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1、矿化胶原和磷酸化壳聚糖骨修复材料的细胞生物相容性研究The Study on Cytocompatibility of Mineralized Collagen and P-Chitosan Bone Repair Materials 院（系、所）：材料系工程领域：材料工程申请人： 指导教师： 教 授联合指导教师： 副主任医师二零零 年 月关于论文使用授权的说明本人完全了解 大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。(保密的论文在解密后应遵守此规定)签 名： 导师签名：日
2、 期： 中文摘要矿化的胶原和壳聚糖类等一些天然的高分子物质近年来越来越多地被用于骨缺损的研究，其中纳米-羟基磷灰石/胶原/聚乳酸框架材料 (nano-Hydroxyapatite/collagen scaffold, nHAC/PLA scaffold) 和磷酸化的壳聚糖是近年来骨缺损修复材料领域中的热点。在此基础之上，本研究进行了这两类材料的细胞相容性的研究和部分动物实验。通过用体外细胞培养的方法，建立了成骨细胞与nHAC/PLA框架材料的三维复合体，并将其植入大块骨缺损的动物模型中，结果表明，材料具有很好的生物相容性，细胞在材料上正常的贴壁、增殖和迁移生长，并能够长入框架材料的空隙内部。同
3、时还有实验表明nHAC/PLA复合材料具有优异的骨传导性，当植入缺损后骨可在这种支架上进行爬行替代性生长，一定程度上起到缩小缺损尺寸的作用。nHAC/PLA与rhBMP-2复合后又具有了高效的骨诱导性，在本研究中又关于材料和细胞生长因子对成骨细胞的诱导分化作用的进行了初步探讨。良好的细胞相容性和骨传导性以及高效的骨诱导性使这类材料具有较大的临床应用潜力。可以为临床治疗骨缺损提供高效的备选材料。壳聚糖被磷酸根基团修饰后，可以得到具有水溶性的磷酸化壳聚糖，由于改性以后具备了水溶性，因此这一类材料就可以被广泛地应用于生物材料领域。通过研究磷酸化壳聚糖与成骨细胞的相互作用，我们得知经过改性的磷酸化的壳
4、聚糖仍然具有良好的生物相容性，同时对成骨细胞具有骨诱导性。因此，也为临床骨修复材料的研究提供了另一种可行的途径。关键词：骨修复材料，nHAC/PLA骨框架材料，磷酸化壳聚糖，细胞生物相容性AbstractMineralized collegen and chitosan were more and more applied in the bone repair fields. Nano-Hydroxyapatite/collagen (nHAC/PLA) scaffolds and phosphorylated chitosan are two kinds of prospected bone
5、 tissue substitution materials in this area. Based on the former work of our lab, series cell assays and animal trails were conducted to eveluate the cytocompatibilities of nHAC/PLA and P-chitosan. The results show that nHAC/PLA and P-chitosan possess excellent cytocompatibility and osteoinduction.
6、Osteoblasts were co-culture with the nHAC/PLA scaffold materials. The animal trails and the cell tests both show that this kind of scaffold has an excellent biocompatibility and effective osteoinduction. This will help this scaffold have more potenial applications.Another part of this research is to
7、 evaluate the differentiation of the osteoblasts under the co-effect of BMP and the nHAC/PLA scaffold materials. But this is only a starting research, which needs more molecule biology researches to clarity hypothesis.Water-soluble P-chitosan was investgated in our study on the cytocpmatibility and
8、osteoinduction of P-chitosan. The results implied that the chitosan modified by PO3= groups has excellent cytocompatibility and osteoinduction with the osteoblasts. It is postulated that water-soluble P- chitosan could also be a promising biomaterial for tissue engineering and have potential uses in
9、 bone repair field.Key words: bone repair materials, nHAC/PLA scaffold, phosphorylated chitosan（P-chitosan）, cytocompatibility目 录第1章 引言1 1.1 课题目的和意义11.2 骨修复材料和生物相容性21.3 骨系细胞与骨的生长21.3.1 骨系细胞21.3.2 骨的形成模式41.3.3 骨折愈合与骨重塑51.3.1 骨生长因子71.4 骨修复材料的国内外研究现状91.5 论文各部分的主要内容13第2章 NHAC/PLA骨组织工程框架材料的细胞相容性研究142.1 纳
10、米羟基磷灰石/胶原/聚乳酸骨组织工程框架材料的制备142.2 NHAC/PLA骨组织工程框架材料的细胞生物相容性研究142.2.1 背景和实验设计142.2.2 细胞生物相容性实验142.3 nHAC/PLA骨组织工程框架材料的动物实验模型212.3.1 背景 212.3.2 实验动物 212.3.3 SD大鼠胫骨3mm3MM4mm节段性骨缺损修复模型 222.3.4 犬桡骨20mm节段性骨缺损模型及胸椎和腰椎前路椎体融合模型 242.3.5 讨论 242.3.6 结论 26第3章 复合BMP的骨框架材料诱导成骨细胞分化的初步研究273.1 实验设计273.2 实验仪器273.3 实验方法27
11、3.4 实验结果293.5讨论及结论30第4章 磷酸化壳聚糖的细胞生物相容性和骨诱导性研究324.1 实验设计324.2 实验仪器324.3 实验方法334.4 实验结果354.5 讨论及结论38第5章 结论40参考文献41致谢、声明46个人简历、攻读硕士学位期间发表的SCI和待发表的学术论文47第1章 引 言1.1 课题目的和意义基于近年来组织工程学科的迅速发展，组织工程骨修复材料有望成为最早实现的组织工程产品1,2。骨组织工程的基本出发点是以“诱导成骨”的方式而不是单纯以“爬行替代”的方式实现骨的修复和再生。骨组织工程的三个关键要素为信号分子（骨生长因子、骨诱导因子）、框架材料、靶细胞。通
12、过研究骨系细胞与骨修复材料的相互作用，可以为实现组织工程骨提供切实可靠的实现方法和机理研究模型。骨材料，无机非金属骨修复材料以及羟基磷灰石/胶原复合材料的生物相容性都已有了较全面的报道，目前纳米羟基磷灰石/胶原复合物(nHAC composite)因从成分和结构上比一般骨修复材料更接近天然骨，近年来颇受众人关注3,4。本实验室在此方面也有一定的研究基础6-8。纳米相羟基磷灰石/胶原复合物的复合框架材料是当前骨组织工程学中新型的骨修复材料。羟基磷灰石，胶原，高分子聚合物如PLA和壳聚糖等都已先后被证明具有良好的生物相容性。进一步实验验证纳米羟基磷灰石/胶原/聚乳酸的骨修复框架材料具有良好的细胞生
13、物相容性，对于指导外科骨缺损的修复具有重要的临床意义。并进一步研究复合细胞生长因子的框架材料是否具有诱导成骨细胞分化的能力，对于指导框架材料的进一步的临床应用，包括细胞分子水平的治疗都具有指导意义。甲壳素是自然界中仅次于纤维素的天然多糖，广泛存在于昆虫、甲壳类动物外壳及真菌细胞壁中。经脱乙酰化反应变成甲壳胺，即壳聚糖。壳聚糖一般不溶于水、碱和常规有机溶剂中。只溶于盐酸等无机酸及甲醇、乙醇等。这类天然多糖具有明显碱性、良好的生物相容性和生物可降解性。壳聚糖类分子中有许多胺基和羟基，容易进行化学修饰和改性。壳聚糖的生物相容性一般认为是良好的，但这些评价大都是将壳聚糖制成膜材料、线材料和药物载体的研
14、究观察到的。并且有报导所有的壳聚糖制成的膜对于成纤维细胞都具有良好的细胞相容性，并且可以促进细胞的生长和细胞在膜上的附着9。在王晓红博士后的研究课题中，用磷酸根基团对壳聚糖进行了修饰和改性，得到水溶性的磷酸化壳聚糖，并对其进行了一系列材料性能的表征和生物相容性的实验，发现磷酸根基团对进行壳聚糖改性以后，可以明显增强壳聚糖和金属离子的结合力，特别是Ca2，并将磷酸化的壳聚糖添加到磷酸钙的骨水泥中进行动物的体内实验，观察到磷酸化的壳聚糖在一定程度上可以明显改善磷酸钙骨水泥的机械性能，并且表现出良好的生物学性能和成骨性能10。但是究竟磷酸化壳聚糖对成骨细胞有何生物学性能表征的改善，并没有相关的实验验
15、证。因此，在此研究课题中中，对这种水溶性的磷酸化壳聚糖进行了和成骨细胞之间的细胞生物相容性和骨诱导性进行了一系列研究。以期为骨组织工程材料的进一步研究提供另一种可行的途径。1.2 骨修复材料与生物相容性生物相容性是生物医用材料区别于其他材料的最重要特征。Park11对生物相容性作了一般性的定义，即生物相容性表示生物材料可被机体所接受的程度。多年来，人们对生物材料与组织的相互作用进行了大量的研究，使生物相容性的概念不断充实和完善。材料和活体系统的相互作用包括两个方面13, 14：一是材料反应，即活体系统对材料的作用，包括生物环境对材料的腐蚀、降解、磨损和性质退化，甚至破坏。二是宿主反应，即材料对
16、活体系统的作用，包括局部和全身反应，如炎症、细胞毒性、凝血、过敏、致癌、畸形和免疫反应等。了解生物材料与活体细胞和组织的相互作用，是更好的设计与应用生物材料的基础。1.3 骨系细胞与骨的生长1.3.1 骨系细胞骨的生长发育涉及的主要细胞包括16：骨前体细胞（osteogenitor cell）、成骨细胞（osteoblast）、骨细胞（osteocyte）和破骨细胞（osteoclast）。图1-1是骨中细胞的示意图17。在内骨膜、骨皮质、外骨膜及骨表面均覆有一层骨前体细胞，其形态与成纤维细胞（fibroblast）类似，呈细长形，核与胞浆较淡。在正常骨的生长与重塑时，骨前体细胞通过有丝分裂而
17、增生，并分化为成骨细胞。骨折后，这些前体细胞被激活并分化为成骨细胞，参与骨缺损的修复和愈合。成骨细胞一般呈立方形、圆形，直径2050微米，胞浆丰富，因含大量核糖核蛋白，故具有嗜碱性。在细胞中央与核相邻处存在透明区。细胞核较大，呈圆形或椭圆形，染色质少而淡，有13个核仁。成骨细胞一般呈单行排列，覆盖于新生骨表面，核常位于新生骨表面相对的一侧，而胞浆靠近新生骨。细胞表面存在大量微绒毛突起，与相邻细胞连接形成网状，当成骨细胞转变为骨细胞后，这些突起就位于骨小管内。成骨细胞内充满发育良好的粗面内质网；高尔基器宽，并形成囊泡；线粒体小而量多，呈圆形；此外还有溶酶体、囊泡与糖原颗粒等。成骨细胞的一个重要功
18、能是合成与分泌原胶原、蛋白多糖与糖蛋白，形成骨的有机基质，这种尚未矿化的骨样组织称为类骨质。原胶原分子在粗面内质网内合成，而后转移至高尔基器，并被装入分泌性囊泡内，通过胞吐作用被分泌到胞外空间，进一步组装成胶原微纤维和胶原纤维。成骨细胞含有大量线粒体，表明具有高度代谢活性。线粒体内含3050纳米的钙磷颗粒，有观点认为，钙磷颗粒可被运送到高尔基器内，再由基质囊泡运送到细胞体外，诱发骨的矿化。成骨细胞的一个重要生化指标是具有高度的碱性磷酸酶活性，通常定位于细胞膜附近，此外，焦磷酸酶等特殊酯酶对矿化过程也有重要作用。在体外细胞培养实验中常把碱性磷酸酶作为是否具有成骨细胞表型的一个判据。图11骨中细胞
19、类型及分布示意图成骨细胞被自身分泌的骨基质包埋后就转变为骨细胞。幼稚期的骨细胞仍具有成骨细胞的形态，有细长细胞突起，内质网发育良好，高尔基器体大，有大量囊泡，线粒体多，位于细胞一侧，此时的骨细胞仍具有产生细胞外基质的功能。随着骨陷窝壁新生基质的沉积，骨细胞缩小，变为形成期的骨细胞，有细胞突起，但粗面内质网与线粒体等较少，高尔基器体小。成熟的骨细胞呈扁平或卵圆形，位于板层骨内，细胞长轴平行于板层，细胞表面仍有大量突起，核体积大，粗面内质网极少，高尔基器不发达，线粒体少，表明蛋白质合成功能低下。骨细胞又具有骨吸收作用，通过使陷窝周围骨质溶解，可调节血清钙的内环境稳定。骨细胞的突起位于骨小管内，分布
20、在骨基质中构成网络结构，使骨细胞彼此联系，电解质及小分子物质可在细胞间移动。骨细胞位于基质内，直到死亡，但当破骨细胞吸收周围的钙化基质时，骨细胞可从骨陷窝中露出，可能恢复到骨前体细胞再分化为成骨细胞。破骨细胞是一种多核巨细胞，直径为20100微米，含有2个以上甚至多达100个核，平均为2030个，核呈不规则的圆形或卵圆形，有12个核仁。破骨细胞的重要形貌特征是在贴附骨的表面处具有刷状缘结构，并伸入骨基质中，这是一些纤细的指状突起，由细胞膜的折叠构成。环绕刷状缘的细胞膜区域称为透明区，存在垂直于细胞表面的微丝，可控制刷状缘的移动或封闭细胞与骨相联接的部位，这部分膜结构因其功能而又被称作封闭区。破
21、骨细胞含有较多溶酶体和大量线粒体、液泡、囊泡。刷状缘的细胞膜上存在“质子泵”，可向胞外输运H+离子17。破骨细胞的功能是进行骨吸收，由刷状缘和透明区共同构成完整的骨吸收装置，提供骨吸收的微环境。首先由透明区的活动封闭骨表面的局部区域，而后H+离子和溶酶体酶等透过刷状缘被分泌到胞外，造成局部的酸性环境，溶解骨的无机质后再消化有机基质。破骨细胞活动的结果使骨表面出现大小不一的浅腔，称为吸收陷窝或Howships陷窝（Howships lacunae）。一般认为破骨细胞起源于造血组织，由造血细胞源性单核细胞互相融合而形成，但关于破骨细胞的前体与单核吞噬细胞的前体是否相同目前还无定论18。1.3.2
22、骨的形成模式 骨的形成模式主要有三种：膜内成骨（intramembranous ossification）、软骨内成骨（endochondral ossification）和附加性成骨（appositional ossification）19。 （1）膜内成骨 膜内成骨发生于颅盖与部分颅底、面骨、锁骨及下颌骨的某些部位，骨形成过程没有软骨出现。首先由未分化的间充质细胞聚集、多层排列成膜状，这些细胞分泌松散的基质，其中含血管、成纤维细胞、骨前体细胞等。成骨细胞分化形成并分泌针状或岛状的骨基质，骨基质随即钙化，成骨细胞覆盖在这些岛状骨表面并继续增加骨基质。被骨基质包埋的成骨细胞转变为骨细胞。最早出
23、现成群的成骨细胞的部位称为骨化中心，原始的骨小梁从原发骨化中心向周围扩展。 （2）软骨内成骨 胚胎期长骨的发育为典型的软骨内成骨20，是软骨性原基被骨代替而形成骨软骨复合体的过程。首先由未分化的间充质细胞聚集，分泌软骨基质，分化成软骨细胞，形成透明软骨和软骨膜，构成骨胚基的轮廓，此软骨性模型以后将被骨所代替。骨化自软骨模型中部开始，位于中央的软骨细胞开始肥大，软骨基质钙化，软骨膜变为骨膜，形成原始骨领，原始骨领被纤维血管组织侵入，新生骨替代钙化软骨，形成原始骨化中心，这一过程不断进行并向两端扩展。各种前体细胞随血管组织进入并发生分化，成骨细胞在矿化的软骨基质上分泌骨基质，破骨细胞则吸收钙化软骨
24、和不成熟的骨组织，软骨模型中央部分被吸收而形成骨髓腔。 （3）附加性成骨 附加性成骨发生于骨的膜性增大及骨重塑的过程中，是成骨细胞在现存骨表面排列并分泌连续性层状类骨质，随后钙化为板层骨的成骨模式。在骨的发育及生长中，由软骨内成骨或膜内成骨方式形成骨性原基，表面覆盖骨膜，骨膜下成骨细胞通过在骨表面分泌类骨质直接增加新骨；在骨重塑中，成骨细胞在破骨细胞造成的骨吸收区分泌新骨也是以这种模式进行。1.3.3 骨折愈合与骨重塑骨具有自修复功能，骨折后骨开始进行自愈合。骨折愈合的基础是骨膜中骨形成细胞（osteogenic cell）的增殖与分化。骨折愈合可分为如下几个依次交替演进的过程16,21, 2
25、2。 （1）血肿形成：骨折后，邻近软组织包括骨膜及血管等也被撕裂，血管破裂出血，在骨折断端之间及其周围形成血肿，随即凝固，并有纤维蛋白析出，如同支架，初步起着暂时固定断端的作用。 （2）发炎与清创：血肿中含有大量的红细胞、白细胞、多形核嗜中性细胞、巨噬细胞等。巨噬细胞吞噬坏死组织、细胞碎片、残余细胞器等，并在胞体内溶解、消化和吸收。 （3）纤维骨痂形成：从骨膜等处有新生的毛细血管、成纤维细胞、骨形成细胞等侵入血肿。成纤维细胞分泌大量胶原纤维，将血肿分化后，形成纤维骨痂，可将骨折的断端接合及包围起来，局部膨大呈梭形。纤维骨痂较软，又称暂时性骨痂，按所处部位，分为骨外膜骨痂、桥梁骨痂、连接骨痂及封
26、闭骨痂，如图12所示23。图12骨折愈合过程中各期骨痂形成示意图 （4）初期骨质骨痂形成：纤维骨痂演化为骨质骨痂的过程包括钙盐沉积包围成纤维细胞使之直接转变为骨细胞的方式，但主要是通过骨形成细胞分化为软骨细胞和成骨细胞，分泌基质构成骨样组织，逐渐取代纤维骨痂。最初分泌的胶原纤维纵横交错，呈不规则未定向分布，矿化而成的骨小梁为编织骨。 （5）二期骨质骨痂形成：新形成的编织骨表面存在成排的成骨细胞不断分泌骨样组织，骨小梁融合，内部空隙逐渐被新生骨组织所填充。哈佛氏系统出现，编织骨逐渐向板层骨演变，由成熟的板层骨构成的骨质骨痂又称为终期性骨痂。与此同时，软骨细胞增殖形成软骨性骨痂，通过软骨内成骨模式
27、演变为骨质骨痂。 （6）骨的改建与重塑：随骨痂范围和密度的逐渐增加，髓腔也被骨痂填充，最后骨痂与皮质相连，骨折间隙消失，达到骨性愈合。这种新形成的骨组织，随着肢体的运动和负重及骨周肌群的作用，骨痂重新排列，以适应生物力学的需要，破骨细胞吸收多余骨痂，并使骨髓腔再通，骨痂不足之处，通过膜内成骨补充，最后使骨折部位恢复正常结构与功能。 骨的改建涉及骨骼外形结构的改变，而骨重塑只对骨组织内部结构进行调整。骨重塑不仅发生于骨折愈合过程，生理性骨重塑伴随人的一生。骨重塑在松质骨和密质骨的表现有所差别，但都依赖于成骨细胞和破骨细胞的活动，即骨形成和骨吸收之间的平衡与协调。在松质骨中，重塑过程在骨小梁表面进
28、行，破骨细胞形成Howship陷窝，成骨细胞迁移过来，进行附加性成骨，这一现象被称为“爬行替代”；在密质骨的情形，破骨细胞对骨的吸收就象挖掘隧道一样深入骨的内部，血管组织和成骨细胞或其前体细胞随之也深入进去，成骨细胞在被吸收后的骨表面分泌和沉积出新的层板状骨，当围绕血管形成了多层同心骨板后，即为一个新的哈佛氏系统24。1.3.4 骨生长因子除了BMP外，骨细胞内和骨基质中还含有多种与骨骼生长有关的生长因子，如转化生长因子、骨骼生长因子、骨衍生性生长因子等。目前认为，一部分骨生长因子是通过局部旁分泌方式作用于靶细胞参与骨折愈合过程的，如转化生长因子(TGF)；另一部分骨生长因子则通过全身调节作用
29、于靶细胞。在骨形成过程中，骨生长因子的主要作用表现为：(1)调节靶细胞的增殖和分化过程；(2)改变细胞代谢产物和影响骨基质的形成；如胰岛素样生长因子(IGF)；(3)调节细胞内的组成成分，比如影响间充质细胞的迁移和形态变化25。1转化生长因子(TGF)在骨组织内，TGF主要分布在成骨细胞和骨细胞周围，含量约为每克骨组织中含200ugTGF。TGF家族有很多成员，其中TGFB在骨组织再生中调节作用较大。普遍认为，TGFB可以刺激骨膜间充质细胞的增生和分化，促使成骨细胞和骨细胞的增殖，刺激I型胶原纤维的合成，抑制破骨细胞对骨组织的吸收，诱导膜内成骨和软骨内成骨过程。同时TGFB也是骨组织再塑的关键
30、性因子。研究表明，TGFB不仅在骨组织修复过程中调节多种细胞的增殖和分化，而且对胚胎组织细胞的发生和分化也具有重要的调节作用。在骨折的炎症阶段和软骨痴形成期，随着骨折区成骨细胞的大量增生，TGFB的信使RNA含量也明显增加；随着骨痂的成熟，TGFB逐渐消失。因此，在成熟的骨痂内，TGFB含量很低。在骨组织改建期，TGFB刺激骨组织吸收的作用比较明显，从而说明该因子在骨折后期对骨组织的重建也具有重要的调节作用。有人研究证实：人与许多动物的TGFB分子非常相似，说明各种动物的TGFB的基本作用是一致的。另外发现，成纤维细胞、间皮细胞、软骨细胞等许多细胞都能产生TGF-B。而且几乎所有的细胞表面都具
31、有TGF-B的受体，说明TGF-B具有能和大多数细胞结合的能力。 2血小板衍生生长因子(PDGF) PDGF是一个具有双链的蛋白质，分子量为30k。主要来源于血小板，也存在于骨基质和骨肉瘤组织细胞之中，在骨组织中的含量约为50ug/g。在创伤部位，血液在凝固时可以释放PDGF，有人发现成骨细胞也能产生PDGF。PDGF直接作用于间充质细胞，能够促进正常细胞的增殖和分化。PDGF还能刺激软骨细胞和成骨细胞的增生，促进骨痴中软骨形成和膜内化骨。在骨折早期，骨痂中PDGF的信息RNA表达达到高峰。 3骨骼生长因子(SGF) 1982年，人们从人骨和鸡骨中提取出SGF，其分子量为11k。该因子对胰蛋白
32、酶敏感，对热、胶原酶和还原剂有耐受性。体内植人SGF后，可刺激胚胎中胚层细胞DNA的合成。在成体，可刺激骨系细胞的增殖，但不刺激成纤维细胞的生长，对骨组织的形成和吸收有双重作用。甲状旁腺控制SGF的合成。 4骨衍生性生长因子(BDGF) BDGF为骨基质中含有的一种蛋白质。该因子既可以刺激骨细胞的增殖和胶原纤维的合成，刺激软骨细胞基质的合成、软骨细胞的增殖，还可以作用于多种组织，如促进成纤维细胞的有丝分裂等。因此，认为BDGF具有与转化因子相似的活性，还具有与胰岛素样生长因子相似的活性，调节骨骼生长。BDGF由骨细胞分泌，结构上与B微球蛋白相似。 5成纤维细胞生长因子(FGF) 在骨折早期，F
33、GF由坏死细胞中释放出来。FGF的主要作用是促进成骨细胞增生和胶原的形成，从而促进骨折愈合。此外，FGF还能刺激毛细血管的增殖，促进毛细血管向骨折区域生长。研究结果表明，在骨折处局部注射FGF，可提高软骨的数量，但是2型胶原纤维的信息RNA表达减少。如果将FGF注入软骨痂内，可延迟软骨内的化骨过程。将FGF与BMP结合修复骨缺损时，疗效较优。 6软骨衍生性生长因子(CDGF) CDGF由软骨细胞所分泌，其分子量在810k。有人认为，CDGF属于局部生长调节因子，具有促进骨和软骨的生长作用。除了上述调节因子外，还有其他与骨生长有关的局部调节因子，如上皮细胞生长因子及胰岛素样生长因子等。 骨的形成
34、是一个极为复杂的过程，整个过程受全身性生长因子和局部性生长因子共同调控。一般认为，BMP是可使间充质细胞分化成骨系细胞的因子，其主要作用是起动骨的形成。在成骨过程中，分化后骨系细胞的进一步增殖和分化则取决于各种生长因子的作用。这些生长因子是较强的丝裂因子，有些能够使已分化的细胞发生增殖，有些能够抑制细胞的增殖和分化作用。因此，有人将这类因子统称为调节因子。1.4 骨修复材料的国内外研究进展具体到骨组织工程，通过成骨细胞的诱导分化与增殖并生长活体骨组织用于骨的修复和再生，将有望促进外科修复大范围骨缺损的进步。骨组织工程的三个关键要素为信号分子（骨生长因子、骨诱导因子）、基体材料、靶细胞。基体材料
35、一方面作为信号分子的载体，将其运送至缺损位置，另一方面提供新骨生长的支架。骨诱导因子的靶细胞是一些血管周围游走的、未分化的间充质细胞，其具有多向分化的特性，即可分化形成肌组织、纤维组织、脂肪组织或骨组织，但在骨诱导因子的作用下，将不可逆的向软骨细胞、骨细胞的方向分化，从而增补成骨性细胞，满足修复大范围缺损的需要。骨生长因子则可以刺激成骨性细胞的有丝分裂，从而形成大量新骨。这种成骨的方式称为“诱导成骨”。因此，骨组织工程的基本出发点是以“诱导成骨”的方式而不是单纯以“爬行替代”的方式实现骨的修复和再生。骨修复材料有望成为最早实现的组织工程产品3,4。关于诱导成骨的经典工作是Urist 和Redd
36、i等人完成的26,27。早在1965年，Urist发现当将失活的脱钙骨基质植入实验动物的肌肉内，两周内便可观察到新骨的形成，他将此现象称为诱导成骨26。Reddi等人揭示了诱导成骨中的一系列组织反应，将脱钙骨基质植入肌肉或皮下时，未分化的间充质细胞被激活并向植入部位迁移，细胞贴附于基质上，通过有丝分裂大量增殖，细胞分化形成软骨，软骨矿化，血管侵入软骨，成骨细胞分化形成并分泌骨基质，最后是骨基质矿化和骨髓的分化形成。1981年，Reddi等人完成了一个很重要的实验28，他们发现从脱钙骨基质中提取的具有骨诱导能力但本身失活的信号分子必须与适当的载体材料重组才可以恢复骨诱导活性。他们采用的载体材料是
37、胶原性骨基质，其主要组成是交联的I型胶原。1983年，Urist等人29采用b磷酸三钙作为诱导因子的载体植入肌肉，发现新骨产额比单纯植入诱导因子的新骨产额高出12倍。这些实验揭示了基体材料对于信号分子作用的有效及高效发挥具有举足轻重的影响。近几年来，骨修复材料的应用研究已经在矫形外科、口腔外科及颅面外科等多个领域蓬勃展开。根据2000年生物材料大会14及2003国际生物材料大会，可以大致了解当前国际研究的基本情况。与骨组织工程相关的研究集中在四个方面：一是信号分子包括BMP系列和新的种类生长因子的基础研究如细胞生物学和分子生物学研究，尤其是与基因工程的结合；二是采用各种新型的仿生骨替代材料的研
38、制和其作为载体的应用研究；三是基质干细胞的研究与应用；四是涉及新材料与BMP复合的临床实验。其中，对信号分子的有效输运模式及这些因子在设计制造新型骨替代材料中的应用是当前的关键内容。具体分析可以看出，在基本原理指导下，骨组织工程应用的战略可分为两种：一种是载体材料与信号分子在体外组装后植入体内，通过信号分子诱导成骨性细胞的分化形成进而生长新骨；另一种是利用体外细胞培养技术获得足够数量的成骨性细胞，并与载体材料在体外组装后植入缺损部位。与这两种基本战略密切相关的论文如表11所示。有希望近期得到应用的是成分和结构上都做到了部分仿生，通过胶原的体外模拟矿化，使之与成为体内的天然骨近似的矿化胶原纤维，
39、制成块状材料,用于各类骨缺损修复。本课题组在我组矿化胶原研究的基础上，制备了纳米羟基磷灰石胶原聚乳酸框架材料68，研究该材料的生物相容性的特性，最终达到临床的实际应用。目前，所研究的信号分子多为重组的人骨形态发生蛋白（rhBMP2）和重组的OP1（rhBMP7），并且已经开始了其与材料复合进行临床实验。其他的生长因子还有TGF，FGF，BMP4等。涉及到在不同的载体材料上，生长因子的复合与释放的研究直接与临床的骨愈合效果相关，不同的新生长因子的特性，甚至两种因子复合植入时的释放动力学和愈合效果也有待确认。基本上，因子的获得已经从动物骨中的提取走向了用基因工程体外表达的方法。细胞培养基本上采用骨
40、髓基质干细胞或由其发展而成的成骨细胞系。表11 2000年生物材料大会及2003美国生物材料大会报告的骨组织工程应用研究研究者载体材料细胞培养或诱导因子材料特征K W Leong等(美国, Johns Hopkins Univ.)PPE-EaChitosanDNA+OP-1多孔结构J.R. Lieberman, C T Laurebcin等(美国, Drexel Univ)PLGA/HA复合材料1) rhBMP-22)基因治疗LA:GA=50:50PLGA:HA=1:1 (w/w)J.D. de Bruijn等(荷兰, Univ. of Leiden)1) PEO/PBT共聚物(Polyact
41、ive tm)2) HAP骨髓细胞培养1) 多孔薄膜，孔径300600 mm2) 多孔板状, 孔径400 mm, 孔隙率30L G Griffith等(美国, MIT.)PMMA-r-POEM骨髓基质干细胞复合多肽P Ducheyne等 (美国, Univ. of Pennsylvania)生物活性玻璃人的基质干细胞，颗粒状，粒径300350 mmA.G. Mikos等(美国, Rice Univ.)PEG体内骨髓基质成骨细胞，K. Patterson等(美国, Clemson Univ.)HAP胶原复合材料成骨细胞机械混合，多孔结构崔福斋等 (清华大学)纳米HAP-胶原复合成骨细胞仿生制备K
42、 E Healy等 (美国, UC Berkeley)Isoproylamide PAAC成骨细胞RGDJ.M. Toth等 (美国, Med. Colle. Wisconsin)HAP/ b-TCP复合材料rhBMP-2HA:b-TCP=50:50多孔结构K Soballe等(丹麦, Aarhus Univ Hospital)表面镀磷酸钙盐膜的钛植体RGD等离子喷涂D.A. Puleo等(美国, Univ. Kentucky)PLGArhBMP-2LA:GA=50:50多孔微球C.J. Damien等(法国, INOTEB S.A.)珊瑚骨架与胶原复合材料牛骨BMP机械混合张兴栋等(四川大学
43、)HA/TCP表面蛋白处理M Hawkins等(美国, Stryker Howmedica Osteonics.)表面镀磷酸钙盐膜的钛植体OP-1值得一提的是Lieberman等人的工作，他们将基因疗法与骨组织工程结合，利用转基因技术使一种鼠基质细胞系具有了分泌rhBMP2的能力，然后使细胞与PLGA-HA复合载体材料组装，并在肌袋植入模型中观察到了异位成骨。虽然基因疗法与骨组织工程的结合的研究还处于初期阶段，其重要性已经得到各相关研究组的关注。为了提高框架材料的细胞相容性，在材料表面接枝上蛋白或多肽，使得细胞容易识别，虽然还没有体内实验证明此法的优越性，体外实验已经明显的证明了此种表面处理方
44、法能促进骨类细胞的贴壁和生长。对于一种理想的骨修复材料首先应该具备的特性有：（一） 生物相容性3: 可与骨直接进行化学结合，不阻止骨细胞在其表面的正常活性或干扰其周围骨细胞的自然再生过程, 对骨组织的分解吸收具有传导性。（二）机械耐受性: 以小梁骨为准，抗压强度应大于5 MPa，抗压模量在45-100 MPa之间。（三）生物降解性: 在一定时间内被宿主骨替代，不影响骨组织的修复，无毒副作用。(四) 诱导再生性: 通过自身或添加骨诱导因素，刺激或诱导骨骼生长。简言之，移植物的生物特性应与自然骨相似。目前，骨修复的分子生物学研究尚处于发展中阶段，还不清楚骨修复时不同细胞群体的聚集、定位和协调控制的
45、机制，各种细胞因子或生长因子的细胞网络怎样工作，以及如何有效地补充所需要的外源性骨生长因子等。细胞生物学面临着如何在体外调控骨细胞的生长、增殖，使其正常分泌基质；如何建立大规模的细胞培养系统等。随着分子生物学，医学的飞速发展，免疫消除、生物仿制、基因治疗等在骨修复方面都有可能取得突破性的进展。1.5 论文各部分的主要内容本论文旨在研究两类用于骨缺损修复新型材料nHAC/PLA和磷酸化壳聚糖的细胞相容性，从组织工程学的角度开展了若干基础研究。主要研究内容如下： （1）通过体外细胞培养的方法，建立成骨细胞与nHAC/PLA材料的三维复合体，并将nHAC/PLA材料与生长因子骨形态发生蛋白(rhBM
46、P-2)复合，进行细胞生物相容性和动物模型的实验。（2）通过体外培养和动物体内实验的方法，研究复合rhBMP-2的nHAC/PLA框架材料对成骨细胞的诱导分化作用，以期对复合框架材料在骨组织工程中，特别是对骨形成过程的研究提供一些细胞生物学方面的依据。（3）壳聚糖已被证实具有良好的生物相容性，但是由于不溶于水，限制了它在生物材料领域的应用。本研究中对磷酸化的壳聚糖进行了与成骨细胞的相容性方面的研究，并验证了磷酸化壳聚糖不仅具有良好的细胞相容性，还具有良好的骨诱导性。第2章 nHAC/PLA骨组织工程框架材料的细胞相容性研究2.1 纳米羟基磷灰石/胶原/聚乳酸骨组织工程框架材料的制备在现今发展的
47、许多种骨材料中，胶原/羟基磷灰石的复合材料一直受到科学工作者们的重视。这是因为羟基磷灰石和胶原分别是天然骨材料中主要的无机和有机组分，多年的科研和医疗实践也已确立了其在骨修复领域的应用可能。关于胶原/羟基磷灰石的复合材料的制备和生物学评价的文献已有很多68，15，2630。此部分实验所用的材料主要由廖素三和崔凯同学提供。2.2 nHAC/PLA骨组织工程框架材料的细胞生物相容性实验2.2.1 背景和实验设计迄今为止，临床上对大尺寸骨缺损还没有有效的治疗手段，骨组织工程为解决这一问题提供了希望。骨组织工程的思路，简单的说就是以适宜的材料作为细胞生长的支架，经过一段时间的体外培养后再植入体内，或者以合适的材料制成载体携带骨诱导性因子植入缺损部位，通过“诱导成骨”的方式修复缺损。骨修复材料的选择及其与细胞或诱导
