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1、利用MTT法测定环磷酰胺对Hela细胞增殖的抑制效果 摘要：利用MTT法测得环磷酰胺对Hela细胞的增殖确实有较好的抑制作用，通过制片能观察到典型的凋亡细胞和凋亡小体。本实验得在所设浓度梯度内药物使用的浓度越高，其抑制效果越好。药物浓度（x）与其抑制效果（Y）间成一线性关系，其方程为Y=0.0007x+0.3591 ，其中 R2=0.9635.这将为找到合适的使用浓度提高一定的依据。关键词：MTT法 环磷酰胺 Hela细胞 抑制前言：癌症是严重危害人类健康的主要疾病之一, 攻克癌症一直是世界瞩目的研究课题.目前已经出现了多种抗癌药物，其中环磷酰胺也是一种较有效果的药物。环磷酰胺在体外无活性,但
2、在体内经肝细胞色素P-450 氧化生成中间产物醛磷酰胺(aldophosphamide) ,再在肿瘤细胞内分解出磷酰胺氮芥(phosphamide mustard) 与细胞的DNA 发生烷化作用,形成交叉联结,从而抑制肿瘤细胞的生长繁殖。然而环磷酰胺既能抑制肿瘤细胞生长与繁殖,又会影响人体正常细胞的生长和发育【1】。面对环磷酰胺抗癌药物这把双刃剑，使用时必须把握好其使用，以求以最少的危害达到最好的抗癌效果。对于同一药物，不同浓度对肿瘤的抑制效果不同，找到两者之间的关系有助于找到效果和安全之间的平衡点，将有助于推动人类的抗癌事业。本实验利用MTT法测定不同浓度环磷酰胺对Hela细胞增殖的抑制作用
3、，以期寻找出该药物的适宜使用浓度。1 材料与方法11 实验材料：环磷酰胺试剂 MTT试剂（现配现用） 靶细胞 ： 美国购入的海拉宫颈瘤细胞系（HELA 细胞），实验室传代保种待用。12实验方法：1.21. 接种：收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，使细胞浓度为23*104/ml，每孔加入细胞悬液200l，使每孔内的细胞数为4000- 6000个。1.22培养与药物处理：培养箱内培养2436h，吸出培养液加入不同浓度梯度的环磷酰胺（50、100、200、400 ug/ml）各200 l，每个浓度至少接种4孔作为重复实验.并设对照组：不加药物，只加培养液。1.23. 呈色：培养箱内继续培养到第3天，
4、于倒置显微镜下观察细胞生长情况后，每孔加5 mg/ml的MTT溶液20 l，继续孵育4 h，终止培养；快速翻转培养板，弃去孔内培养上清液；然后每孔加DMSO 150l，振荡30min，使结晶物充分融解。1.24比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。1.25计算与分析2.结果： 表一 表头内容 环磷酰胺浓度对照50ug/ml100ug/ml200ug/ml400ug/ml吸光值0.869 0.549 0.481 0.430 0.331 抑制率36.82%44.65%50.52%61.91%2.1实验效果良好，环磷酰胺对Hela细胞的增殖确实有较好的抑制作用，在M
5、TT试剂的显色作用下，用肉眼也能明显看出药物对细胞的抑制效果，且成一定梯度。在本浓度梯度内药物使用的浓度越高，其抑制效果越好（如表一和图一所示）。由本实验看出400ug/ml的环磷酰胺对Hela细胞的增殖抑制率已高达61.91%，之间的关系为以下线性方程：Y=0.0007x+0.3591 R2=0.9635.2.2实验中通过制片观察，观察到典型的凋亡细胞和凋亡小体。可见环磷酰胺能通过诱导癌细胞发生凋亡而达抗癌作用。 图一 不同浓度环磷酰胺对癌细胞的抑制3.分析讨论：3.1 本实验结果和本实验的其他组（各组所设浓度梯度不同）所得的结论基本一致，确实是随着环磷酰胺使用浓度的升高，其对癌细胞的抑制效
6、果也随之升高。所以单纯从抑制效果出发，增加其使用浓度可以达到增效的目的。但药物不仅对癌细胞增殖有抑制作用,同样对人体正常细胞也会带来不利影响.而且有研究以小鼠为对象，对环磷酰胺的毒副作用进行研究得, 大剂量组(A组)小鼠在每周期给药后1周内,即可观察到行动迟缓、反应迟钝、精神食欲较给药前差,化疗间期有所恢复;小剂量、高频率组(B、C组)小鼠给药后行动较为灵活,反应较为灵敏,精神食欲较给药前无明显变化2。因此不能一味地最求高浓度大剂量.要根据个体情况,在一定抑制效果范围内选择合适的浓度.3.2根据本次试验各组的实验效果比较,抑制率最高的是67.03%(800 ug/ml)与浓度为400 ug/m
7、l的抑制率61.91%相差不大，而且已有较好的效果，所以较推荐使用此浓度。3.3环磷酰胺能过诱导癌细胞发生凋亡,出现典型的凋亡细胞和凋亡小体。诱导癌细胞凋亡作用与直接杀伤作用造成的坏死完全不同,凋亡的细胞基本不破坏,不会释放出引起炎症的物质,癌细胞通过这种死亡方式而引入一个向恶性程度降低的归宿方向,从而达到控制癌症的效果,这也是这种药物治疗作用的机理之一2-7 。这也显示了环磷酰胺与其他抗癌药物的优势和显著效果，所以对这种机制和对环磷酰胺使用量的更深入研究也就很有必要和很有意义。3.4本实验只是体外培养，如果要真正运用，可能还需在这结果的指导下，于体内环境进行进一步实验。参考文献：1. 环磷酰
8、胺的毒副作用机制及应对措施 王新禹, 梁前进 科学进展 综述与专论2006 年第30 卷第10 期2. 李娜, 梅同华. 不同剂量环磷酰胺对肺癌裸鼠移植瘤耐药的影响，第三军医大学学报2. 汤钊猷. 现代肿瘤学. 上海:上海医科大学出版社,1993. 113.3.Martin D S , Schwartz C K. Chemotherapeutically induced DNA damage ATP depletion , and the apoptotic biochemical cascad. Oncol Res , 1997 , (1) :15.4. 迟永春,周舒,徐梅,等. 乙酸铜抗肿
9、瘤作用的流氏细胞光度计分析研究. 中日友好医院学报,1994 ,8(2) :6366.5.Chi You-chun , Zhou Shu , Xu Mei et al . Study of the effects of theChinese herbal Prescription combined with copper and the malignancy of cancer cells. Chinese J of Integrated Traditional And Western Medicine , 1996 ,2 (4) :292296.6. Korsmeyer S J . Bc1-2 gene family and the regulation of programmed cell death. Cancer Res , 1999 ,59 :16731700.7. 孔晶刘凤仪高春燕刘国玲化疗药环磷酰胺对癌细胞的细胞周期影响和诱导凋亡作用的研究刘东玉实验动物科学与管理 第22 卷第1 期 2005 年3 月8. 刘峰魏新庭王冬冬孙德志李林尉抗癌药物的研究现状 聊城大学学报(自然科学版) 第19 卷第1 期 2006 年3 月
