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1、专题1,1.1 DNA重组技术的基本工具,基因工程,对基因工程的概念的理解,基因拼接技术或DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,获得人类需要的基因产物,剪切,拼接,导入,表达,基因重组,基因工程的理论依据,1.DNA是绝大多数生物的遗传物质，,部分病毒的遗传物质是RNA，其他生物的遗传物质是DNA,都由4种脱氧核苷酸聚合而组成,DNA具有双螺旋结构,不同生物的DNA基本单位和结构相同,脱氧核糖,磷酸,含氮碱基,脱氧核苷酸,碱基对,氢键,磷酸二酯键,基本骨架,DNA的基本结构,2.中心法则：,DNA,RNA,蛋白质（性状）,复制,转录,翻译,逆转录,复制,在绝大多数生物中，亲代DNA通
2、过复制而将遗传信息传递给子代；DNA通过控制蛋白质合成而控制个体性状表达,基因工程的理论依据,3.基因是遗传物质结构和功能的基本单位,基因是指有遗传效应的DNA片段,一个DNA分子上有多个基因,基因工程的理论依据,4.各种生物共用一套遗传密码,相同的DNA碱基序列,在不同生物细胞中翻译出相同的蛋白质，表达为相同的性状;,科技探索之路：,基础理论和技术发展催生了基因工程,早期基础理论,达尔文提出生物进化论,科技探索之路：,基础理论和技术发展催生了基因工程,早期基础理论,孟德尔提出基因的分离定律和自由组合定律,科技探索之路：,基础理论和技术发展催生了基因工程,早期基础理论,摩尔根证明基因在染色体上
3、，并提出基因的连锁互换定律。,科技探索之路：,基础理论和技术发展催生了基因工程,早期基础理论,艾弗里证明DNA是遗传物质，DNA可从一种生物个体转移到另一种生物个体。,科技探索之路：,基础理论和技术发展催生了基因工程,早期基础理论,沃森、克里克提出DNA的双螺旋结构模型。,科技探索之路：,基础理论和技术发展催生了基因工程,早期基础理论,梅塞尔松、斯塔尔证明DNA的半保留复制,科技探索之路：,基础理论和技术发展催生了基因工程,早期基础理论,克里克等提出中心法则,科技探索之路：,基础理论和技术发展催生了基因工程,早期基础理论,1963年尼伦伯格和马太破译编码氨基酸的遗传密码，1966年霍拉纳用实验
4、加以证明。,“分子手术刀”限制性核酸内切酶,一.主要来源：,原核生物中分离纯化出来的一类酶,1、限制酶主要存在原核生物，它有什么意义？,限制酶在原核生物中主要是切割外源DNA，使之失效，从而达到保护自己的目的。,二.功能：,识别特定的核苷酸序列，在特定的部位断裂磷酸二酯键。,（1）识别序列：,限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线（如图），中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向、对称、重复排列的。,（2）切割部位：磷酸二酯键,EcoR,黏性末端,黏性末端,三.作用结果,形成粘性末端或平末端,2、为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的DNA？,原核生物中不存在该酶的识别
5、序列或识别序列已经被修饰。,现在已经从约300种微生物中分离出与约4000种限制性内切酶(限制酶)。,EcoR,Sma,粘质沙雷氏杆菌（Serratia marcesens）,大肠杆菌（Escherichia coli R）,练习：流感嗜血杆菌的d菌株(Haemophilus influenzae d)中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:,Hind、Hind和Hind,生物A基因片段,生物B基因片段,EcoR,EcoR,DNA连接酶,（二）“分子缝合针”DNA连接酶,1.作用：,将双链DNA片段之间的磷酸二酯键连接起来,2.种类：,Ecoli DNA连接酶 T4 DNA连接酶,T4 DNA连
6、接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低,EcoliDNA连接酶,T4DNA连接酶,大肠杆菌,T4噬菌体,恢复磷酸二酯键,只能连接黏性末端,能连接黏性末端和平末端(效率较低),来源,功能,相同点,差别,比较：DNA连接酶与DNA聚合酶,1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键,形成磷酸二酯键,1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链,2)将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板,三、基因的载体“分子运输车”,1、具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接；,载体的作用：1、将外源基因转移
7、到受体细胞中去（携带重组DNA分子）。2、能够使外源基因复制和表达的工具。,载体必须具备的条件：,2、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；,3、对受体细胞无害,问题：霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？,问题：目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？,4、有某些标记基因，便于筛选；,5、结构简单，大小适中,能复制并带着插入的目的基因一起复制,是切割和插入位点,有标记基因,（1）质粒是细菌染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子，大小只有普通细菌拟核DNA的百分之一。,实际操作的质粒一般都是人工改造过的,能够在宿主细胞内 独立的复制而实现扩增,将自己插入到宿主细胞染色体中来进行复制,（2）噬菌体的基本特征,一类能够特异性侵染细菌的病毒，结构简单。,专题1,1.1 DNA重组技术的基本工具,基因工程,
