本处理：采集标本后应尽快送检。标本在室温可以保存2天，在2-8可保存7天,不推荐冰冻保存血清标本。标本不能溶血。,Company Logo,小 结,重症肝炎症状恶化并伴有黄疸加重时，ALT 反而下降，呈现胆红素与ALT分离即“胆酶 分离
50、”，表示肝细胞大量坏死，肝功能衰竭。标本应避免溶血，红细胞内的ALT的含量高于血清（浆）3-5倍，有溶血标本会造成结果增高。,Company Logo,要 求,掌握半自动生化分析仪检测ALT的仪器编程，利用半自动生化分析仪进行ALT项目的检测。掌握酶测定因素的计算及ALT检测结果的临床意义。了解检验结果影响因素、注意事项。,Company Logo,实验结果的分析与报告,Company Logo,因分析失败而需再检验样本的处理：对样本分析失败导致检验结果不能发出或分析结果与临床诊断明显不符合时，应及时对原始样品做重复检验。如果因重复检验失败导致检验结果还是不能发出或分析结果与临床诊断明显还是不
