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1、基本内容,一、放射免疫检测技术的基本原理二、放射免疫分析（RIA）三、免疫放射分析（IRMA）四、RIA与IRMA的比较五、放射免疫分析中造成测量误差的因素六、核废物的处理七、应用八、课堂小结九、作业,一、放射免疫检测技术的基本原理,1、7个基本概念2、常用的放射性核素3、放射性核素的选择原则4、放射性标记的抗原或抗体的要求5、制备放射性核素标记物6、放射性标记物的纯化7、理想的分离技术8、免疫复合物分离常用方法9、核射线探测仪器的探测原理,1、7个基本概念放射性核素：是指原子核能自发地产生成分或能级的变化，在变化时伴有射线的发射（放射性），然后变成另一种元素的核素。,一、放射免疫检测技术的基
2、本原理,放射量单位有:放射性活度 放射性比活度 放射性浓度,1、7个基本概念放射性活度：一定量的放射性核素在单位时间内的核衰变数，即每秒核衰变次数。单位：贝可勒尔(Becquerel，Bq)1Ci=3.71010Bq,一、放射免疫检测技术的基本原理,1、7个基本概念放射性比活度：是指固体样品的放射性活度，即单位质量样品中所含放射性活度，以Bq/g或Bq/mmol表示。放射性浓度：是指液体样品的放射性活度，即单位体积溶液中所含放射性活度，以Bq/ml表示。,一、放射免疫检测技术的基本原理,1、7个基本概念比活度：是单位质量标记物的放射强度，单位为Bq/g。标记抗原的比放射性越高，所需标记抗原量越
3、少，实验系统的敏感度越高。但过高的比放射性可能会损伤抗原的免疫活性。如碘标记化合物以单碘标记为宜。,一、放射免疫检测技术的基本原理,1、7个基本概念放射化学纯度：是指结合于抗原上的放射强度占总放射强度的百分率。影响因素:被标记物不纯，杂质也被放射性核素标记；标记后的分离纯化不完全；标记化合物贮存过程中的碘脱落。,一、放射免疫检测技术的基本原理,1、7个基本概念免疫活性：指标记抗原结合于抗体的放射强度占总放射强度的百分率。以检查标记后免疫活性损失情况。,一、放射免疫检测技术的基本原理,2、常用的放射性核素：放射性核素依据衰变方式分、三种，用于放射性标记的有和两类;分别用液体闪烁计数器及计数器测定
4、。型：3H（最常用）、14C和32P。型：125I（最常用）、131I、51Cr和60Co。,一、放射免疫检测技术的基本原理,125I和3H标记物特点比较,3、放射性核素选择原则 高比活度、适宜半衰期、对抗原或抗体没损害、容易标记。4、放射性标记的抗原或抗体的要求 纯度高、灵敏、有足够或完整的免疫活性、高亲和常数、特异性强、交叉反应率低。,一、放射免疫检测技术的基本原理,5、制备放射性核素标记物直接标记法 将125I直接结合在蛋白质侧链的酪氨酸残基苯环上，形成单碘酪氨酸或双碘酪氨酸。操作简便，结合效率高，但只能标记含酪氨酸的化合物，有时可能会损害蛋白质的活性。间接标记法 先将放射性碘连接到一个
5、小分子载体上，再将这个小分子载体与蛋白质结合。,一、放射免疫检测技术的基本原理,6、放射性标记物的纯化 可用葡聚糖凝胶过滤法或薄层层析法、纸层析法、电泳法、高效液相层析法等。理想的放射性标记物：高放射化学纯度 适当的比放射性 高的免疫活性。,一、放射免疫检测技术的基本原理,7、理想的分离技术简便易行，适于大批量样品分析;分离效果完全、快速，非特异结合低;试剂来源容易、价格低廉、稳定性好、可长期保存;不受外界因素和样品中其他组分的干扰，对标准品和待测抗原分离效果相同;适合自动化分析的要求。,一、放射免疫检测技术的基本原理,8、免疫复合物分离常用方法.吸附法 用吸附剂(如活性炭)吸附小分子的游离。
6、.化学沉淀法 RIA反应条件接近抗体的等电点，加入聚乙二醇(PEG)等蛋白质沉淀剂可破坏蛋白分子表面的水化层而使蛋白沉淀，从而分离B与F。.双抗体法 利用抗抗体和Ag-Ab复合物中的抗体结合，形成更大免疫复合物，离心沉淀即可分离B与F。.PR试剂 将双抗体法和PEG结合起来的沉淀法，可弥补各自的不足，分离效果好，适用范围广。.固相分离法 将抗体或抗原结合在固相载体（如磁颗粒、聚苯烯管子或珠等）上，利用固相抗体或抗原分离B和F，具有简便、快速、适合于自动化分析等特点，已逐步取代传统的液相分离方法。,一、放射免疫检测技术的基本原理,9、核射线探测仪器的探测原理 核射线探测器是个能量转化器，其检测原
7、理是当射线作用于闪烁体，闪烁体吸收了射线的能量而引起闪烁体中的原子或分子激发，当受激的原子或分子退激时，则发出光子进入光电倍增管光阴极，转换为光电子，光电子在光电倍增管电场作用下到达阳极，形成电脉冲。转换模式：放射能光能电能脉冲。,一、放射免疫检测技术的基本原理,二、放射免疫分析（RIA）,1、基本原理 抗原抗体竞争性结合反应，即待测抗原(Ag)和定量的标记抗原(Ag)与限量的抗体(Ab)进行特异性反应，其中Ab的结合位点数小于AgAg的结合位点总数，则Ag和Ag与Ab发生竞争性结合。如待测Ag含量多，则Ag-Ab复合物形成得多，Ag-Ab复合物(B)形成少，游离的Ag（F）多，反之亦然。,二
8、、放射免疫分析（RIA）,2、分类 根据加样顺序不同，RIA可分为2个类型：平衡法 将Ag和Ag同时与Ab反应，达到平衡后分离Ag-Ab和Ag，方法稳定，但敏感度稍差；顺序饱和法 先将待测Ag与Ab充分反应，达平衡后再加入Ag，敏感度提高，稳定性不如平衡法。,二、放射免疫分析（RIA）,3、数据处理根据放射性核素的类型分别选用液体闪烁计数仪（型）和计数仪（型），测定各待测标本和备抗原标准品的Ag-Ab放射性强度(B)或游离Ag放射性强度(F)。制作标准曲线时，纵坐标为放射性反应参数，有各种表示方式，可选用B/F、B/（BF）、F/B、B/B0（零标准管）等比值或B或F的cpm（脉冲）值，常选用
9、B/B0比值作为参数。横坐标为已知测定物标准品的浓度，以算术数或对数表示。放射免疫分析的标准曲线为双曲线。根据待测抗原管的放射性强度计算相应反应参数值，再从标准曲线图上查得待测抗原相应含量。,二、放射免疫分析（RIA）,RIA标准曲线的类型,（1）以测定物标准品浓度为横坐标，B%或B/F、B/B0、计数（cpm）为纵坐标，呈双曲函数；（2）以测定物标准品浓度的对数为横坐标，B%或B/F、B/B0、cpm为 纵坐标，曲线呈反S型；(3）以标准品浓度的算术数（或对数）为横坐标，F/B（或B0/B）为纵坐标，呈双曲函数；（4）以标准品浓度的对数为横坐标，logitB/B0为纵坐标，标准曲线为从左到右
10、的渐降直线。,4、方法学评价优点敏感度高，能测到g/L，甚至可测到ng/L或pg/水平；特异性强，与结构类似物质间的交叉反应少；准确性好，重复性好，批间批内误差低；用血量少。缺点有放射性核素对环境和实验室污染；放射性核素易衰变以及放射性标记物不稳定，导致试剂有效期短。,二、放射免疫分析（RIA）,三、免疫放射分析（IRMA）,1、原理 属于非竞争性免疫结合反应。是将放射性同位素标记在抗体上，用过量的标记抗体(Ab)与待测抗原反应，反应式为Ag+Ab=Ag-Ab+Ab。待充分反应后，除去游离的标记抗体，Ag-Ab结合物的放射性强度与待测抗原量呈正比关系，即待测抗原含量越多，则复合物的计数率就越高
11、，反之则越低。,2、技术路线 抗体包被反应管待测抗原过量的标记抗体抗原抗体反应（温育）平衡分离Ag-Ab+Ab放射性强度测定绘制标准曲线计算待测抗原量,三、免疫放射分析（IRMA）,3、方法学评价优点 敏感性高特异性高 标记物稳定，标记容易。结果稳定缺点 IRMA抗体用量偏多抗体的特异性纯化较难（如用单克隆抗体可克服这些缺点）。,三、免疫放射分析（IRMA）,四、RIA与IRMA的比较,放射免疫分析（RIA）是放射免疫技术最经典的模式。它是以放射性核素标记抗原与反应系统中未标记抗原竞争性结合特异性抗体为基本原理来测定待检样品中抗原量的一种分析方法。,免疫放射分析（IRMA）是用放射性核素标记的
12、过量抗体与待检测抗原直接结合，采用固相免疫吸附载体分离结合与游离标记抗体的非竞争性放射免疫分析。,二者的异同点如下：标记物 RIA 以放射性核素标记抗原；IRMA 则是标记抗体。反应速率 IRMA 反应速度比RIA 快。反应原理 RIA 为竞争抑制性结合，反应参数与待检抗原量成反相关；IRMA为非竞争结合，反应参数与待检抗原成正相关。特异性 IRMA 特异性较RIA高。灵敏度和检测范围 IRMA测定的灵敏度明显高于RIA，IRMA标准曲线工作范围较RIA宽12个数量级。其他 RIA 所用抗体为多克隆抗体，对亲和力和特异性要求较高，但用量很少；IRMA 为试剂过量的反应，对抗体亲和力的要求不及
13、RIA，但用量大。此外，RIA 可以测量半抗原，但IRMA只能测定至少有两个以上表位的抗原。,四、RIA与IRMA的比较,五、放射免疫分析中造成测量误差的因素,误差包括系统误差和随机误差。系统误差发生在测量过程中由于仪器不准、试剂不纯、标准品不稳定等原因，使测定结果呈倾向性偏大或偏小，这种误差应力求避免。随机误差是测量过程中各种偶然因素造成的，没有固定的倾向性，这类误差是不可避免的，必要时做统计学处理。造成误差的可能来源有以下几个方面：1各种仪器：设备的准确性、稳定性、效率以及被污染等情况带来的误差。如：由于放射性测量仪器的稳定性、效率、样品试管的材料和均匀性及被测物的放射性强度等原因。由于样
14、品的自吸收，本底校正，测定时间，可能的污染等原因。在试验室中所有的移液管、微量取样器以及天平的刻度、校准和使用方法等原因。由于反应试管、移液管以及测定用试管等表面清洁度和所引起的不同吸附等原因都可以对测定结果带来误差。2试剂的纯度、质量和稳定性的影响也是造成误差的重要因素。如标记抗原的比度、纯度，辐射自分解，抗体的稳定性，分离剂、阻断剂及缓冲液等试剂的纯度等。,3在放射免疫分析中一些基本操作，如取样、提取、沉淀、分离以及保温条件不适当等造成的误差。由于工作人员熟练程度不同也常常带来误差，如操作移液管垂直程度、下流速度、吹气与不吹气等。工作人员草率、不按规程操作等也都可以造成误差。4样品误差。样
15、品的收集方法、贮存温度、放置条件，微量样品取样的准确度，样品可能造成的污染以及样品的变性（如免疫反应活性的降低、蛋白质的变性等）也都能造成测量的误差。5提取及层析分离过程中的丢失。,五、放射免疫分析中造成测量误差的因素,六、核废物的处理,放射性废物中的放射性物质，采用一般的物理、化学及生物学的方法都不能将其消灭或破坏，只有通过放射性核素的自身衰变才能使放射性衰减到一定的水平。而许多放射性元素的半衰期十分长，并且衰变的产物又是新的放射性元素，所以放射性废物与其它废物相比在处理和处置上有许多不同之处。,1、放射性废水的处理 放射性废水的处理方法主要有稀释排放法、放置衰变法、混凝沉降法、离子变换法、
16、蒸发法、沥青固化法、水泥固化法、塑料固化法以及玻璃固化法等。2、放射性废气的处理(1)铀矿开采过程中所产生废气、粉尘，一般可通过改善操作条件和通风系统得到解决。(2)实验室废气，通常是进行预过滤，然后通过高效过滤后再排出。(3)燃料后处理过程的废气，大部分是放射性碘和一些惰性气体。3、放射性固体废物的处理和处置 放射性固体废物主要是被放射性物质污染而不能再用的各种物体(1)焚烧(2)压缩(3)去污(4)包装,六、核废物的处理,七、在医学检验中应用,1.激素的测定 RIA可用于大多数激素的测定，对相关疾病的诊断和治疗提供重要的实验依据。如：蛋白质及肽类激素 胰岛素、胰泌素、胃泌素、生长激素、AC
17、TH、TSH、HCG等；非肽类激素 T3、T4、孕酮、雌二醇、雌三醇、醛固酮、地塞米松、前列腺素等。,2、药理学方面 在药理学和临床药学方面，RIA可用于药物的吸收、分布和代谢研究，检测违禁药物、药物中毒等。常涉及药物有地高辛、吗啡、巴比妥类、核酸衍生物(cAMP、cGMP等)和一些常用的抗生素。3、其它 用于检测乙肝系列抗原和抗体、Ig亚型分析等；检测肿瘤特性等。,七、在医学检验中应用,八、课堂小结九、作业 答案：放射免疫技术由于其测定的灵敏度高，特异性强，精密度好，而且可对半抗原和抗原测定以及测定仪器设备条件要求不高，因此广泛用于生物医学检验。常用于各种激素、微量半抗原、肿瘤标志物、药物等微量物质的测定。由于大多数检验项目均有 RIA 或 IRMA 试剂盒供应，目前仍是基层单位对超微量物质测定的主要手段。但由于放射污染和危害，常用核素半衰期短，试剂盒稳定期不长，以及具有不能 快速、灵活的自动化分析等诸多不足，特别是近年来其他非放射标记免疫测定技术及自动化分析的飞速发展和普及，RIA将逐渐会被这些优秀的标记免疫分析方法所取代。,放射免疫分析技术有何应用？其前景如何？,
