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1、几种水产动物血涂片的制作及形态比较观察,一、实验目的,了解血涂片的制作方法，同时认识鲫鱼和美国牛蛙的血细胞。,二、实验内容,鲫鱼和美国牛蛙血涂片的制作,三、实验材料,1.鲫鱼，美国牛蛙2.Giemsa染料粉剂、瑞氏染料粉剂、甘油、甲醇3.磷酸二氢钾（无水）、磷酸氢二钠（无水）4.载玻片、盖玻片、注射器、玻璃棒、pH试纸、烧杯、容量瓶,Giemsa氏染料原液配制,Giemsa染料粉剂 0.75g甘油 50ml甲醇 50ml 将粉剂放于甘油内搅匀，放入60度温箱24h，经常摇匀。取出待冷再加甲醇混匀，配成原液，密封棕色瓶保存。使用时，以原液5ml加M/15磷酸盐缓冲液（pH6.4-6.8）50ml
2、稀释成工作液。,磷酸缓冲液的配置,分别称取磷酸二氢钾（无水）6.64g，磷酸氢二钠（无水）2.56g，加少量水溶解，加水至1000ml。用精密pH试纸确定其pH。,载玻片的准备,新载玻片常带有游离碱质，须用浓度为 lmol/L 的HCl浸泡24h，再用清水彻底冲洗，干燥后备用。旧载玻片要用含洗涤剂的清水中煮沸20min，洗掉血膜，再用清水反复冲洗，最后用0.95mol/L乙醇浸泡1h，干燥备用。使用载玻片时，不要用手触及玻片表面，保持玻片清洁、干燥、中性、无油腻。,四、实验步骤,1.血涂片的制作2.染色3.观察,血涂片制作方法,取血液标本一滴置载玻片的一端，以边缘平滑的推片一端，从血滴前沿方向
3、接触血液，使血液沿推片散开，推片与载玻片保持 3045 度夹角，平稳地向前推动，血液即在载玻片上形成薄层血膜,涂片的厚薄与血滴大小、推片与载玻片之间的角度、推片时的速度及血细胞比容有关。血滴大、角度大、速度快则血膜越厚；反之则血膜越薄。一张良好的血涂片，要求厚薄适宜，头体尾明显，细胞分布均匀，血膜边缘整齐并留有的空隙。,血涂片的染色,血涂片染色包括两个过程：固定和染色。固定是将细胞蛋白质和多糖等成分迅速交联凝固，以保持细胞原有形态结构不发生变化。常用的染色方法有瑞士染色法(Wright)、姬姆萨染色法(Giemsa)等。,瑞氏染液,0.1g瑞氏染料粉剂放入洁净干燥的研钵中，滴加60ml甲醇至全
4、溶，密封于棕色小口瓶内，放置半个月-1个月。,步 骤,血涂片经甲醇固定2min滴加工作液染色15-30min，室温。蒸馏水漂洗缓冲液分色，至血膜显示淡红色。标本干燥后，封片活不封片观察,结果,红细胞被染成橘红色，白细胞核紫色，嗜酸性颗粒鲜红色，嗜碱性颗粒蓝紫色，中性颗粒紫或紫红色，淋巴及单核细胞胞浆蓝灰色。,压片法分别取鲫鱼和美国牛蛙的肝脏、肾脏、脾脏组织，然后压片在载玻片上，晾干，然后染色。,染色注意事项,1载玻片必须非常洁净，中性，无油脂。不清洁或非中性的载玻片会造成细胞特别是红细胞形态发生改变，导致假性的异常形态红细胞出现。非中性的载玻片还会影响染色环境的pH值，带油脂的载玻片会使细胞分
5、布不均匀。,2.染色过深、过浅的处理。染色过深、过浅与血涂片中细胞数量、血膜厚度、染色时间、染液浓度、pH值密切相关。对于重要的标本可采用先试染的方法，根据试染效果调节第二次染色方式。纠正染色过深可缩短染色时间或稀释染液。纠正染色过浅可延长染色时间。如果标本片有限出现了染色过深、过浅的情况，可用如下办法挽救：染色过深可加少量缓冲液覆盖血膜部分褪色，在显微镜下观察褪色情况及时终止。染色过浅可重加染色液和缓冲液复染，也要在显微镜下观察及时终止。,血液的组成,血液,血浆 血C,红C白C血小板,水（90%）其它,圆形细胞,人血涂片(Giemsa染色)(红色箭头示白细胞，兰色箭头示红细胞),白C(leu
6、kocytes,white blood cell,WBC),WBC,有粒C无粒C,中性粒C嗜酸性粒C嗜碱性粒C,淋巴C单核C,分类依据：根据C质内有无特殊颗粒和颗粒的嗜色性。,中性粒C,数量：50-70%，是数量最多的白C。结构：分叶状（2-5个核）。核左移：1-2叶核增多-细菌感染。核右移：4-5叶核增多-衰老。,中性粒CNeutrophilic granulocyte,(2)嗜酸性粒C(Eosinophils),数量：0.5-3%.C核：“八”字形核.C质：粗大嗜酸性颗粒-溶酶体.EM：颗粒中有长方形晶体.,嗜酸性粒C(LM)Eosinophilic granulocyte,(3)嗜碱性粒
7、C,数量：最少，0-1%.C核：不规则,多呈“S”形.C质：蓝紫色颗粒,大小不等,分布不均.,嗜碱性粒CLMBasophilic granulocyte,(4)淋巴C(Lymphocytes),数量：25-30%.C核：大，圆形,常有浅凹,染色质浓密呈粗块状.C质：少,嗜碱性.,淋巴C（LM）Lymphocyte,(5)单核C(Monocytes),数量：3-8%.大小：血液中最大的C.C核：肾形,马蹄形,着色较浅.C质：丰富,弱嗜碱性,灰兰色.,单核C Monocyte,血小板Blood platelet,结 果,红细胞橘红色，白细胞核紫色，嗜酸性粒细胞鲜红色，嗜碱性粒细胞蓝紫色，中性颗粒紫
8、或紫红色，淋巴细胞及单核细胞细胞质蓝灰色，血小板紫色。,蛙血液涂片,细胞的显微测量需要以目镜测微尺来进行，但其分度值随着放大倍数的变化而变化，长度也不一样，因此需要事先进行标定。而镜台测微尺的长度是已知的，目镜测微尺的标定是通过镜台测微尺来进行的。,细胞的显微测量,目镜测微尺(长度随放大倍数发生改变),镜台测微尺(每一大刻度值为0.1mm，小刻度值为0.01mm),目镜测微尺与镜台测微尺,目镜测微尺的标定,如在低倍镜下重合线之间目镜测微尺的长度为50格 镜台测微尺的长度为68格则：50:68=1:x x=1.36格，即目镜测微尺的1小格相当于镜台测微尺的1.36格，而镜台测微尺每1小格的长度为10um，则目镜测微尺每1小格的长度为13.6um。,标定时应注意的问题,如何进行蛙细胞的显微测量？,细胞膜,细胞质,细胞核,蛙红细胞示意图,五、实验作业,一张好的血涂片的要求是什么?绘制鲫鱼和牛蛙的血细胞。,
