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1、 职业技术院毕 业 设 计（论文） 题目 单克隆抗体的合成 姓 名 所在系部 专业班级 指导教师 2010 年 4 月摘 要单克隆抗体技术是现代生命科学研究的重要工具,在基因和蛋白质的结构和功能研究方面有着不可或缺的作用。近年来,随着分子生物学技术的发展,出现了嵌合单克隆抗体和由转基因小鼠、噬菌体展示技术、核糖体展示技术及共价展示技术所产生的单克隆抗体。这些技术将有效解决单克隆抗体的鼠源性等问题。本文主要讲述制备单抗的实验过程，并对实验结果及其影响因素进行分析。关键词：抗体，单克隆，肿瘤，细胞融合，淋巴细胞AbstractThe monoclonal antibody technology i
2、s the modern life sciences research important tool, has the indispensable function in the gene and the protein structure and the function research aspect. In recent years, along with the molecular biology technologys development, presented the embedment monoclonal antibody and by the transgene mouse
3、, the bacteriophage demonstrated that the technology, the ribosome demonstrated the technology and the covalence demonstrated the technology produces monoclonal antibody. These technologies effective addressing monoclonal antibody questions and so on mouse source. This article mainly prepares Shan K
4、ang the new technology to the above several kinds to make a summary and analysis of factors.Keywords:antibodi,monoclonal, neoplasms,cell fusion,lymphocyte目 录1.前言. . 41.1国外现代生物技术产业发展的现状. 41.2我国现代生物技术医药产业发展的现状. 42.文献综述. 52.1单克隆抗体的概念.52.2单克隆抗体的主要特点. 52.3单克隆抗体的应用.53.实验方法.93.1材料和方法.93.1.1材料.93.1.2方法.94.结
5、果与讨论.104.1各次细胞融合结果差别.104.2巨噬细胞在培养杂交瘤细胞株的作用104.3加入巨噬细胞的用量和时间114.4不同源的巨噬细胞124.5细胞加入的量134.6骨团瘤细胞株的比较134.7融合剂的比较144.8细胞融合温度的比较154.9各种营养液的比较164.10细胞换液的方案174.11微量培养174.12无血清培养液185.结论196.参考文献. 207.致谢. .211.前言现代生物技术制药工业始于1971年，现已创造出35个重要治疗药物，全球大约有2500多家公司，主要产品有重组蛋白质药品、重组疫苗和诊断、治疗用的单克隆机体三大类。我国自80年代在采用现代生物技术改造
6、传统生物技术制药产业方面已取得初步成果。但我国生物技术诊断试剂、酶工程、动植物细胞工程医药产品、现代生物技术支撑技术、后处理技术和制剂技术等方面与国外还存在差距。1.1国外现代生物技术产业发展的现状自1971年Cetus公司成立至今，现代生物技术制药工业已走完了二十五年的路程，创造出35个重要的治疗药物，目前已在治疗癌症、多发性硬化症、贫血、发育不良，糖尿病、肝炎、心力衰竭、血友病、囊性纤维变性和一些罕见的遗传性疾病中取得良好效果。在医药工业中，传统生物技术（包括近代生物技术）已为人类提供了许多重要药品，在保障人类生命健康和推动社会进步中发挥了巨大作用；现代生物技术以其特有的高新技术又为人类提
7、供了传统生物技术难以获得的极微量的珍贵药品。由于这一系列现代生物技术新型药物的出现，使过去无法治疗的疑难疾病得到了治疗。同时，应用现代生物技术DNA重组，细胞融合以及细胞大规模培养等现代生物技术发展和提高传统生物技术的生产水平，为抗生素、氨基酸、维生素以及基体激素等药品的生产，构建了高产新菌株，创造新工艺，提高生产能力，降低生产成本，促进生产发展。1.2我国现代生物技术医药产业发展的现状现代生物技术医药产业化进程：我国自80年代开始进行现代生物技术药品的研究和开发，虽然起步较晚，基础较差，但一开始就受到党和国家的高度重视，并列为“863”计划和国家重点攻关项目的主要内容，经过十多年的努力，特别
8、是近五年来，现代生物技术医药产业有了突破性的进展，到1998年7月底我国已有十四种现代生物技术药品和疫苗投入生产，据初步统计，1997年的工业总产值约20亿（包括采用现代生物技术改造传统生物技术后新增加的产值在内）。目前我国己有近200多个现代生物技术制药企业，其中约30家生产企业已具有不同规模的生产能力，陆续投入生产。因此，可以说我国现代生物技术制药产业化已经开始。本文主要介绍了单克隆抗体的制备过程及应用。2.文献综述2.1单克隆抗体的概念抗体是由B淋巴细胞分化形成的浆细胞合成、分泌的。每一个B淋巴细胞在成熟的过程中通过随机重排只产生识别一个抗原的抗原受体基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴
9、细胞系，重排后具有不同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。2.2单克隆抗体的主要特点1)由于来于单克隆细胞，所分泌的抗体分子在结构上高度均一，甚至在氨基酸序列及空间构型上均相同；2）由于抗体识别的是抗体分子上单一抗原位区，且所有抗体分子均相同，由此
10、，单克隆抗体具有高度特异性；3）产生该抗体的为一无性细胞系，且可长期传代并保存，为此可持续稳定的生产同一性质的抗体。2.3单克隆抗体的应用作为亲合层析的配体:单克隆抗体能与其相应的抗原特异性结合，因而能够从复杂系统中识别出单个成分。只要得到针对某一成分的单克隆抗体，利用它作为配体，固定在层析柱上，通过亲合层析，即可从复杂的混和物中分离、纯化这一特定成分。如用抗人绒毛膜促性腺激素(hCG)亲合层析柱，就可从孕妇尿中提取到纯的hCG。与其它提取方法(沉淀法、高效疏水色谱法等)相比，具有简便、快速、经济、产品活性高等优点。 作为生物治疗的导向武器:脂质体是由既亲水又亲油的两亲磷脂组成的连续双分子层微
11、囊，内含水相空间，可包裹水溶性物质。包有细胞毒剂的脂质体膜上偶联抗体，可定向攻击靶细胞，称为免疫脂质体。这种“导向治疗”，在动物试验与体外试验中已获得满意效果。如热敏免疫脂质体，由抗人乳癌细胞抗体经疏水长链脂肪酸修饰，抗体带上长的疏水碳链，部分插入脂质体的脂双层膜中，抗体Fab段仍暴露在膜表面，因而保持了抗体活性。热敏免疫脂质体可特异识别靶细胞(人乳癌细胞)，并通过相变温度引起脂质体破裂，从而定向释放药物。另外，可将化疗药物、细菌毒素、植物毒素或放射性同位素等细胞毒剂与抗肿瘤抗原的单克隆抗体直接交联，利用其导向作用，使细胞毒剂定位于肿瘤细胞把它直接杀伤。这不仅提高了抗体的疗效，也可降低细胞毒剂
12、对正常细胞的毒性反应。如应用抗T细胞单抗和柔红霉素结合物，在体外对非T淋巴细胞就无杀伤作用。但是，要把这种方法应用于临床，目前还存在不少技术难关，包括人体对鼠源单抗的排异问题等。 作为免疫抑制剂:抗人T淋巴细胞单抗(McAb)作为一种新型免疫抑制剂，已广泛应用于临床治疗自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反应。其作用机理有赖于McAb的种类及其免疫学特性。注射抗小鼠Thy-1抗原的单抗，可以抑制小鼠同种皮肤移植的排斥反应。此外，对用于同种骨髓移植的供体骨髓，在体外经抗T细胞单抗加补体处理，能减轻移植物抗宿主病的发生。 作为研究工作中的探针:单克隆抗体只与抗原分子上某一个表位(即抗原决定簇)相结合，利
13、用这一特性就可把它作为研究工作中的探针。此时，可以从分子、细胞和器官的不同水平上，研究抗原物质的结构与功能的关系，进而并可从理论上阐明其机理。如用荧光物质标记单抗作为探针，能方便地确定与其结合的相应生物大分子(蛋白质、核酸、酶等)在细胞中的位置和分布。 增强抗原的免疫原性:抗体对抗原免疫原性的增强作用由来已久，60年代就已发现幼猪对破伤风类毒素难以产生抗体，注射相应特异性抗体IgG，就能有效地提高对委内瑞拉马脑炎病毒的免疫应答。1984年以来，Celis等发现，抗乙肝病毒(HBs)IgG可增强HBs抗原对特异性人T细胞克隆的刺激增殖，并可诱生干扰素。在小鼠中发现，当低剂量的HBs抗原不产生免疫
14、反应时，加入抗HBs抗体组成的复合物，则可有效地诱生免疫反应。根据这一作用，现已研制出乙肝的抗原抗体复合物型治疗性疫苗。 作为医学检验试剂:单克隆抗体作为医学检验试剂，更能充分发挥其优势。单克隆抗体的特异性强，大大提高了抗原抗体反应的特异性，减少了和其它物质发生交叉反应的可能性，使试验结果可信度更大。单抗的均一性和生物活性的单一性，使抗原抗体区应结果便于控制，利于标准化和规范化。目前已有许多检验试剂盒用单抗制成，其主要用途如下： (1)诊断各类病原体 这是单抗应用最多的领域，已有大量诊断试剂商品供选择。如用于诊断乙肝病毒、丙肝病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒和各种微生物、寄生虫感染的试剂等
15、。单抗所具有的灵敏度高、特异性好的特点，使其在鉴别菌种的型及亚型、病毒变异株，以及寄生虫不同生活周期的抗原性等方面更具独特优势。 (2)肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原的检测 用于肿瘤的诊断、分型及定位。尽管目前尚未制备出肿瘤特异性抗原的单抗，但对肿瘤相关抗原(如甲胎蛋白、肿瘤碱性蛋白和癌胚抗原)的单抗早就用于临床检验。 随着淋巴细胞杂交瘤技术的应用，许多抗人肿瘤标记物的杂交瘤细胞株已经建立，这为肿瘤的早期诊断及其阐明肿瘤的发生、发展，了解肿瘤细胞的生物学活性及其定量研究奠定了基础。用抗肿瘤单抗检查病理标本，可协助确定转移肿瘤的原发部位。以放射性核素标记单抗可用于体内诊断，再结合X-线断层扫描技术
16、，可对肿瘤的大小及其转移灶作出定量诊断。 (3)检测淋巴细胞表面标志 用于区分细胞亚群和细胞的分化阶段。例如检测CD系列标志，有利于了解细胞的分化和T细胞亚群的数量和质量变化，这对多种疾病诊断具有参考意义。细胞表面抗原的检测，将对白血病患者的疾病分期、治疗效果、预后判断等方面有指导作用。组织相容性抗原检测是移植免疫学的重要内容，应用单抗对其进行位点检测可得到更可信的结果。 (4)机体微量成分的测定 应用单抗结合其它技术，可对机体的多种微量成分进行测定。如放射免疫分析，即是利用了同位素的灵敏性和抗原-抗体反应的特异性而建立起来的方法，它可以测至10-910-12g，使原来难以测定的激素能够进行定
17、量分析。除了激素，还可检测诸多酶类、维生素、药物和其它生化物质。这对受检者健康状态判断、疾病检出、指导诊断和临床治疗均具有实际意义。 3实验方法3.1材料和方法：3.1.1材料a盐溶液：将NaCl8克，KClO4克，Na2HPO42H2O1.77克， NaH2P04H 2O069克，葡萄糖2克，酚红0.001克，溶于1000ml双蒸水中，pH7.2。高压115，15分钟，保存于室温。标准培养液；RPMI1640，DMEM或者Iscoves培养液，加入10灭活血清(马血清、小牛血清或胎牛血清)，贮存于4。在使用前加入2100谷酰胺，1100丙酮酸钠，1100 抗菌素(青霉素和链霉素各10000单
18、位m1)，0.050.1M硫乙二醇。所有培养液均需于两天内用完。选择性培养液：即所谓HAT培养液，100 HAT培养液，100H：Hypoxanthine次黄嘌呤为10mM，必须在45溶解完全。100A：Aminopterine氨基喋呤为0.04mM必须在45溶解于稀释NaOH溶液中，然后再用HCI中和。I00T；Thymidime胸腺嘧啶，1.6mM，在室温中溶解。然后各溶液分别除菌过滤，分装5m1一支，-20保存。HAT和HT的营养液都必须在应用前配制，方法把100贮存液按1加入营养液即成。细胞冻存液：为9份营养浓加入l份DMSO二甲基亚砜，混匀。此时细胞株必须生长良好1。b、骨髓瘤细胞株
19、BALBc小鼠骨髓瘤细胞株，经过克隆纯化P363Ag8(简称63) 和其衍生株SP20，SP20不产生球蛋白，此两株细胞均为本研究所Dr、G、Kohler所培育，这些细胞株都适应于各种标准培养液以及2.5cm2和7.5cm2的塑料培养瓶，分别装入4ml或12ml营养液，通入气体为10CO 2、7O2和83N2，37恒温培养。3.1.2.方法a、小鼠免疫成年BALBc小鼠各种性别均可，用流感病毒1000个血凝单位腹腔注射，作为首次免疫。7一12周后，再给200血凝单位病毒腹腔注射，作为加强免疫。在加强免疫后45天，即可进行细胞融合，处死小鼠、无菌取脾，把脾细胞轻轻压入10m1的盐溶液中，然后把细
20、胞悬浮液转入15ml离心管中，毛细管吹打，然后至室温中10分钟，让其自然下沉，吸出大约9ml上清液，不要搅动底下的沉淀块，然后用TURK溶液作白细胞计数。b、腹腔内巨噬细胞的采取把成年BALBc小鼠处死，剥开腹部皮肤，用45ml的标准培养液或0.34M(11.6)的蔗糖溶液注入腹腔，用18号针头从耻骨联合处，直接插入，把针头朝向肝右叶上方，然后轻轻按摩腹部，再行吸出腹腔液体。每鼠可得1.53105的巨噬细胞 (m)，这些细胞可收集于塑料管中，用任何一种标准培养液洗细胞，并于30分钟内用完。c、大孔培养24孔培养板，每孔可容2m1培养液，培养于37，含7%CO2/DA大气恒温箱中。湿度为8595
21、。换营养液时，分别以无菌巴氏吸管联接于吸引装置上，吸出大约lml的血营养液，然后用一个小口的25m1吸管，分别加入预热的新鲜营养液。如果细胞长得很密，可以用2ml吸管吸出培养液，转种于小瓶中，一般1.5ml细胞悬浮液可接种252的小瓶，当小瓶中细胞长至单层时，即可转种至75cm2的瓶中。以后即可按转种骨髓瘤细胞的方法，维持杂交瘤细胞。d、微量培养法平底的微量培养板每孔可容纳0.25mI的培养液，细胞培养条件与24孔培养板相同。当细胞长待很密时，第一步可转入24孔培养板的二个孔中，加入1m1培养液，然后按24孔培养板处理。4.结果与讨论通过体内单克隆抗体培养的到以下结果，下面是对细胞融合的实验结
22、果进行的分析，并对实验数据进行讨论。4.1细胞融合结果的差别用5107的BALBc小鼠脾细胞与5106骨髓瘤细胞进行融合，方法按Kohler和Milstein（1975，1976)的方法，每批细胞融合物分装到24个培养孔，培养28天，记录活细胞每孔多余104者为阳性，结果如表1所示。表1 各次细胞融合结果的差别实验 脾号 阳性孔数 1 1 324 2 024 3 024 4 23 242 5 224 6 823 7 24 24 8 24243 9 024024 10 024024 11 18242124 12 124024表1中融合的结果波动很大，结果理想时，所有的培养孔可以都是阳性，而不理想
23、时则为0，而唯一确实可靠的结论是：只有在巨噬细胞活跃的培养孔中，才能得到抗体阳性的杂交瘤细胞克隆。这些培养孔看起来十分清亮，在最初培养的第一周内，很少细胞碎片，而且这些巨噬细胞一直可存活到实验的结束。但巨噬细胞的存在并不是唯一的因素，在实验4、7、8和11中应用了每个培养孔加入1104的巨噬细胞，获得理想结果，而相同地在实验3，12中也应用1104巨噬细胞，结果却不理想。4.2巨噬细胞在培养杂交瘤细胞株的作用接下去一个实验，除了在实验的当天给每个培养孔加入2104的巨噬细胞外，其他方面都按Kohler和Milstein的方案进行，结果见表2细胞融合物的准备，接种和判定都按表1方法进行、本实验按
24、表2所列于实验当天加入巨噬细胞。表2 巨噬细胞对杂交细胞的作用实验 脾号 阳性孔数 不加巨噬细胞 加巨噬细胞 2 5 224 2424 6 823 2124 7 2424 2424 8 2424 24244 9 024024 232410 024024 242411 18242124 222412 124024 2424由表2可得，巨噬细胞的效果十分明显，表现在相同的脾脏9和10，不加巨噬细胞，没有杂交单克隆细胞，加入巨噬细胞，结果大大增加。再如脾5，脾6、脾12未加巨噬细胞时只有极少数杂交细胞克隆生长，而加入后几乎是90100都产生了杂交细胞的克隆。另外，在这个实验中，虽然脾12的细胞融合物
25、在对照组中已加过了104巨噬细胞 (参阅表1)但其效果并不理想，而当第二次加入另一个小鼠的巨噬细胞时，获得理想结果，说明前面的巨噬细胞是无效果的，为了避免遇上无效的巨噬细胞影响结果，应该合并34只小鼠的腹腔洗出的巨噬细胞，作为喂养细胞。4.3加入巨噬细胞的用量和时间可以将投入实验的脾细胞的量减少10倍，其他方法则按照K6hler和M11stein(1975，1976)的方法进行。不同剂量的巨噬细胞和不同时期加入的实验结果见表3。表3 影响巨噬细胞的有关因素加入日期 每孔加入巨噬细胞量 阳性孔数 0 103 3103 104 3104 105 -1 0 0 0 23 18 21 620 0 0
26、3 17 15 17 521 0 1 7 21 20 16 652 0 0 2 1Ca 6 11 354 0 0 4 7 10 6 277 0 1 0 4 11 8 24合计 0 2 16 88 80 79 -表3说明按照Kohler和Milstein (1975、1976)的方法，取一只BALBc小鼠脾细胞5106和骨留瘤细胞5108进行融合。融合当天称为“0”天，每天收集小鼠腹腔巨噬细胞，并按各需要量加入培养孔，培养28天后，计算24个培养孔中，活细胞多于104的阳性孔2。4.4不同源的巨噬细胞巨噬细胞来源于何种品系的动物并不重要，来自不同种动物的腹腔洗液，或者杂交动物的小鼠、甚至大鼠或豚
27、鼠的巨噬细胞都可促使杂交瘤细胞生长，结果如表4表4 用不同动物巨噬细胞作为喂养细胞的比较动物来源 每个培养孔加入巨噬细胞数 总阳性数 3103 104 3104 105小鼠BALB/c 5 21 17 20 63小鼠C57BL/6 2 11 17 19 49小鼠C3H 0 15 23 21 59小鼠Outbred(杂种)7 21 20 12 60大鼠Rat 1 4 21 21 47豚鼠Guinea pig 0 9 19 17 45巨噬细胞来自各种动物如表4所列，每种动物各取了3只进行脸皮灌洗，合并其巨噬细胞在细胞融合前一天接种于各培养孔，第25天时计数24个培养孔的阳性数、(活细胞多于104者
28、为阳性。)另外，还试验了已经建株的巨噬细胞系和在实验室中长期传代的巨噬细胞株，这些细胞都来自BALBc小鼠。4.5细胞加入的量脾细胞参加细胞融合的用量，通过脾细胞限量试验可以得到结果，结果见表5。表5 限量脾细胞杂交试验实验 参加融合的脾细胞数 106 2106 4106 1 3 7 9 4 6 142 2 5 12 0 6 10由表5可知4106的脾细胞结果较好，细胞融合数较多。取BALBc小鼠牌细胞，分别用下表所列的脾细胞量与5106x 63骨朗瘤细胞融合，接种于24孔培养板中，细胞融合的前一天，每孔接种2104腹腔巨噬细胞。培养24天后，每孔活细胞数多于104者为阳性孔。4.6骨髓瘤细胞
29、株的比较细胞融合时脾细胞和骨髓瘤细胞数如表6所列，接种于24孔塑料板，每孔并含2104巨噬细胞，第28天记录活细胞数大于104者为阳性。表6 骨髓瘤细胞株的比较骨髓瘤细胞 参加融合的脾细胞数 总阳性孔数 106 3106 107 X63 3106 2 7 24 33107 3 12 24 393107 3 10 24 37Sp2/0 3108 0 0 1 1107 0 2 4 63107 1 10 24 35表6说明，选择合适的骨髓瘤细胞株，产生克隆的几率较高，但不是都产生同一种抗体的。用骨髓瘤细胞x 63作为细胞融合的亲代细胞，后来产生的存活的杂交细胞抹，实际上都带有亲代骨髓细胞瘤细胞基因密
30、码，因而各杂交细胞株产生的抗体（针对免疫原的)，都是球蛋白分子的混合物，上面带有一个片段，就是所需要的链的结合物。4.7融合剂的比较在细胞杂交时用同一种骨髓瘤细胞和同一种小鼠脾细胞，但PEG作用后的杂交细胞存活数比经仙台病毒作用的存活数要少，所以我们选用不同厂牌和分子量的PEG作细胞融合试验，表上所列数据，为培养23天后，计数24孔培养孔中的阳性孔，结果如表7所示。表7 PEG聚乙二醇比较表产品来源 细胞融合方法 总阳性孔数 BDH200 0 0 1 1Merck200 0 1 2 3Serva200 0 0 0 0Baker1000 0 2 1 3BDH1000 0 1 3 4Koch-Li
31、ght1000 5 3 7 15Merch1000 GK 12 14 11 37Serva1000 5 9 3 17Merck20000 10 7 11 28由表7说明，所有低分子的PEG结果都差，其中有些是明显有毒性反应。但分子量太大阳性数也会有所下降，因为它们过份地粘稠，甚至加热至45时，也会粘在管壁上，但当高压时加入等量的盐水则较为稳定。4.8细胞融合温度的比较脾细胞和骨髓瘤细胞在应用前都泡在水浴中，洗细胞时也都用低温离心机 (2)。偶尔有一次制备细胞时没有进行冷处理，而洗脾细胞时离心沉淀也在室温进行，得到较多的杂交细胞株，这样重复试验，室温比常规的4和0往往结果好，见表8。表8 温度对
32、细胞融合的影响实验 0-4 20 106 5106 106 510 6 1 1/24 8/24 4/24 21/242 5/24 27/48 15/48 46/483 3/24 15/24 5/24 22/244 4/24 14/24 6/24 24/24总阳性孔数 13 64 30 113脾细胞数如表8所列，分别与5106FO细胞融合，融合温度有0一4和20，在培养2l天时，活细胞数多于104为阳性。4.9各种营养液的比较各种营养液与血清的比较分成几个实验进行，列于表9。表9 各种营养液的比较参加细胞 DMEM10%血清 RPMI10%血清 Iscoves10%血清骨髓瘤细胞 脾细胞 马 牛
33、 胎牛 马 牛 胎牛 马 牛 胎牛X63（510 6）10 6 3 0 1 3 1 2 5 4 4 510 6 21 15 1 23 12 14 20 12 17Sp2/0 (2107)10 6 0 1 0 0 0 2 1 0 1 510 6 10 12 11 11 10 14 12 14 17FO(510 6) 10 6 2 5 4 3 3 2 4 2 5 510 6 17 21 20 18 15 17 17 20 21脾细胞(三只小鼠脾细胞混合物)和骨髓瘤细胞的用量如表9所列，接种于24孔培养板，每孔并含有3104的巨噬细胞，第23天确定阳性培养孔数，本实验包括三个内容：脾细胞的用量，RP
34、MI培养液和I scove s培养瓶三种血清的比较。由表9可知：DMEM、RPMI、Iscove s三种营养液都可得到较多的杂交细胞株，而对Iscove s营养液比其他培养液要更好些。x 63的融合物在培养液中若用10马血清虽然可以，但并不是常常都很理想。为了避免以后需要克隆限制杂交细胞的数量，我们常规应用Iscove s培养液，也选用RPMI1840，因为它的缓冲能力较强，不完全依赖于合适的气体环境。4.10细胞换液的方案表10 不同细胞换液方案比较实验 换液方案 下列各天出现的阳性孔数 总阳性数 4 6 8 10 12 14 16 20 24 281 0 0 2 4 5 5 5 6 6 0 0
