食品微生物检测.doc

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1、食品有害微生物与检测导 言 随着科学技术日新月异的发展和人们生活水平的不断提高，食品安全、卫生已成为人们关注的焦点。 WHO及各国食品卫生、安全管理部门一直对食品微生物污染问题给予极大的重视和关注。 食品微生物检验是食品质量安全控制方面的重要技术之一，对控制微生物引起的食源性疾病具有重要作用，已成为食品安全中的重要研究领域。 近年来,食品微生物检测技术得到了很大的发展，正从传统的培养和生理生化的方法向快速的免疫学检测方法、分子生物学检测方法、快速的基于培养及生理生化特征的检测方法、自动化仪器检测方法、生物传感器检测方法方面发展。 食品微生物检验技术现已被食品质量与安全、食品科学与工程等相关专业

2、列为主干课程 第一节 病原微生物与食品安全一、病原微生物污染现状 上世纪末和本世纪初接二连三发生的重大食源性疾病令全球震惊 如，日本大肠埃希菌O157:H7引起的出血性肠炎、英国的疯牛病和美、法、日等国的李斯特菌食物中毒等，对消费者健康和安全带来严重威胁，引起了人们对食源性病原体的高度关注。p 国际上发生的食品安全重大事件 1989年新疆，戊肝 1996年欧洲，牛肉，疯牛病 1996年日本，蔬菜，O157 1997年香港，禽流感 1999年比利时，畜禽类，二噁英 2000年法国，熟制肉类，李斯特菌 2000年日本，乳品，金黄色葡萄球菌 2000年英国、法国， 口蹄疫 2004年南亚、东南亚、中

3、国，禽流感 p 疯牛病p 毒黄瓜 2011年5月中旬，食用毒黄瓜引起的疫病在德国开始出现。2011年5月30日，德国因食用有毒黄瓜，感染出血性大肠杆菌而死亡的人数已升至14人，目前疫情仍在蔓延恒天然毒奶粉系乌龙 新西兰奶粉产业受影响p 食源性疾病（food borne disease） 是指通过摄食而进入人体的有毒有害物质（包括生物性病原体）等致病因子所造成的疾病。 一般可分为感染性和中毒性，包括常见的食物中毒、肠道传染病、人畜共患传染病、寄生虫病以及化学性有毒有害物质所引起的疾病。 食源性疾患的发病率居各类疾病总发病率的前列，是世界上最突出的卫生问题。 食源性疾病（foodbornedise

4、ase），是一种涵盖范围非常广泛的疾病，在全世界范围内都是一个日益严重的公共卫生问题。 从粮食生产到消费（“从农场到餐桌”），任何一个阶段都可能发生食品污染，也有可能是环境污染的结果，包括水、土壤或空气污染。微生物引起的食源性疾病是影响食品安全的主要因素 美国，每年约有7200万人发生食源性疾病，造成3500 亿美元的损失 80年代，上海，毛蚶，甲型肝炎爆发，累及30万人 1999年，宁夏，沙门氏菌污染肉品，食物中毒暴发， 发病人数上千人 2001年，江苏、安徽等地，肠出血性大肠杆菌O157:H7，造成177人死亡，中毒人数超过2万人u 监测数据显示，2011年，中国每6.5人中就有一人曾经发

5、生过食源性疾病 。食品安全的头号杀手食源性疾病 漏报率高达99%,食源性疾病的危害已经远超违法滥用添加剂、农药残留等食品化学性污染二、现代食品微生物检测技术在食品安全中的重要作用 食品安全是一个遍及全球的公共卫生问题。 与其他任何一类疾病相比，由病原微生物引起的食源性疾病是危害最大的一类。p 食品微生物检验的意义u 衡量食品安全质量的重要指标，也是判断被检食品能否食用的科学依据；u 判断食品加工环境及食品卫生情况，对食品被细菌污染的程度作出正确的评价，为各类卫生管理工作提供科学的依据，提供传染病和人类、动物的食物中毒的防治措施；u 是预防为主的措施，有效地防止或者减少食物中毒和人畜共患病的发生

6、；u 提高产品质量，避免经济损失。 传统的食品微生物检测技术主要靠微生物培养和生理生化实验，耗时长、效率低、敏感性差，不能及时检出食品中的有害微生物。 快速、准确、高效的现代食品微生物检测技术应运而生！第二节 现代食品微生物检测的研究内容一、免疫学快速检测技术 1. 荧光抗体检测技术（FAT) 2. 免疫酶技术 二、分子生物学快速检测技术 1. 核酸探针技术 2. 多聚酶链式反应技术（PCR) 3. 生物芯片技术三、基于培养基生理生化特征的检测技术 1. 电阻抗法 2. 微量生化法 3. 快速酶触反应及代谢产物的检测四、自动化检测 1. ATB Expression细菌鉴定及药敏智能系统 2.

7、 Bactometer系统 3. 微生物总数快速测定仪五、生物传感器检测技术第三节 现代食品微生物检测技术的发展趋势及应用一、现代食品微生物检测技术的发展趋势 1. 更加注重快速、准确、实用 2. 与生物技术成果相结合 3. 大力发展在线无损的检测技术 二、现代食品微生物检测技术的应用 1. 免疫学方法 2. 核酸探针法 3. PCR技术 4. 基因芯片技术 5. 生物传感器 第一章 免疫学检测技术的基本原理免疫学检测技术的基础是抗原抗体反应。免疫学技术的发展 免疫学检验(1aboratoryimmunology)是研究免疫学技术及其在医学检验领域应用的一门学科，是医学检验专业的重要学科之一。

8、第一节 抗原（antigen, Ag）一、抗原的概念p 凡能刺激机体免疫系统产生特异性免疫应答，并能与相应免疫应答产物（抗体或致敏淋巴细胞）在体内外发生特异性结合的物质，统称为抗原（antigen, Ag）p 多系异体的大分子蛋白质。二、抗原的基本特性1. 免疫原性（immunogenecity） 是指抗原分子能够刺激机体产生免疫应答（产生特异性抗体及免疫效应细胞）的性质。2. 抗原性 （antigenicity） 又称免疫反应性，是指抗原分子与免疫应答产物（抗体或免疫效应细胞）发生特异性结合的性质。第二节 抗体(antibody,Ab)（一） 抗体的概念 又称免疫球蛋白（immunoglob

9、ulin，Ig)是由B细胞识别抗原后增殖分化为浆细胞所产生的一类糖蛋白，主要存在于血清等体液中，能与相应抗原特异性地结合，具有免疫功能，是介导体液免疫的重要免疫分子 分泌型(secreted Ig, SIg) 免疫球蛋白 膜型(membraneIg, mIg) 前者存在血液和组织中，具有抗体各种免疫功能，由浆细胞产生。 后者是B细胞表面的抗原受体，是由成熟B细胞产生免疫球蛋白。（二）抗体的基本结构 p 四条肽链的对称结构。p 两条重链（H）和两条轻链（L）p 每条重链和轻链分为氨基端和羧基端。第二节 体外免疫反应的特点及影响因素一、抗原抗体反应的特点1. 高度特异性 (specificity)

10、 一种抗原分子通常只能与其刺激机体后产生的抗体结合，这种反应的专一性； 抗原表位与抗体分子高变区之间空间构型的互补性所决定的； 可用已知的抗原(或抗体)来检测相应未知的抗体(或抗原)。2. 可逆性(reversibility) 由于抗原抗体的结合是分子表面的非共价键结合，形成的复合物是不牢固的； 在一定的条件下可以解离，抗原抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一动态平衡过程。3.比例性(proportionality) 抗原与抗体发生可见反应需要遵循一定的量比关系 决定抗原抗体结合后能否出现肉眼可见反应 沉淀反应中沉淀量与抗原抗体的比例关系4.阶段性（2阶段） 第1阶段：特异性结合阶段。反应快，

11、可在数秒钟至数分钟内完成，一般不能为肉眼所见； 第2阶段：可见阶段，根据参加反应的抗原的物理性状不同，可出现凝集、沉淀和细胞溶解等现象。反应可见阶段所需时间较长，数分钟、数小时到数日不等。二、抗原抗体反应的影响因素（一）反应物自身因素 抗原和抗体是反应主体，它们的性质、活性及浓度(效价)等直接影响二者的结合反应。 抗原的理化性状、抗原表位种类和数目均可影响抗原抗体反应的结果 不同动物来源的抗体反应性有差异。（二）环境因素适宜的环境条件，如电解质、酸碱度、温度等能促进抗原抗体分子的紧密接触，增强分子间引力，促进分子聚合。1、电解质 抗原抗体等电点分别为pI3-5和pI5-6，在中性或弱碱性条件下

12、表面带有较多负电荷； 适当浓度的电解质会使它们失去一部分负电荷而相互结合。2、温度 通常为37，适当提高反应温度可增加抗原与抗体分子的碰撞机会； 56以上可使抗原或抗体变性失活。3、酸碱度 最适pH值在6-8之间，pH值过高或过低均可直接影响抗原抗体的理化性质； 当pH值接近等电点时，抗原抗体多带正负电荷相等，由于自身吸引而出现凝集，导致非特异性反应。第三节 检测抗原和抗体的体外实验一、抗原抗体结合力二、抗原抗体的亲和力与亲合力亲和力(affinity)：指抗体分子上一个抗原结合点与相应的抗原决定簇之间相适应而结合的强度，它是抗原抗体间固有的结合力。亲合力(avidity)：指一个抗体分子与整

13、个抗原表位之间结合的强度，与抗体结合价直接相关。三、免疫学检测技术的类型（一）早期建立的免疫学检测技术p 直接用抗原抗体反应产生的现象判断实验结果p 包括：凝集现象、沉淀现象p 补体系统参与的溶血现象等1.凝集反应p 细菌、细胞等颗粒性Ag或表面包被抗原的颗粒状物质与相应Ab在电解质存在的情况下结合，出现肉眼可见的凝集团现象。直接凝集反应间接凝集反应 将可溶性Ag/Ab先吸附在某些颗粒载体上，形成致敏颗粒，然后再与相应Ab/Ag进行反应产生凝集，叫间接凝集反应。 如将溶血毒素O吸附于乳胶颗粒上的抗“O”试验、人IgG作为Ag吸附于乳胶颗粒上的类风湿因子检测。 凝集反应常用于溶血性疾病的诊断：2

14、.沉淀反应可溶性抗原与相应抗体结合后出现沉淀物。免疫比浊法单向免疫扩散双向免疫扩散免疫电泳（二）现代免疫标记技术 (immunolabelling technique)p 用高度敏感的示踪物质(如荧光物质、放射性核素、酶或化学发光物质等)标记抗原或抗体，进行抗原抗体反应后，通过检测标记物对抗原或抗体进行定性、定位或定量分析。p 特点：灵敏度高、快速、可定性、定量、定位等优点，拓宽了免疫学检测技术的应用范围，是目前应用最广泛的免疫学检测技术免疫标记技术常用方法p 按检测现象不同： 放射免疫技术 荧光免疫技术 酶免疫技术 化学发光免疫技术 金免疫技术等p 按实际用途： 定位测定组织或细胞中固定成分

15、的免疫组织化学技术 检测液体标本中抗原或抗体含量的免疫测定。p 按测定反应体系的物理状态： 均相免疫测定 非均相免疫测定； 单向琼脂扩散试验 双向琼脂扩散试验第二章 放射免疫分析测定技术检测食品微生物 1986年切尔诺贝利核灾难Yalow和Berson利用放射性核素标记胰岛素，建立了放射免疫分析技术。 雅洛1921年出生于纽约，1945年获得核物理学博士学位，1975年当选美国科学院院士。 因发明了放射性免疫分析法，雅洛获得1976年的拉斯克基础医学奖，成为历史上第一位获得该奖的女性科学家。 1976年，因与同事合作开发了“针对多肽类激素的放射性免疫分析法”而成为诺贝尔生理学或医学奖史上第二位

16、女性获奖者。 第一节 放射免疫技术放射免疫技术 放射免疫技术(radioimmunoassay, RIA)是以放射性核素为示踪物的标记免疫分析技术 常用于定量测定受检样本中的微量物质，在内分泌学、免疫学、药物学、微生物学、生物化学等多个领域得到广泛应用 广义来说，凡是应用放射性同位素标记的抗原或抗体，通过免疫反应测定的技术，都可称为放射免疫技术一、放射免疫技术-分类放射免疫RIAp 以标记抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合特异性抗体来测定待检样品中抗原量。 免疫放射IRMAp 以过量标记抗体与抗原非竞争结合，采用固相免疫吸附载体分离游离和结合标记抗体。其它 放射受体分析RRA 放射配体结合分析

17、RBA二、放射免疫技术 常用标记核素三、放射免疫技术标记物制备及鉴定 125碘-标记物的制备标记直接标记法 是将125I直接结合在蛋白质侧链的酪氨酸残疾苯环上，形成单碘酪氨酸或双碘酪氨酸。 操作简便，结合效率高，但只能标记含酪氨酸的化合物，有时可能会损害蛋白质的活性【基本原理】p 反应原理不清楚，仅仅是建立在实验基础上，有的学者认为当氯胺T溶于水后释放出次氯酸，将*I-离子氧化成*I2、*I+，在pH为7.0-8.0条件下与蛋白质酪氨酸残基上邻位氢原子发生置换反应，形成放射性碘标记化合物，用偏重亚硫酸钠终止氧化反应，经过分离纯化，获得纯的标记化合物。间接标记法p 联接标记法 先将放射性碘连接到

18、一个小分子载体上，再将这个小分子载体与蛋白质结合。p 具有代表性的方法： bolton-Hunter 法，使用的载体分子是N-琥珀酰亚胺3-（4-羟基苯）-丙酸（SHPP)。p 分两步进行，第一步是用Ch-T法使SHPP碘化，第二步再将碘化SHPP分子偶联到蛋白质分子上，从而使待标记物被碘化。 125碘-标记物的制备纯化 凝胶过滤法 离子交换层析法 聚丙烯酰胺凝胶电泳 高效液相色谱法 125碘-标记物的制备鉴定标记物质量 高放射化学纯度 高比放射性 完整免疫活性 （1）放射化学纯度p 指结合于抗原上的放射强度占总放射强度的百分率，即碘化蛋白峰的放射强度占总放射强度的百分率。p 影响因素： 被标

19、记物不纯，杂质也被放射性核素标记 标记后的分离纯化不完全 标记化合物贮存过程中的碘脱离单位标记物中结合于被标记物上的放射性占总放射性的百分率应大于95% （2）比放射性 或称放射性比活度，是单位化学量标记物中所含的放射性强度，单位为Bq/g。 标记抗原的比放射性越高，所需标记抗原量越少，实验系统的敏感度越高 但过高的比放射性可能会损坏抗原的免疫活性。如碘标记化合物以单碘标记为宜。 （3）免疫活性 是指标记抗原结合于抗体的放射强度占总放射强度的百分率。以检查标记后免疫活性损失情况 方法：加10倍量抗体和标记抗原反应，测定结合部分（B）和游离部分（F）的放射强度，算出B/（B+F）的百分率，正常应

20、为80以上，该值越大，说明抗原损失越小。 如果值过小，标记抗原应重新强化或废弃重做。四、放射免疫技术抗体选用 抗体是放射免疫技术试剂盒主要组成试剂之一，常采用含特异性抗体的抗血清和小鼠杂交瘤单克隆抗体。 抗体的质量直接影响分析的灵敏度和特异性 抗体的质量指标主要有亲和常数、特异性和效价。第二节 放射免疫分析放射免疫分析（RIA) 是以放射性核素标记抗原和待测抗原竞争结合一定量的特异性抗体，来测定待测抗原含量的一种竞争免疫学方法。即经典的RIA法。 是目前应用最广泛的放射免疫技术。一、放射免疫分析-基本原理标记抗原（Ag*）和非标记抗原（Ag）对特异性抗体（Ab）的竞争结合反应。 标记抗原和抗体

21、的量是固定的。 抗体的量一般用能结合4050的标记抗原，受检标本中的非标记抗原是变化的。 根据标本中抗原量的不同，得到不同的反应结果。 标记抗原和非标记抗原对特异性抗体具有相同的结合力，相互竞争结合特异性抗体 标记抗原与特异性抗体的量是固定的，故标记抗原抗体复合物形成的量就随着非标记抗原的量而改变 抗原抗体复合物放射性强度与受检标本中抗原浓度呈反比 结合态标记抗原（B）与游离态标记抗原（F）的比值（B/F），或算出其结合率B/(BF)，与标本中的抗原量呈函数关系 用一系列不同剂量的标准抗原进行反应，计算相应的B/F，可以绘制出一条剂量反应曲线。 受检标本在同样条件下进行测定，计算B/F值，即可

22、在剂量反应曲线上查出标本中抗原的含量。 剂量反应曲线二、放射免疫分析实验方法及测定1. 抗原抗体反应根据加样顺序不同，RIA可分为2个类型： 平衡法：将Ag和 Ag同时与Ab反应，达到平衡后分离 Ag-Ab和 Ag，方法稳定，但敏感度稍差。 顺序饱和法：先将待测Ag与Ab充分反应，达到平衡后再加入 Ag，敏感度提高，稳定性不如平衡法。2. 分离结合、游离标记物 在放射免疫技术的反应系统中，因抗原和抗体含量极微，所形成的免疫复合物不发生沉淀。 必须采用适当方法将反应平衡时 Ag-Ab复合物（B）和游离 Ag（F）分开，才能分别测量其放射性。p 理想分离技术符合条件: 简便易行，适用于大批量样品分

23、析 分离效果完全、快速、非特异性结合低 试剂来源容易、价格低廉、稳定性好、可长期保存 不受外界因素和样品中其他组分的干扰，对保准品和待测抗原分离效果相同 适合自动化分析的要求 目前尚无安全满足上述条件的分离方法3.测量、数据处理 参数cpmB/T (%)F/T (%)B/F (%)B/B0 (%) 晶体闪烁计数器包括了NaI闪烁晶体、光电倍增管以及计数器 测量的放射性信号是仪器输出的电脉冲数：每分钟计数(cpm) 液闪仪 计数器三、放射免疫分析方法评价p RIA优点： 敏感度高，能测到g/L，甚至可测到ng/L或pg/L水平； 特异性强，与结构类似物质间的交叉反应少； 准确性好，重复性好，批间

24、批内误差低p RIA缺点 有放射性核素对环境和实验室污染 放射性核素易衰变以及放射性标记物不稳定，导致试剂有效期短第三节 免疫放射分析免疫放射分析（IRMA) 免疫放射分析（IRMA）是从放射免疫分析（RIA）的基础上发展起来的核素标记免疫测定 又称免疫放射度量分析，是以放射性核素标记的抗体与待测抗原发生非竞争性结合反应，来测定待测抗原含量的一种非竞争性免疫学方法 IRMA的灵敏度明显高于RIA一、免疫放射分析基本原理p 将放射性同位素标记在抗体上，用过量的标记抗体（Ab）与待测抗原反应，待充分反应后，除去游离的标记抗体，Ag-Ab结合物的放射性强度与待测抗原量呈正比关系。p IRMA属固相免

25、疫标记测定，其原理与ELISA极为相 似，不同点主要为标记物为核素及最后检测为放射性量。单位点 IRMAp 抗原与过量的标记抗体在液相反应后加入免疫吸附剂，即结合在纤维素粉或其他颗粒载体上的抗原。p 游离的标记抗体与免疫吸附剂结合被离心除去，然后测定上清液的放射性量。 单位点IRMA原理示意图双位点 IRMA先用固相抗体与抗原结合，再用过量的标记抗体与抗原的另一决定簇结合，形成固相抗体-抗原-标记抗体复合物，洗弃剩余标记抗体，测固相上放射性强度。 二、免疫放射分析技术要求1. 抗原抗体反应 向易包被抗体的反应管（包被试管或包被珠）中加入待测抗原和标记抗体，进行抗原抗体结合反应，在一定的温度下温

26、育，使反应达到平衡。2. B/F分离 采用固相分离法，洗涤或吸弃上清液，除去未结合的游离标记抗体3. 放射性强度测定 除去游离标记抗体后，测定反应管中放射性强度4. 数据处理 反应管中放射性强度即代表与抗原结合的标记抗体量 IRMA复合物放射性强度与待测抗原量呈正比，用抗原标准品绘制标准曲线，可得待测抗原量三、免疫放射分析方法评价p 优点 敏感性高 特异性强 标记物稳定，容易标记 结果稳定p 缺点 抗体用量偏多，而且抗体的特异性纯化较难，如用单克隆抗体可克服这些缺点四、IRMA与RIA比较放射免疫分析技术的应用p 灵敏度高、特异性强、精密度好, 常用于各种激素、微量蛋白质、肿瘤标志物、药物和病

27、原微生物等微量物质的测定p 由于放射污染和危害，常用核素半衰期短，试剂盒稳定期不长等诸多不足, RIA将逐渐被取代的趋势。思考题1.放射免疫技术的核心是什么？2.制备放射性125I标记物的基本原理是什么？有哪些方法？3.评价125I标记物质量的指标有哪些？4.用于放射免疫技术的抗体应满足哪些质量标准？5.反应结束后，如何将免疫复合物与游离标记物分离开？6.放射免疫分析实验中，如何确定待测抗原的含量？7.免疫放射分析与放射免疫分析的反应原理有何不同？8.灵敏度、特异性和测定范围，免疫放射分析与放射免疫分析有何区别？小 结p 放射免疫技术的基本原理是放射性核素可探测的灵敏性、精确性与抗原抗体反应的

28、特异性相结合，主要包括RIA和IRMA。p RIA所用的标记物应具备高比活度、高纯度和完整的免疫活性；抗血清应具有较高的抗体亲和力、高度的特异性和适宜的工作滴度；标准品浓度需按标准进行标定；结合与游离反应物的分离（二抗法、PEG法、PR试剂法和固相法）应彻底、迅速、不影响反应平衡、非特异性低和操作简便。p 拟合标准曲线需根据不同检测项目和不同的要求选用恰当的反应参数。第三章 酶联免疫技术检测食品微生物概 述p 50年代的免疫荧光（FIA）p 60年代的放射免疫（RIA）和免疫放射（IRMA)分析技术p 70年代初期建立了用酶标记抗原或抗体的分析技术 1971年瑞典学者Engvail和Perlm

29、ann，荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法。p 酶高效生物催化作用，一个酶分子在极短时间内可催化几十、几百个底物分子发生反应，产生了放大作用，使原来极其微量的抗原或抗体在数分钟后就可被识别出来，这种技术称为酶联免疫吸附试验法 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA) p 现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断；也可应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定。第一节 酶免疫技术原理 原理与特点原理： 酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应

30、酶对底物的显色反应 对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析 特点： 灵敏度高、特异性强、准确性好 酶标记试剂能够较长时间保持稳定 操作简便、对环境没有污染 易与其它技术偶联衍生出适用范围更广的新方法。 定性或定量的测定分析 第二节酶免疫技术分类一、均相酶免疫测定用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定 原理p 酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变，不用分离结合和游离酶标记物，通过测定标记酶活性改变，而确定抗原或抗体的含量。最具代表性的两种技术酶放大免疫测定技术EMITenzyme-mutiplied immunoassay technique克隆酶供体免疫分析 CEDIA

31、cloned enzyme donor immunoassay 二、非均相酶免疫测定与均相不同之处: 需分离游离与结合的酶标记物 分类：液相酶免疫测定 固相酶免疫测定p 以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA） ，目前最常用的固相酶免疫测定第三节酶联免疫吸附试验-固相酶免疫测定ELISA 酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)一、基本原理1.包被2.反应: 加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体3.洗涤: 使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离4.底物显色: 定性或定量的分析二、试剂的准备（一）固相载体要求 结合

32、抗体或抗原容量大 抗体或抗原牢固地固定在其表面 不影响免疫反应性 利于反应充分进行 固相方法简便易行，快速经济种类 塑料制品 微颗粒 膜载体 聚苯乙烯 特点：吸附蛋白质能力强，保留其免疫活性 形状：小试管、小珠、微量ELISA板 使用前检测性能（二）抗原与抗体 高纯度的Ag 高纯度的Ab（三）酶和底物的选择n 标记酶要求： 活性高 性质稳定 专一性强 酶催化底物的显色信号易于判断和测量 方法敏感，重复性好，简单易行 酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉 3. 酶标记抗体或抗原的方法 酶免疫技术的核心组成部分 酶结合物（conjugate）酶标记物 通过化学反应或免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成的

33、结合物 （1）制备方法要求 抗原要求纯度高，抗原性完整 抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。 （2）制备方法 戊二醛交联法 过碘酸钠法（直接法）常用于HRP标记抗体或抗原 戊二醛交联法p 戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与酶和蛋白质分子中的氨基结合。p 该法有一步法和二步法。p 二步法标记效率（1015）比一步法高（67），酶标记物质量较均一。 4. 酶标记物纯化 标记完成后应除去反应液中游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物，避免游离酶增加非特异显色，以及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异性染色强度 常用的纯化方法： 葡聚糖凝胶G-200/

34、G-150过柱层析纯化 50%饱和硫酸铵沉淀提纯 亲和层析效果更好（SPA-IgG等）5. 酶标记物鉴定n 质量鉴定（ELISA法直接测定） HRP标记IgG的酶标记率（戊二醛法） 酶结合量（mg/ml） IgG量（mg/ml） HRP/ IgG摩尔比 酶的标记率三、方法类型与反应原理三个必要试剂 : 固相的抗原或抗体 酶标记物（酶结合物） 酶反应的底物 1. ELISA检测抗原方法a. 双抗体夹心法 方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色 应用： 二价或二价以上的较大分子抗原测定 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等b. 竞争法方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶

35、标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）2. ELISA检测抗体方法a. 间接法 方法： 用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。 优点： 一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体 应用： 常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定b.双抗原夹心法 原理：类似双抗体夹心法 操作步骤：类似 应用：乙型肝炎表面抗体c.竞争法 原理：类似检测抗原的竞争法 应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测 四、测定方法的标准化1.包被 理想coating

36、： 吸附尽可能多的Ag或Ab； 吸附牢固； 非特异性吸附较少 包被机制： 物理性吸附（被动的） 共价交联（戊二醛法）p 影响包被的因素 包被物质的性质及其浓度 聚苯乙烯吸附抗原效果好 聚乙烯吸附抗体效果好 浓度过高引起前带现象 浓度过低引起非特异性吸附（BSA封闭） 包被缓冲溶液的pH及离子强度 相对低的离子强度有利于蛋白质分子吸附固相表面 包被温度和时间 置4冰箱过夜，或37孵育2h2. 加样 加样量的准确 加样的位置 不产生气泡3. 洗涤 目的 洗去未结合的物质 洗去非特异性吸附 要求 每孔充满液体 去净洗涤剂（Tween20） 冲洗次数和浸泡时间足够 具有传染性样品必须采用全自动冲洗4.

37、 孵育 定义：要使抗原抗体反应和酶催化反应顺利进行，需要合适的pH和适当离子强度的基质液，保持一定的温度，并作用一定时间，整个过程称为孵育或温育。 方法：干式和湿式 推荐温度：37 增强作用：聚乙二醇 反应时间：以阳性标本吸光度达1.0时为反应终点5. 结果判定 吸光度法（A) 比例法（A/A0) 滴度法（倍比稀释样品） 吸光度直接表示阳性的程度（均一化） 标准曲线法第四节酶免疫组织化学技术酶免疫组织化学技术 定义在一定条件下，应用酶标记抗体或抗原与细胞或普通组织切片中抗原或抗体反应，酶与底物作用形成有色沉淀物或产物电子密度发生改变，在光镜和电镜下，就可识别出标本中抗原或抗体的分布和性质；经图

38、像分析也可达到定量的目的。 种类 标记抗体免疫组织化学技术 非标记抗体酶免疫组织化学技术 酶标记免疫电镜技术标记抗体免疫组织化学技术第五节其他酶免疫技术 斑点酶联免疫吸附测定法(Dot-ELISA) 以纤维素膜代替免疫酶固相载体法中常用的聚苯乙烯微量反应板而建立的一种免疫检验方法。 不仅保留了常规ELISA的优点，而且还弥补了抗原或抗体对载体包被不牢等不足 具有敏感性高，特异性强，被检样品用量少，节省材料，不需特殊仪器，结果判定简单易行和便于长期保存等特点。 n 免疫印迹法（immunoblotting test）n BAS-ELISA 生物素（biotin）-亲和素（avidin） 亲和素与

39、生物素之间的亲和力极强，比抗原与抗体的亲和力至少高1万倍，且具有高度特异性和稳定性。第六节 酶免疫测定应用ELISA在预防医学、临床医学的应用 病原体及其抗体的检测（乙肝两对半） 蛋白质的检测 非肽类激素的检测 药物的检测 尿中毒品的检测ELISA在食品检测中的应用 食品中微生物的检测 食品毒素的检测（黄曲霉毒素） 食品中残留农药的检测（除草剂、杀菌剂和杀虫剂） 食品中残留抗生素的检测（氯霉素、磺胺类）ELISA在转基因食品检测中的应用（PCR-ELISA方法） DNA检测 蛋白质检测小 结 酶免疫技术是标记免疫技术的一种，以酶标记抗原或抗体作主要试剂的免疫检测方法，在抗原与抗体的特异性反应完

40、成后，通过酶对底物的作用进一步提高敏感性。 酶免疫技术可分为酶免疫组织化学技术和酶免疫测定两大类,后者根据抗原抗体反应后是否需要分离结合与游离的酶标记物而分为均相和非均相两种类型。 均相酶免疫测定主要用于小分子激素和半抗原的测定，非均相酶免疫测定根据是否使用固相支持物，又可分为液相和固相酶免疫测定两种类型。 最常用是以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA），其原理可以有夹心法、竞争法、间接法和捕获法等。思考题1酶免疫技术的要点？2酶联免疫吸附试验的原理（ELISA）？3竞争法在酶联免疫检测应用中的原理和应用？4常用的底物有哪几类？特点？5常用的酶有哪几类？特点？6常用固相载体的种类和特点？7举例固相酶免疫测定应用的原理及影响因素。8对酶免疫技术的应用评价如何？第四章 免疫金技术在食品微生物检测中的应用引言 n 胶体金免疫技术是以胶体金作为标记物的免疫标记技术，于20世纪70年代首创。n 胶体金免疫技术最初应用于免疫组化染色，随后发展到以膜为载体的免疫测定技术，由于简单、快速、灵敏等特点，得到