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1、MTT法测定硫酸长春新碱对Hela细胞增殖的抑制效果摘要：目的 探索VCR对Hela细胞增殖抑制效果的最适浓度，并探究其作用机理。方法 用不同浓度的VCR作用于处于生长对数期的Hela细胞，MTT法测定细胞存活状况，比较抑制效果。结果 浓度设置抑制效果差异性不明显，由于操作不规范性等因素引起的浓度与抑制率不呈一定的相关性规律。结论 在设置的浓度范围内，诱导浓度为0.4 ug/ml对Hela 细胞增殖的抑制效果最佳。关键词: 硫酸长春新碱；子宫癌细胞；MTT法；抑制率1 前言调查资料表明，2002 年全球癌症患者达1090万，其中死亡670万，在过去五年中诊断出2460万肿瘤患者( Parkin
2、等， 2005) ，世界卫生组织估计，若严格统计可能更严重 1 。宫颈癌是一种严重的危害妇女健康的疾病，在全球妇女恶性肿瘤的发生率中，宫颈癌仅次于乳腺癌而位居第二。其治疗以手术切除为主,辅以放疗、化疗和其它治疗方法。在综合治疗中,化疗以其能缩小原发病灶,防止术后复发和扩散有重要的作用。长春新碱(Vincristine，VCR)是二聚吲哚类生物碱。自它于1962 年问世以来，一直是重要的一线抗癌药物2-3。VCR 通过作用于肿瘤细胞微管蛋白而干扰肿瘤细胞代谢，本研究选用不同浓度的VCR作用于体外培养的Hela细胞, 测定宫颈癌Hela细胞对同一药物的不同浓度敏感性。2 材料与方法21材料与仪器H
3、ela细胞 酶联免疫检测仪 22 实验步骤1. 接种：收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，使细胞浓度为23104/ml，每孔加入细胞悬液200l，使每孔内的细胞数为4000- 6000个。2. 培养与药物处理：培养箱内培养2436h，吸出培养液加入不同浓度梯度的VCR 200 l，每个浓度接种4孔作为重复实验，并设置空白对照。3. 呈色：培养箱内继续培养到第3天，于倒置显微镜下观察细胞生长情况后每孔加5 mg/ml的MTT溶液20 l，继续孵育4 h，终止培养；快速翻转培养板，弃去孔内培养上清液；然后每孔加DMSO 150l，振荡30min，使结晶物充分融解。4. 比色：选择490nm波长，在酶
4、联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。23数据处理细胞增殖抑制率（未加药物处理的对照组吸光值药物处理组的吸光值）/未加药物处理的对照组吸光值。T检验4测定不同浓度VCR对Hela细胞的抑制率的差异度。3 结果与分析表1 硫酸长春新碱不同诱导浓度处理Hela 后细胞增值抑制率a)诱导浓度（ug/ml） 细胞增殖抑制率(%)诱导浓度（ug/ml） 细胞增殖抑制率(%)0.260.811.047.582.041.984.043.001.571.064.569.967.566.3010.565.20a)表中所列为同一批次 Hela 细胞同时处理的结果由表可知：诱导浓度由0.24.0 ug/ml，细
5、胞增值抑制率由60.81降低至43.00，差异不明显（P0.05）；诱导浓度由1.510.5 ug/ml，细胞抑制率由71.06降低至65.20，差异不明显（P0.05），不具统计学意义。由此可见，VCR的最适浓度设置应将浓度梯度设置更大，并且倾向浓度低方向进行。有实验证明VCR的诱导浓度为0.4 ug/ml时，抑制率为82.25。介于1.0至2.0 ug/ml之间的抑制率在另一组1.5 ug/ml却为71.06，与1.0ug/ml、2.0 ug/ml，差异显著。由此可见，实验数据存在一定的误差，引起误差的原因有：一 培养的细胞质量存在较大差距：并不是都是用处于生长对数期的细胞进行处理，组与组
6、之间的细胞浓度差距；二 吸出培养液加入不同浓度梯度VCR培养三天，培养液被吸出，细胞所需的能量供应不足，吸出的量不一样，导致细胞生长情况不一致； 三 加入MTT培养四小时后，弃去上清液，若上清液有残留，则影响光吸收值的准确性；四 由于仪器或者操作不规范等人为的原因，造成的实验误差。表2 硫酸长春新碱不同诱导浓度处理Hela 后细胞增值抑制率b)诱导浓度（ug/ml） 细胞增殖抑制率(%)诱导浓度（ug/ml） 细胞增殖抑制率(%)0.0520.420.165.050.271.580.480.840.15618.760.31254.080.62557.171.2566.00b)表中所列为同一批次
7、 Hela 细胞同时处理的结果由表2可知：两组处理的细胞抑制率均随药物浓度增大而增加，诱导浓度为0.4 ug/ml抑制率高达80.84，这与相关报道相符合；在这批次中，诱导浓度为0.10.2ug/ml的另一组0.156ug/ml测得抑制率为18.76，与0.10.2ug/ml所测抑制率差异性显著（P0.05），与表1出现的情况类似，除了表1分析的可能原因外，还有可能是由于Hela 细胞对VCR的浓度的敏感性，不呈规律。这与其作用机理和作用环境因素有关。4 讨论长春新碱是植物长春花中提取的生物碱,其抗肿瘤效果比较显著,抗瘤谱也比较广泛6。从本实验中提示VCR对肿瘤细胞的抑制和破坏作用效果明显。V
8、CR对细胞膜的破坏作用,可能是对质膜主要成份- 脂质运转抑制的关系。细胞膜是脂质和蛋白质内主要成分组成的液态镶嵌结构,一旦脂键被破坏,则细胞质膜必然出现断裂或消失现象。不仅细胞质膜有如上变化,线粒体嵴和线粒体表层膜也因此而表现消失现象。由于VCR易与微管蛋白结合7 ,出现两种相关现象: 细胞周边微绒毛样结构消失； 染色体滞留于细胞中央,这是有丝分裂停滞于分裂中期的表现，另外,次级溶酶体增多,细胞内水解酶功能下降或是细胞器破坏过多。核糖体减少、内质网扩张和胞质水肿等均提示VCR对超微结构的破坏性是比较明显的,对细胞代谢有比较严重的影响8。VCR为生物碱类药,它对细胞的有丝分裂有抑制作用, 使有丝
9、分裂停止于中期5，最终导致细胞凋亡。近年来,人们通过操作特异性基因表达来干预肿瘤细胞,使其对化学或物理性抗肿瘤药物具有更高的敏感性,并且通过这种方法及其它相关手段不断深入地阐明了抗肿瘤药物诱导细胞凋亡的分子机制。但还有一些问题有待探讨,如: (1)与细胞凋亡关系紧密的Bcl22蛋白家族活动的精确机制仍未完全了解；(2)许多影响抗肿瘤药物敏感性的因子间的相互作用及关系还未阐明；(3)尽管许多实验研究表明,细胞凋亡机制成分的变化对肿瘤细胞的细胞毒性治疗敏感性有影响,但这种假设仍需在临床上加以检验；(4)在细胞毒性治疗中,尽管其主要机制是caspase介导的细胞凋亡,但“非典型细胞凋亡”或细胞死亡的
10、非凋亡方式(如细胞坏死等) ,同样应考虑是细胞毒性治疗的一种反应；(5)虽然联合治疗能提高药物敏感性,但其作用的精确机制仍需阐明9；此外,抗肿瘤药物治疗中仍存在耐药性等,这些问题都需要深入研究。5 展望VCR 口服吸收差，需静脉注射，静注后能迅速分布全身，神经肌肉内浓度较高，这可能是其神经系统毒性大的原因10-12。用于临床上，由于VCR作用于机体内，VCR对正常细胞的杀伤力和病人的身体状况和承受能力应作为考虑的重点。目前很多研究者都在进行将脂质体作为抗癌药物靶向治疗的研究。脂质体具有类细胞结构，而且可以改变被包封药物的体内分布。此外，它对机体毒副作用小，其脂质双分子层与生物膜有较大的相似性与
11、组织相溶性，易于被组织吸收，从而提高药物的治疗指数、减少药物的治疗剂量，降低药物的毒性13-14。因此脂质体作为抗癌药物靶向治疗将成为抗癌方法的研究方向。参考文献1 Stoklosa T, Golab J. Prospects for p532based cancer therapy J . Acta Biochimica Polonica.,2005,52(2): 321 - 328.2 Estlin EJ, Ronghe M, Burke GA, et al. The clinical and cellular pharmacology of vincristine, corticoste
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13、,2003,4 (Suppl 1):S18-22.4 耿素云，张立昂.概率统计M.北京：北京大学出版社，2003，160161.5 李兆艾，赵敏，赵嘉慧。化疗药物诱导宫颈癌Hela 细胞凋亡的研究J. 中国药物与临床，2004，4（3）：184186.6 卢懿,侯世祥,陈彤,等. 长春花抗癌成份长春新碱研究进展 J . 中国中药杂志, 2003, 28 (11) : 10061008.7 姜宏华,张一楚,戴冰冰,等. 阿霉素和长春新碱对PRb胃癌细胞株的影响 J . 外科理论与实践, 2003, 8 (1) : 5053.8 赵荧,赵铁军,薄爱华，等。硫酸长春新碱对胃癌细胞超微结构的影响J.
14、现代肿瘤医学，2005，13（5）：447.9 戴菁池,曹明富.抗肿瘤药物诱导细胞凋亡的分子机制研究进展J. 杭州师范学院学报(医学版)。2007，27（1）：4447.10 Todd GC, Gibson WR, Morton DM. Toxicology of vindesine(desacetyl vinblastine amide) in mice, rats, and dogsJ. J Toxicol Environ Health, 1976 , 1(5):843-850.11 Bermudez M, Fuster JL, Llinares E, et al. Itraconazol
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