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1、毕 业 论 文（设计）题 目 五味子中五味子甲素和 乙素含量测定分析方法的建立 指导老师 何 丰 专业班级 生物技术及应用0701 姓 名 王 丝 丝 学 号 2010年5月30 日摘要本文建立了五味子中五味子甲素和乙素含量同时测定的方法。色谱柱为Diamonsil C18柱（2504.6mm，5m），流动相为甲醇-水-乙腈(70:23:7=V/V)，流速为1.0mLmin-1，柱温为25，检测波长为224 nm，进样量10l，分析时间为30min，峰对称性分别为0.95和0.96，且在224nm处的响应值比254nm处明显增加。该流动相可以有效分析五味子样品中五味子甲素和乙素含量，并能达到较
2、好分离效果。五味子甲素和乙素的分离度1.5，理论塔板数为4000，体系避开了缓冲盐对泵系统的影响，并且加入少量乙腈代替甲醇降低柱压。样品中五味子甲素和乙素精密度的RSD分别为1.16和1.43%，稳定性RSD分别为1.28和2.29%，重现性RSD分别为2.94和2.99%，平均加样回收率分别为100.2%和99.5%，符合我国药典对药物分析的要求。可用于后面各项试验中五味子甲素和乙素的定量和定性分析。关键词：五味子；五味子甲素；五味子乙素；分析方法目 录 引言11材料与仪器11.1材料与试剂11.2仪器设备22试验方法22.1样品溶液的检测方法22.2色谱分析条件及系统适应性试验22.3标准
3、曲线的制备22.4 精密度试验32.5 重现性试验32.6 稳定性试验32.7 加样回收率试验33结果33.1系统适应性33.2线性关系53.3精密度63.4稳定性63.5重现性73.6加样回收率84结论9参考文献10引言五味子甲素和乙素(-schizandrin)是五味子中的一类主要有效成分，具有抗氧化、抗肿瘤、护肝降酶、抑制肿瘤细胞多药耐药性的产生、对抗心肌灌注性损伤等多种生物学活性。是诸多五味子药材及其制剂质量评价中的一个通常采用的质量指标，多种含有五味子的中成药用其作为指标性成分进行质量控制。 五味子甲素和乙素的分析方法研究较成熟，最常见的方法有薄层色谱扫描法1,2,反相高效液相色谱法
4、3,4,5，高速逆流色谱法6等。五味子乙素在254nm处有最大的吸收峰，因此常采用254nm处的吸收波长进行测定。HPLC法是目前最常用的分析方法。据报道，最佳的两种样品的预处理方法是甲醇或乙醇回流法和甲醇或乙醇超声法。流动相体系采用甲醇水（酸水或盐溶液体系）7，乙腈水体系8，乙腈水甲醇体系9等。本研究采用甲醇超声处理五味子样品，甲醇乙腈水为流动相，检测波长选224nm。1材料与仪器1.1材料与试剂乙睛(色谱纯，德国Merck公司)甲醇(色谱纯，德国Merck公司)超纯水（哇哈哈）甲醇(分析纯，衙州巨化试剂有限公司)微孔滤膜(油膜，0.4um)不锈钢滤头(大连伊利特有限公司)五味子样品（北五味
5、子，购于北京同仁堂）五味子乙素对照品(117065-200707，供含量测定用，中国药品生物制品检定所提供)五味子甲素对照品（0764-200807，供含量测定用，中国药品生物制品检定所提供）1.2仪器设备电子分析天平(梅特勒托利多AL-204分析天平，称量范围0.01g-200g)戴安高效液相色谱仪；Diamonsil C18柱(250x4.6mm, 5um; Dikma)超声波清洗器(KQ-100型超声波清洗器，昆山市超声仪器厂)架盘药物天平:（马头牌BP-II型，称量范围0.5g-500g，上海医用激光仪器厂）150mL磨口具塞锥形瓶;10mL的容量瓶2试验方法2.1样品溶液的检测方法精
6、确称取0.5g五味子样品粗粉(过2号筛)加入25mL甲醇后称重，超声30min后加甲醇补重，静置30min后取上清液用0.4m的微孔滤膜油膜过滤，取第三次的滤液作为供试液待测。2.2色谱分析条件及系统适应性试验分析条件：色谱柱：Diamonsil C18柱(2504.6nm,5m)流动相：甲醇-水-乙睛(70:23:7) 流速：1.0mLmin-1 检测波长：224nm进样量10L检测时间： 30min观察供试液中五味子甲素、乙素色谱峰的对称性、分离度、响应值和理论塔板数是否符合药典规定。2.3标准曲线的制备五味子甲素乙素标准液制备：精密称取6.8mg五味子甲素、8.2mg五味子乙素加入到10
7、mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，超声溶解后于4条件下保存。分别将储备液稀释为3.4，6.8，10.2，13.6，17.0 mg100mL-1的甲素标准溶液和4.1，8.2，12.3，16.4，20.5mg100mL-1的乙素标准溶液。将标准溶液用0.4m的微孔滤膜油膜过滤后进样量ll按上述分析条件进行HPLC分析。以五味子甲素和乙素的浓度为横坐标、峰面积为纵坐标作图，得浓度与峰面积关系的工作曲线。2.4 精密度试验将配制的标准溶液和样品溶液都根据上述分析方法分别重复进样六次，计算六次所得峰面积的相对标准偏差。2.5 重现性试验0.5g五味子粉加25mL的甲醇后称重，超声30min后称重加甲醇补
8、重，静置30min后取上清液用0.4m的微孔滤膜油膜过滤，取第三次的滤液作为供试液待测。在相同条件下制备6个样品溶液，计算6个供试液五味子甲素和乙素峰面积的相对标准偏差验证供试液的批次差异是否在可信范围。2.6 稳定性试验将标准溶液和供试品溶液分别隔2h， 4h， 6h，8h， 10h， 12h ，24h进样，根据上述分析方法进行分析，计算各自在24小时内峰面积的相对标准偏差。2.7 加样回收率试验在已知浓度的五味子提取液样品中加入和提取样液含量相近的五味子甲素和乙素，根据上述方法测定五味子甲素和乙素的含量，根据测定结果，计算出加样回收率。3结果3.1系统适应性流动相配比为(70:23:7，V
9、/V)的甲醇-水-乙腈时可达到较好的分离效果，分离度1.5，理论塔板数为4000，峰对称性分别为0.95、0.96，在224nm的峰面积是 254nm处峰面积的3.5倍。该分析方法明显提高了五味子甲素和乙素的响应值，并且能够避开各炮制品或生品供试液中其它物质对五味子甲素和乙素检测的干扰。理论塔板数、峰对称性以及分离度均可达到我国药典对药物分析的要求。标准品和供试品有代表性的色谱图见图3.1、3.2。五味子甲素标准品五味子乙素标准品图3.1 标准品色谱图 五味子乙素样品五味子甲素样品图3.2 供试品色谱图3.2线性关系以五味子甲素和乙素的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标作图，得出五味子甲素和乙素峰
10、面积与浓度的线性关系见图3.3、3.4。五味子甲素标准溶液的线性方程Y=8.0441X-0.35，R2=0.9999，结果表明五味子甲素含量在0.034到 0.170mgmL-1范围内与峰面积有良好的线性关系，见图3.3；五味子乙素标准溶液的线性方程Y=3.3244X+0.03，R2=0.9994，结果表明五味子乙素含量在0.041到 0.205mgmL-1范围内与峰面积有良好的线性关系，见图3.4。 图3.3 五味子甲素的标准曲线 图 3.4 五味子乙素的标准曲线3.3精密度表3.2 标准溶液五味子乙素的精密度峰面积平均值RSD51.651.61.2050.852.351.451.352.4
11、表3.1 标准溶液五味子甲素精密度峰面积平均值RSD60.861.41.1861.262.162.560.960.86个五味子甲素标准溶液、乙素标准溶液和样品溶液的RSD分别为1.18%和 1.20%，样品溶液的RSD分别为1.16%和 1.43%，分析仪器的分析误差在可信范围内。具体数据见表3.1、3.2和3.3、3.4。表3.4 样品溶液五味子乙素的精密度峰面积平均值RSD25.825.81.4325.326.026.225.526.2表3.3 样品溶液五味子甲素精密度峰面积平均值RSD30.830.91.1630.631.231.330.531.33.4稳定性结果显示标液中的五味子甲素、
12、乙素和供试液中的五味子甲素、乙素在24小时内有较好稳定性。五味子甲素标液、乙素标液在24小时内测定值RSD分别为0.72%和0.65%；供试液五味子甲素和乙素在24小时内测定值RSD分别为1.28%和2.29%。标液和样液的稳定性数据见表3.5、3.6、3.7和3.8.时间(h)峰面积平均值RSD252.251.80.65451.7652.1851.51051.31251.82452.1时间(h)峰面积平均值RSD261.561.10.72461.8660.9860.51061.21260.82461.3表3.5 标准溶液五味子甲素的稳定性 表3.6 标准溶液五味子乙素的稳定性表3.7 样品溶
13、液中五味子甲素的稳定性 表3.8 样品溶液中五味子乙素的稳定性时间(h)峰面积平均值RSD230.531.11.28431.4630.9831.21030.61231.42431.5时间(h)峰面积平均值RSD225.226.02.29425.8626.1826.61025.41226.82426.33.5重现性在相同条件下制备的6个五味子样品中五味子甲素和五味子乙素的含量差别不大，甲素和乙素的6个数据的RSD值分别为2.94%和2.99%，样品的重现性数据见表3.9、3.10。表3.9 样品制备中的五味子甲素重现性数据样品五味子甲素含量（mg/g）平均值RSD样品11.311.292.94样
14、品21.27样品31.36样品41.28样品51.25样品61.28表3.10 样品制备中的五味子乙素重现性数据样品五味子乙素含量（mg/g）平均值RSD样品11.851.872.99样品21.92样品31.88样品41.94样品51.79样品61.833.6加样回收率五味子炮制品样液中五味子甲素和五味子乙素的平均加样回收率分别为100.2和99.5%，RSD分别为3.68%和1.90%，平均加样回收率在95105之间，符合药典常用的分析标准。五味子甲素和五味子乙素的加样回收率数据如表3.11和3.12。表 3.11 五味子甲素加样回收率数据样品检测到量(mg)加入量(mg)加样回收率(%)平
15、均值(%)RSD10.2490.25697.2100.23.6820.2680.256104.630.2480.25696.940.2620.256102.350.2470.25696.560.2650.256103.5表 3.12 五味子乙素加样回收率数据样品检测到量(mg)加入量(mg)加样回收率(%)平均值(%)RSD10.3730.365102.299.51.9020.3600.36598.630.3680.365100.840.3540.36597.050.3580.36598.160.3630.36599.54结论 采用如下的分析条件：色谱柱为Diamonsil C18柱（2504
16、.6mm，5m），流动相为甲醇-水-乙腈(70:23:7=V/V)，流速为1.0mLmin-1，柱温为25，检测波长为224 nm，进样量10L，分析时间为30min，峰对称性分别为0.95和0.96，且在224nm处的响应值比254nm处明显增加。该流动相可以有效分析五味子样品中五味子甲素和乙素含量，并能达到较好分离效果。五味子甲素和乙素的分离度1.5，理论塔板数为4000，体系避开了缓冲盐对泵系统的影响，并且加入少量乙腈代替甲醇降低柱压。样品中五味子甲素和乙素精密度的RSD分别为1.16和1.43%，稳定性RSD分别为1.28和2.29%，重现性RSD分别为2.94和2.99%，平均加样回
17、收率分别为100.2%和99.5%，符合我国药典对药物分析的要求。可用于后面各项试验中五味子甲素和乙素的定量和定性分析。参考文献 1 赵恒, 徐景仁. 北五味子及其制剂三苓丹胶囊中五味子乙素的薄层光密度法测定J. 药物分析杂志. 1995, 15 (1): 33-35.2 王胜春, 贺雪梅, 樊亚萱. 薄层扫描法测定五灵胶囊中五味子乙素的含量J. 第四军医大学学报. 1998, (4): 478-479. 3 黄萍, 王体强. HPLC法测定护肝颗粒剂中五味子乙素含量的探讨J. 重庆医科大学学报.2002, 27 (2): 167-170.4 谭生建, 屈雪莲. 肝复康丸中五味子甲素和五味子乙
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