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1、Na+H+交换体1反义基因磁性纳米微粒对SGC7901胃癌细胞形态学文章来源 毕业论文网 毕业论文 作者：刘海峰 陈刚 滕小春 汪兴伟 【摘要】 目的 探讨Na+H+交换体1(Na+H+ exchanger 1,NHE1)反义基因磁性纳米微粒对SGC7901胃癌细胞形态学的影响。方法 构建NHE1反义基因真核表达载体和NHE1反义基因磁性纳米微粒，将NHE1反义基因转染至SGC7901胃癌细胞中，从光镜、电镜水平观察转染与未转染细胞形态学的变化。结果
2、 氧化铁磁性纳米颗粒成功地将NHE1反义基因转染至SGC7901胃癌细胞中。与亲本细胞相比， 光镜下NHE1反义基因转染的SGC7901胃癌细胞胞体增大，胞质丰富，核大小相对1致，核质比和核分裂象减少，异型性减少。透射电镜下细胞线粒体数量增多、体积增大，并可见髓鞘样变，粗面内质网、高尔基体较发达，内质网扩张，核偏向1侧，极性增强。结论 NHE1反义基因磁性纳米微粒能使SGC7901胃癌细胞发生形态学及超微结构的变化，有促进SGC7901胃癌细胞分化的作用。 【关键词】 Na+H+交换体1； 磁性纳米微粒； 反义基因治疗； 胃肿瘤 &nb
3、sp; 【Abstract】 Objective To study the effects of Na+H+ exchanger 1 (NHE1) antisense gene magnetic nanoparticies on the morphology of SCG7901 gastric caner cells.Methods Antisense NHE1 eukaryotic expression on vector pcDNA3.1 was constructed with recombinant DNA technique and
4、transfected into SGC7901 gastric carcinoma cells by DCIONP. The dextran coated iron oxide nanoparticles (DCIONP) was synthesized with deposition. Then, NHE1 antisense gene magnetic nanoparticles were constructed. We examined the morphological changes of the transfected and untransfected cells under
5、light and electron microscopes.Results DCIONP successfully transfected NHE1 antisense gene into SGC7901 gastric cancer cells. Under the light microscope, we found that transfected SGC7901 gastric cancer cells with NHE1 antisense gene were larger with abundant cytoplasm and comparatively same s
6、ize of nuclei, and the ratio of nuclei to cytoplasm, mitotic count and heteromorphism decreased when they were compared with their parent cells. The electron microscope showed increased number of mitochondrion and size of the transfected SGC7901 gastric cancer cells with NHE1 antisense gene, expande
7、d Golgi apparatus, rough endoplasmic reticulum and endoplasmic reticulum and strengthened heteropolarity. Conclusion The morphology and microstructure of SGC7901 gastric carcinoma cells change after the transfection of antisense NHE1 gene that can promote the differentiation of SGC7901 g
8、astric carcinoma cells. 【Key words】 Na+H+ exchanger 1; Magnetic nanoparticles; Antisense gene therapy; Gastric cancer 传统的基因治疗方法大都缺乏靶向性，严重阻碍了基因治疗研究的快速发展。开发新的基因载体是增强基因治疗靶向性的关键问题。纳米技术的发展， 为解决基因转移载体问题提供了新的思路。体积微小、具有超顺磁性的氧化铁磁性纳米颗粒，有望成为理想的基因载体材料。
9、胞膜离子交换蛋白Na+H+交换体1(Na+H+ exchanger 1,NHE1)是维持细胞内pH值在中性或偏碱性的重要膜蛋白，与胃癌的发生、发展有密切关系；NHE1 mRNA及其蛋白在胃癌中的表达程度显著高于胃癌前病变，NHE1基因可能是治疗胃癌的1个理想靶点1。为探讨纳米技术体内靶向基因治疗胃癌的可行性，我们前期成功构建了同时具有生物功能、磁性靶向功能和基因治疗功能的NHE1反义基因磁性纳米微粒。本研究使用NHE1反义基因磁性纳米微粒体外转染SGC7901胃癌细胞，观察基因转染对胃癌细胞形态学的影响。 1 材料与方法 &
10、nbsp; 1.1 材料 人NHE1 cDNA 的PEAP克隆载体由Jossete. Noel博士(Montreaty University，Canada)惠赠；真核表达载体pcDNA3.1(-)/Zeo、Zeocin为Invitrogen公司产品；绿色荧光蛋白报告基因pEGFPN3质粒为Clonetech公司产品；PCR分子量标准物、小牛血清、胰酶、EDTA均为华美生物公司产品；转染用脂质体DOTAP为Roche公司产品；质粒提取试剂盒为Promega公司产品。1640培养基、低糖DMEM培养基购自GIBCO生物公司；葡聚糖T10与多聚赖氨酸均
11、购自Sigma公司；超滤离心管Centriplus YM10购自华美公司；其他试剂均为国产分析纯。 1.2 方法 1.2.1 NHE1反义基因真核表达质粒的构建及鉴定：参照文献2。 1.2.2 氧化铁磁性纳米颗粒(DCIONP)和NHE1反义基因磁性纳米微粒的构建及鉴定：参照文献3。 1.2.3 细胞培养：SGC7901胃癌细胞在10%小牛血清、100 mg/L链霉素、100 U/ml的RPMI1640培
12、养基中，培养条件为37 、5% CO2、饱和湿度，每隔23 d用0.25%胰酶、 0.02% EDTA消化， 传代培养。 1.2.4 pEGFPN3质粒的转染：(1)待细胞长至对数生长期，于转染前1 d换液，转染前2 h换无血清培养基。(2)称取制成的DCIONP 1 mg，加入1 ml TE缓冲液(pH=8)中，超声振荡(200 W，3 min)。(3)加入4 ml多聚赖氨酸(浓度为0.1 g/L)充分混匀，室温静置15 min，制成多聚赖氨酸修饰的外包葡聚糖氧化铁纳米颗粒(pllDCIONP)。(4)将pllDCIONP与pEGFPN3质粒分
13、别按11、51、101质量比混合，其中pEGFPN3质粒质量均为2.5 g，4 静置1.5 h。(5)脂质体转染复合物的制备：2.5 g质粒DNA溶于优化转化液中，终体积25 l；15 l脂质体溶于优化转化液中，终体积35 l；两者混匀，室温下1015 min。(6)移去培养基，加入2 ml无血清培养基； 分别加入脂质体转染复合物和pllDCIONP转染复合物，混匀，培养6 h。(7)换有血清培养基，培养48 h。(8)荧光显微镜观察EGFP基因在细胞中的瞬时表达。 1.2.5 NHE1反义重组质粒及空载体的转染：(1)(3)同1.2.4。(4)
14、分别将pllDCIONP与NHE1反义重组质粒和空载体(pcDNA3.1Zeo)按51质量比混合，其中质粒质量均为2.5 g，4 静置1.5 h。(5)移去培养基，加入2 ml无血清培养基；加入pllDCIONP转染复合物，混匀，培养6 h。(6)换有血清培养基，加Zeocin，终浓度100 g/L。(7)每23 d换培养基，同时加Zeocin筛选，直到克隆形成。 1.2.6 外源基因是否整合的分析：常规抽提DNA，采用PCR法扩增外源ZeoR基因，ZeoR基因引物由上海基康公司设计合成。反应条件：先94 2 min，然后94 30 s，52 4
15、0 s，72 1 min，35个循环，最后72 延伸7 min，1%琼脂糖电泳，紫外灯下观察并拍照。 1.2.7 光镜下结构的观察：将消毒的盖玻片放入6孔板内。细胞接种在盖玻片上，于37 、5% CO2、饱和湿度下培养24 h，待细胞长成单层，取出盖玻片，然后用福尔马林固定，常规苏木精伊红染色。 1.2.8 透射电镜下的观察：待细胞长至对数生长期后，低浓度胰酶常规消化细胞，1000 r/min离心5 min，弃上清液，生理盐水洗1次，3%戊2醛固定后送检。 2&n
16、bsp; 结果 2.1 绿色荧光蛋白报告基因转染评价转染效率 按pllDCIONP和pEGFPN3质粒不同的质量比转染SGC7901胃癌细胞，以脂质体转染pEGFPN3质粒为对照， 转染48 h后在荧光显微镜下观察， 计算转染效率。脂质体转染效率约为31.9%。pllDCIONP转染pEGFPN3质粒，pllDCIONP与质粒DNA的质量比为11、 51、 101， 转染效率分别为10.95%、22.86%、3.8%，见图1。结果显示pllDCIONP可作为基因转染的载体将绿色荧光蛋白报告基因转染入细胞瞬时表达
17、。在荧光显微镜下，可观察到发绿色荧光的细胞。在pllDCIONP与质粒DNA的质量比为51时为最佳比例， 转染效率最高。 2.2 基因转染及转染正确性的鉴定 按最佳比例构建适合转染的NHE1反义基因磁性纳米微粒，再用NHE1反义基因磁性纳米微粒转染SGC7901胃癌细胞，以pllDCIONP为载体转染空载体为对照。Zeocin筛选，2周后可见转染细胞形成克隆，对照组细胞全部死亡。采用PCR法扩增外源性ZeoR基因，转染反义重组质粒的SGC7901胃癌细胞(Anti7901)、转染空载体的SGC7901胃癌细胞
18、(Zeo7901)可见1条特异性条带，大小为357 bp，而对照组SGC7901胃癌细胞未见特异性条带，说明反义重组质粒及空载体已成功转染至胃癌细胞内，见图2。 2.3 转染细胞倒置显微镜下结构 Anti7901 细胞呈单层生长，细胞胞体较大，部分脱壁。Zeo7901、SGC7901细胞呈复层生长，细胞胞体较小，层梭形或多边形，可见瘤巨细胞，见图3。 2.4 光镜下形态学变化 Anti7901细胞胞体增大，胞质丰富，核大小相对1
19、致，核质比减少，核分裂象减少，异型性减小。Zeo7901、SGC7901细胞胞体大小不1，形态多样，胞质少， 核大小不1， 核浆比增大， 核分裂象多见， 异型性明显， 出现较多巨核细胞和多核巨细胞， 见图4。 2.5 透射电镜结果 Zeo7901、SGC7901细胞核大，核仁突出，形状不规则，核膜有皱缩，细胞器不发达，线粒体少，粗面内质网少见，可见大量的游离核糖体。Anti7901细胞细胞器发达，线粒体丰富，形态较为成熟，并可见髓鞘样变，胞质内出现空泡样结构，高尔基体较发达，内质网扩张，核偏向1侧，极性增强。
20、基因治疗的核心目标是开发出能控释外源基因在靶细胞中表达的位点特异的基因转运系统。缺乏靶向性，是目前基因载体存在的主要问题之1。纳米技术有望提供新的思路4-5。氧化铁纳米颗粒具有超顺磁性，在外加磁场的作用下，可定向移动，从而进行靶向治疗。由于是无机纳米颗粒，氧化铁纳米颗粒还具有细胞毒性很低的优点6。在本实验中，我们将NHE1反义基因与经多聚赖氨酸修饰的氧化铁纳米颗粒结合，成功构建了同时具有生物功能、磁性靶向功能和基因治疗功能的NHE1反义基因磁性纳米微粒。NHE1反义基因磁性纳米微粒具备小型化和靶向性的特点，将使基因治疗更加准确、快速，有望达到高效、速效、低毒的效果。 &n
21、bsp; 我们通过将pEGFPN3质粒转染至SGC7901胃癌细胞来验证氧化铁磁性纳米颗粒是否具有将质粒DNA转染进入细胞的能力，同时确定转染时pllDCIONP与质粒DNA混合的最佳质量比。用于评价pllDCIONP转染效率的pEGFPN3质粒除含有真核表达载体所必备的元件外，还包括EGFP序列。EGFP是1种常用的报告基因，由238个氨基酸组成绿色荧光蛋白，可发出绿色荧光，这使我们可以通过检测其在细胞内的表达对转染效率做出快速评估。结果显示，pllDCIONP可作为基因转染的载体将绿色荧光蛋白报告基因转染入细胞。在荧光显微镜下，可观察到发绿色荧光的细胞。在pllDCIONP与质粒DNA的质
22、量比为51时为最佳比例，转染效率最高，达22.86%，但低于脂质体的转染效率(31.9%)。进1步改良 pllDCIONP，提高转染效率，开发新型的基因载体是我们今后的努力方向。 我们针对质粒载体中携带的Zeo标志基因进行PCR扩增，证实所转染的重组质粒是否整合入细胞基因组中。根据设计的引物，PCR产物大小应为357 bp。提取转染细胞以及对照组SGC7901细胞的基因组进行PCR扩增，结果显示从转染细胞Anti7901、Zeo7901的基因组中均可扩增出357 bp大小的特异性条带，而对照的亲本SGC7901细胞基因组中则未能扩增出此特异性条带。表明NHE
23、1反义基因表达质粒和空载体pcDNA3.1Zeo已分别成功整合SGC7901细胞基因组中，证明氧化铁磁性纳米颗粒具有将质粒DNA稳定转染进入细胞的能力。 由于肿瘤细胞糖酵解优势，导致肿瘤细胞内产生大量的乳酸和H+，但肿瘤细胞内pH却为中性或偏碱性，这种pH值的形成主要是由于细胞膜NHE1的激活和mRNA表达增加，从而使肿瘤细胞进行强大的Na+H+交换，将大部分H+泵出细胞外，保持肿瘤细胞内pH为中性或偏碱性，使肿瘤细胞免遭凋亡7。阻断肿瘤细胞NHE1基因的表达，导致肿瘤细胞内酸化，诱导细胞凋亡，可达到治疗肿瘤的目的，有望成为抗肿瘤治疗的新途径8。我们研究了磁
24、性纳米颗粒转染NHE1反义基因后细胞光镜及电镜下形态学的变化，光镜下发现细胞胞体增大，胞质丰富，核大小相对1致，核分裂象少见，核质比及异型性减小，巨核细胞和多核巨细胞少见。电镜下发现细胞细胞器发达，线粒体丰富，形态较为成熟，并可见髓鞘样变，胞质内出现空泡样结构，高尔基体较发达，内质网扩张，核偏向1侧，极性增强。在倒置显微镜下观察，Anti7901 细胞有明显的接触抑制现象，细胞失去重叠生长的能力，且易发生脱落。本研究结果提示，NHE1反义基因转染的细胞出现1种分化趋势，其机理可能是转入的NHE1反义基因阻断了NHE1基因的转录，蛋白表达减少，抑制NHE1活性，使细胞内酸化，从而使细胞形态恶性程
25、度降低、生长受到抑制。NHE1反义基因可以促进SGC7901胃癌细胞的分化，从而达到抑制肿瘤细胞生长的目的。 【参考文献】 1 滕小春，刘海峰，刘永生，等.NHE1蛋白在胃癌和胃癌前病变中的表达及临床意义.第3军医大学学报，2004，26(5)：402-404.2 滕小春，刘海峰，陈刚，等.人NHE1基因反义真核表达载体的构建及初步鉴定.第3军医大学学报，2004，26(2)：112-114.3 陈刚，刘海峰，滕小春.NHE1反义基因磁性纳米颗粒的构建及鉴定.消化外科，2005，4(1)：44-47.4 Prow T, Smith JN, Grebe R, et al. C1
