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1、外文资料译文口服二苯基二硒对镉致大鼠肝损伤的保护作用摘 要镉是环境中一种与人类疾病有关的有毒金属。本实验旨在探讨二苯基二硒，(PhSe)2，对长期暴露于氯化镉（CdCl2）中的大鼠的影响。用CdCl2（10mol/kg，口服）和(PhSe)2（5mol/kg，口服）对成年雄性Swiss大白鼠进行30天的处理。许多参数被作为毒性指标进行检测，包括肝肾损伤、血糖和糖原浓度以及氧化应激标志物。镉含量、肝脏结构、-氨基乙酰丙酸脱水酶（-丙氨酸-D）活性以及金属硫蛋白（MT）也要进行评价。染镉大鼠组织中的镉水平表明肝脏是镉的主要靶器官，(PhSe)2也在其中发挥作用。肝脏中镉浓度大概为肾脏的3倍，(Ph
2、Se)2使镉暴露大鼠肝脏中这种金属的含量降低了约60%。(PhSe)2能减轻镉致大鼠发生的组织学损伤。镉暴露使血液中丙二醛（MDA）含量以及谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）、乳酸脱氢酶（LDH）和-谷氨酰转移酶（GGT）活性升高，而(PhSe)2可使这种升高降低。(PhSe)2也可以降低镉暴露增加的尿素和胆红素水平。总之，本研究表明，(PhSe)2能减轻长期镉暴露所致的肝毒性和细胞损伤。本实验中(PhSe)2的作用机制是它的抗氧化性质以及与镉形成复合物的特性。关键词：镉，硒，二苯基二硒，肝损伤，氧化应激1 前言由于烟草、工业和农业生产，环境中镉的含量不断增加，已
3、成为主要的毒性化学物之一。它在人体内的生物半衰期很长（1030年），其毒性取决于接触途径、剂量及时间长短。急性镉中毒主要引起肝脏和睾丸损害，而慢性镉中毒引起肾损伤。大鼠镉中毒造成严重的肝损伤，主要表现为肝细胞坏死。镉毒性作用的分子机制可能是机体抗氧化防御系统的紊乱和活性氧的产生。实际上，镉是一种非氧化还原金属，它总是采用一个单一的氧化状态，而不是活性氧的诱导剂。镉毒性作用主要因为电子传递链的破坏以及线粒体中活性氧物质的蓄积。因此，有研究者认为，抗氧化剂对有效治疗镉中毒有重要意义。有机硒化合物特别是二苯基二硒(PhSe)2的药理研究发现，它的抗氧化性质及金属复合物的形成激发了它的作用机制，这也是
4、本实验讨论的主要内容。(PhSe)2的抗氧化性质使其对不同组织的氧化损伤具有保护作用。镉与(PhSe)2形成复合物的研究已经见到报道，本实验主要探讨(PhSe)2对长期镉暴露下的大鼠的影响。2 材料与方法2.1 化学试剂氯化镉（CdCl2）购自默克公司（Darmstadt，德国）；-氨基乙酰丙酸（-丙氨酸）和P-二甲基氨基苯甲醛购自Sigma（St.Louis，MO，美国）；二苯基二硒，(PhSe)2，根据Paulmier合成，HNMR和CNMR分析及光谱数据显示其结构正确。对(PhSe)2（99.9%）是由气相色谱/高效液相色谱法测定其化学纯度。所有其他试剂均为分析纯，从标准的商业供应商获得
5、。2.2 动物使用我们自己繁殖的成年雄性Wistar大鼠（200-250g）。在一个单独的动物房饲养这些动物，12h光/暗周期，222室温，自由采食和饮水。这些动物的使用是根据巴西圣玛丽亚联邦大学实验动物资源的护理和使用委员会所制定的准则。2.3 实验方法大鼠每两日口服给药CdCl2和(PhSe)2，使用强饲法，为期30天。每一实验组的6只大鼠要经常测试。CdCl2（10mol/kg，溶解于生理盐水，1mL/Kg）进行处理，30min后，用(PhSe)2（5mol/kg，溶解于菜籽油，1mL/Kg）处理。(PhSe)2的剂量是根据我们实验小组之前的研究。大鼠处理如下：第1组：生理盐水+菜籽油；
6、第2组：CdCl2 10mol/kg+菜籽油；第3组：生理盐水+(PhSe)2 5mol/kg；第4组：CdCl2 10mol/kg+(PhSe)2 5mol/kg。最后一次CdCl2注射24h后，直接从麻醉动物的心室采集血液样本。随后，断头处死老鼠，摘除肝脏，迅速在pH值为7.5的50mM Tris-HCl（1/10，w/v）中进行组织匀浆，2400g离心15min。2.4 肝细胞损伤指标用试剂盒测定血浆酶谷草转氨酶（AST），谷丙转氨酶（ALT），碱性磷酸酶（ALP），-谷氨酰转移酶（GGT），乳酸脱氢酶（LDH）水平。根据Reitman和Frankel使用的试剂盒（实验室检验，Diagn
7、ostica S.A.，Minas Gerais，巴西），IFCC（国际临床化学家联合会）。2.4.1 胆红素含量血浆总估计，根据Malloy and Evelyn对直接和间接胆红素含量测定所用的试剂盒（实验室检验，Diagnostica S.A.，Minas Gerais，巴西），通过分光光度计测定。2.5 肾损害的指标使用试剂盒（实验室检验，Diagnostica S.A.，Minas Gerais，巴西），通过测定血液中尿素和肌酐水平分析肾功能。2.6 血糖水平根据Malloy and Evelyn，对血糖含量用试剂盒（实验室检验，Diagnostica S.A.，Minas Gerai
8、s，巴西），通过分光光度计测定。2.7 糖原测定肝糖原的含量测定使用Krisman的方法。简单地说，一个已知量的肝脏在2mL 30%的KOH溶液中溶解。再在试管中加2mL乙醇，沸水水浴10min。经过沉淀，糖原悬浮于0.2ml 5N HCl和0.8mL蒸馏水中。用碘试剂460nm处测定肝糖原的含量，用克糖原/100克肝表示。2.8 丙二醛（MDA）分别量取各组血液样本200L用于MDA测定。用于分析的方法是自动酶联免疫吸附试验-免疫检测。2.9 -氨基乙酰丙酸脱水酶（-丙氨酸-D）活性通过Sassa的方法，用1M钾磷酸盐缓冲液和pH值6.8的12mM的氨基乙酰丙酸（ALA）测定产物生成量，分析
9、肝脏-丙氨酸-D活性。39下反应30min，555nm条件下测定反应产物。2.10 过氧化氢酶的活性根据Aebi法，测定过氧化氢分解来分析肝过氧化氢酶的活性2.11 超氧化物歧化酶活性根据Misra和Fridovich的方法，用分光光度计测定超氧化物歧化酶（SOD）的活性。这种方法是基于SOD能够抑制肾上腺素自氧化的能力。显色反应在480nm处测定。一个酶单位定义为在26抑制50%肾上腺素自氧化率所需的酶量。2.12 谷胱甘肽-S-转移酶活性根据Habig等人的方法，通过谷胱甘肽和1-氯-2，4-二硝基苯（CDNB）的反应，340nm测定肝谷胱甘肽-S-转移酶（GST）活性。2.13 抗坏血酸
10、水平通过Jacques-Silva等人的方法，进行测定肝脏抗坏血酸水平。蛋白质（肝）是在10倍的50%三氯乙酸溶液制备。300mL均质样品，分装，38静置3h，加1mL 65%浓硫酸。测定反应产物使用的显色剂由4.5mg/mL的二硝基苯肼和0.075mg/mL的硫酸铜溶液组成。2.14 非蛋白巯基化合物（NPSH）含量肝脏NPSH水平根据Ellman的方法测定。上清样本（500L）和10%三氯乙酸（500L）1:1混合，离心后，蛋白质颗粒被丢弃，自由巯基在上清液中。100L上清液加到850L磷酸氢二钾缓冲液（pH为7.4）和50L 10mM的2-硝基苯甲酸（DTNB）中，显色反应在412nm处
11、测定。2.15 金属硫蛋白（MT）含量肝脏金属硫蛋白含量的测定根据Petrovic改进的Viarengo等人的方法。1mL上清液中加入1.05mL无水乙醇（-20）和80L氯仿，然后6000g离心10min。收集的上清液上清液中加入冷乙醇（-20），保持在-201小时，6000g离心10min。用87%酒精和1%氯仿漂洗含颗粒的金属硫蛋白，6000g离心10min。金属硫蛋白沉淀含量的测定使用Ellman的比色法。再在样品中加入150L 0.25M NaCl和150L 1N HCl-4mM EDTA 混合溶液。然后室温下向样品中加入0.2M 磷酸盐缓冲液（pH8.0）和402mL 2M NaC
12、l-0.43mM DTNB 混合溶液。最后样品3000g离心5min，412处测定吸光度。2.16 蛋白测定蛋白质测定采用Lowry等人的方法，用牛血清白蛋白作为标准蛋白。2.17 镉含量用原子吸收光谱法对血浆，肾脏和肝脏的镉含量进行分析。样本（肾脏和肝脏）在硝酸（65%）溶解。一个样本库（含200L样品）用来评价镉含量。三个样品库测量结果由每一个实验组组成。2.18 病理学组织麻醉大鼠，进行彻底的尸检评价。记录肝脏重量，组织保存和固定在10%福尔马林中。光学显微镜检查，组织石蜡包埋，切片5m，苏木精和伊红染色。所有处理组进行病理检查（3个一组）。2.19 统计分析采用双向方差分析（ANOVA
13、）和Duncan多重极差检验，结果以平均值标准差表示。比较处理组和各自的对照组，P0.05被认为具有统计学意义。3 结果3.1 肝细胞损伤指标CdCl2暴露引起肝脏和肝细胞损伤，(PhSe)2可以改变这种损伤。3.1.1 AST及ALT活性CdCl2和(PhSe)2的交互作用在AST活性中差异极其显著（F1，12=44.38，P0.001）（图1A）。结果显示，大鼠暴露于CdCl2中AST活性增加了31%，而(PhSe)2有效改善镉致AST活性的这种增加。双向方差分析CdCl2和(PhSe)2的交互作用，其对ALT活性的影响差异极其显著（F1，15=29.14，P0.001）（图1B）。暴露于
14、CdCl2中的大鼠ALT活性增加69%，而(PhSe)2抑制了CdCl2的这种影响。单独给药(PhSe)2使ALT活性降低了16%。3.1.2 LDH，ALP和GGT活性双向方差分析显示，CdCl2和(PhSe)2对血浆LDH的活性均呈显著性影响（P0.05）（图2A略）。结果可见，暴露于CdCl2中的大鼠LDH活性增加47%，而给药(PhSe)2抑制了CdCl2引起的LDH活性增加现象。大鼠给药(PhSe)2其LDH活性降低了39%。可见，CdCl2和(PhSe)2对血浆ALP的活性均呈显著性影响（P0.05）（图2B略）。结果显示，CdCl2暴露使ALP的活性升高45%，而给药(PhSe)
15、2抑制了CdCl2引起的ALP活性的增加，使ALP活性降低了37%。双向方差分析显示，CdCl2和(PhSe)2的交互作用在GGT活性中差异极其显著（F1，15=34.83，P0.001）（图2C略）。结果可见，暴露于CdCl2中的大鼠AST活性与对照组相比增加了2.5倍，而给药(PhSe)2抑制了CdCl2引起的GGT活性的增加（图2C略）。图1 (PhSe)2对CdCl2暴露的大鼠血浆中AST（A）和ALT（B）活性的影响。数据以平均值标准差表示。（a）与对照组比较P0.05（双向方差分析/Duncan），（b）与氯化镉组比较P0.05（双向方差分析/Duncan）。3.2 胆红素含量双向
16、方差分析显示，CdCl2和(PhSe)2的交互作用在总胆红素水平中差异极其显著（F1，15=39.55，P0.001）（图3A略）。结果可见，暴露于CdCl2中的大鼠总胆红素水平与对照组相比增加了2.7倍（图3A略），而给药(PhSe)2有效抑制了CdCl2引起的总胆红素水平的增加（图3A略）。CdCl2和(PhSe)2的交互作用在直接胆红素水平中差异极其显著（F1，15=53.15，P0.001）（图3B略）。暴露于CdCl2中的大鼠直接胆红素水平与对照组相比增加了3.0倍，而给药(PhSe)2抑制了CdCl2引起的直接胆红素含量的增加（图3B略）。双向方差分析可见，CdCl2和(PhSe)
17、2的交互作用在间接胆红素水平中差异极其显著（F1，14=52.02，P0.001）（图3C略）。结果显示，暴露于CdCl2中的大鼠的间接胆红素水平与对照组相比增加了2.4倍，而给药(PhSe)2有效抑制了CdCl2引起的间接胆红素含量的增加（图3C略）。3.3 肾损伤指标目的是为了确定CdCl2和(PhSe)2暴露是否能引起肾损伤指标的变化，对这些参数进行了评价。双向方差分析显示，CdCl2和(PhSe)2的交互作用在血尿素水平中差异显著（F1，32=39.55，P0.039）（图4A略）。暴露于CdCl2中的大鼠血尿素水平增加了23%，而给药(PhSe)2有效抑制了它的增加（图4A略）。双向
18、方差分析可见大鼠血浆肌酐浓度没有显着变化（图4B略）。3.4 糖原和血糖浓度待添加的隐藏文字内容3为了确定CdCl2和(PhSe)2暴露是否影响血糖的代谢，对这些参数进行了评价。双向方差分析显示，CdCl2对肝糖原水平有显著影响（P0.05）（图5A略）。因此可见，暴露于CdCl2中的大鼠肝糖原水平增加了64%，而给药(PhSe)2对CdCl2所致的肝糖原水平增加没有改善作用。双向方差分析显示血糖浓度没有显著性变化（图5B略）。3.5 氧化应激为了确定氧化应激是否受CdCl2和(PhSe)2暴露的代谢，对这些参数进行了评价。3.5.1 CAT，SOD，-丙氨酸-D和GST活性双向方差分析显示肝
19、脏CAT，SOD，-丙氨酸-D和GST活性没有显著性变化（表1略）。3.5.2 MDA，抗坏血酸，NPSH和MT水平双向方差分析显示MT水平没有显著性变化（表2略）。(PhSe)2对肝脏NPSH水平有显著影响（表2略）。因此可见，暴露于(PhSe)2中的大鼠NPSH水平增加了33%。CdCl2和(PhSe)2的交互作用在MDA水平中差异极其显著（F1，8=383.46，P0.001）（表2略）。暴露于CdCl2中的大鼠血浆MDA水平与对照组相比增加了约9倍，而给药(PhSe)2降低了CdCl2引起的MDA水平的增加（表2略）。结果显示，(PhSe)2对肝脏抗坏血酸水平有显著作用（P0.05）（
20、表2）。实际上，大鼠给药(PhSe)2使肝脏抗坏血酸水平增加了33%。3.6 镉含量与对照组相比，CdCl2组大鼠血浆中的镉含量呈增加趋势。给药(PhSe)2使CdCl2暴露所致的镉含量增加降低了约40%（表3略）。给药(PhSe)2使CdCl2暴露所致的肝脏镉含量增加降低了约60%（表3略）。同样，(PhSe)2使大鼠肾脏镉水平的增加降低了约20%（表3略）。3.7 病理组织学与对照组的肝细胞相比（图6A略），CdCl2暴露引起肝细胞变性（肿胀）和个别细胞坏死（图6B略）。联合暴露于CdCl2和(PhSe)2的大鼠肝脏与对照组相比，没有发生组织病理学改变（图6D略）。4 讨论二苯基二硒已经被
21、证明能够保护机体免受各种化学物质的毒性作用，包括致癌物质和氧化损伤的诱导物。(PhSe)2作用的主要机制是它能够抑制这些化学物质诱导的氧化应激。有研究报道，(PhSe)2另一可能作用机制是它与镉形成复合物。目前的研究表明，长期CdCl2暴露下用(PhSe)2联合处理可以降低大鼠肝细胞毒性和细胞损伤。结果表明：(PhSe)2有效改善CdCl2诱导的毒性作用，这是因为它的抗氧化性质和与镉形成复合物。镉含量的数据验证了镉和(PhSe)2的可复合假说。根据数据我们可以看出，(PhSe)2的存在可以使镉更容易排泄。但是它们的复合物能否被吸收，这个问题还有待解决。本研究中，镉暴露增加了MDA含量，但机体抗
22、氧化防御系统（抗坏血酸水平，CAT和SOD）没有任何改变。因此，本实验模型提示氧化应激可能是CdCl2诱导的肝损伤的原因之一。用(PhSe)2联合处理抑制了CdCl2暴露所致的MDA水平的增加。(PhSe)2是一种有机硒化合物，其抗氧化活性已被报道。另外，(PhSe)2能够减轻CdCl2诱导的小鼠睾丸的氧化损伤。相反的是，一些以往的研究报告对镉等有毒物质引起的细胞损伤，氧化应激在其中的主要作用提出了异议。本研究中抗氧化防御系统没有发生改变，对此的一个合理的解释是：镉暴露只有在刚开始接触时对机体抗氧化系统有影响，但是30天之后恢复到正常状态并维持之前的氧化损伤。因此，细胞和氧化损伤可能反映生物化
23、学和病理组织学参数的改变。除了氧化应激，镉诱发肝毒性的可能涉及到其他三个不同的途径：第一个是由金属和/或局部缺血引起的急性直接毒性作用，从而导致上皮细胞损伤。第二个是Kupffer细胞激活的炎性损伤，中性粒细胞在其中发挥了主要作用。第三个是镉的转移途径，它的存在形式也与生物学本质上的金属（如钙、铜、锌）一样。一旦进入细胞，镉离子干扰细胞的代谢主要是通过代替其他二价阳离子的作用（尤其是钙），从而激活或抑制各种酶的作用。本研究组织病理学观察发现，长期CdCl2暴露会引起肝细胞损伤。组织病理学结果显示，镉暴露导致细胞变性（肿胀）和个别坏死（图6B略）。用(PhSe)2联合处理抑制了CdCl2所致的病
24、理学改变（图6D略）。本实验结果显示，(PhSe)2使ALT，AST，GGT，ALP活性和胆红素水平降低，而它们是评价肝损伤的指标。另外，镉暴露使细胞损伤指标LDH水平升高，而(PhSe)2使这种升高降低。(PhSe)2对生化参数（ALT，AST，GGT，ALP和胆红素）具有促进作用，着是因为它的抗氧化性质，能够清除自由基，抑制脂质过氧化和细胞破裂。事实上，已有研究证明，(PhSe)2具有保肝作用。值得一提的是，肝脏对镉有解毒作用，但是若这种金属在肝组织中蓄积就会引起急性肝损伤，并导致组织病理学变化。实验结果显示，CdCl2暴露下肝脏中的镉含量表明肝脏是镉作用的靶器官，(PhSe)2也在其中发
25、挥作用。肝脏中镉浓度大概为肾脏的3倍，(PhSe)2镉暴露大鼠肝脏中这种金属的含量降低了约60%。此外，镉暴露引起肝糖原含量的增加，但是血糖水平没有改变。据报道，镉具有抑制胃肠道和哺乳动物肾脏中的Na+-葡萄糖泵的作用。这可能导致动物机体对葡萄糖需求的增加。而这种需求会导致糖异生，这也许可以解释CdCl2暴露下的血糖浓度为何为正常水平（图5B略）。镉还能够抑制不同组织中葡萄糖-6磷酸脱氢酶的活性，导致葡萄糖-6-磷酸浓度的增加，从而导致糖原磷酸化酶（抑制糖原分解）的失活和糖原合成酶（促进糖原合成）的激活，这就解释了CdCl2暴露下糖原含量的升高。虽然Barbosa等的研究报道证明(PhSe)2
26、具有类似胰岛素的性质，但是给药(PhSe)2并没有改变糖原和葡萄糖含量。总之，本研究表明，亚慢性CdCl2暴露下，用(PhSe)2联合处理可以抑制大鼠肝毒性和细胞损伤。本实验中(PhSe)2的作用机制是它的抗氧化性质以及与镉形成复合物的特性。致谢对FAPERGS，CAPES和CNPq的资金支持表示感谢。参考文献（略）译自：Lysandro Pinto Borges, Benhur Godoi, Cristina W. Nogueira, et al. Oral administration of diphenyl diselenide protects against cadmium-induced liver damage in rats J. Chemico-Biological Interactions, 2008, 171: 15-25.
