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1、青岛农业大学毕 业 论 文 题 目：惰性载体对瘤胃真菌产酶活性的影响 姓 名： 学 院： 动物科技学院 专 业： 动物科学 班 级： 1001 学 号： 20103867 指导教师： 王利华 2014 年 6 月 5 日惰性载体对瘤胃真菌产酶活性的影响动物科学专业 吴硕文指导教师 王利华摘要：本试验采用二因素试验设计，通过体外固态发酵试验，利用从崂山奶山羊瘤胃内分离纯化的一株真菌菌株探讨不同惰性载体（珍珠岩、沸石、膨润土）及不同添加量（0.2%、0.4%、0.6%）对瘤胃真菌产羧甲基纤维素酶、-葡萄糖苷酶、微晶纤维素酶、滤纸酶酶活的影响。结果表明，沸石、膨润土添加组显著提高羧甲基纤维素酶活（P
2、0.05）。载体类型、添加量及载体类型与添加量互作对对微晶纤维素酶、-葡萄糖苷酶和滤纸酶均有显著影响（P0.05），以沸石为载体、添加量为0.2%时产酶活性最高。在发酵第8天时，各组酶活较高。综上所述，本试验条件下载体为沸石、添加量为0.2%、培养8天对瘤胃真菌产纤维素酶活最高。关键词：载体；添加量；载体类型；纤维素酶活Influence of inert Carrier on Cellulase Activities fermented by Ruminal FungusStudent Majoring in Animal Science Wu ShuowenTutor Wang Lihua
3、Abstract: Solid-state fermentation in vitro was adopted to study the effects of inert carrier types and supplements on cellulose activities by two factors experimental design. Carrier types included perlite, zeolite, bentonite, and carrier supplements were 0.2%, 0.4% and 0.6%, respectively. A fungus
4、 strain purified and isolated from the rumen of Laoshan dairy goats was fermented to produce cellulases. Carboxymethyl cellulase, -glucosidase, microcrystalline cellulase and filter paper enzyme were monitored. Compared to bentonite, zeolite and bentonite significantly improved Carboxymethyl cellula
5、se (P0.05). Carrier types, carrier supplements and the interaction of carrier types with supplements had significant effects on -glucosidase, microcrystalline cellulase and filter paper enzyme (P0.05). The zeolite supplement of 0.2% had the greatest activity of -glucosidase, microcrystalline cellula
6、se and filter paper enzyme. The cellulase activities had the greatest at fermentation time point of 8 day. It could be concluded from results that the zeolite of 0.2% had the greatest cellulase activities at 8 d fermentation in the present experiment.Keywords: carrier; supplement; carrier type; cell
7、ulase activity引言近年来，随着我国畜牧业的持续快速发展，畜牧生产对粮食的需求越来越大，这就给我国的粮食生产需要造成了很大的压力，致使人畜粮食矛盾越来越突出。纤维素类物质是地球上存在的最廉价、最丰富、最易得的一类碳水化合物。据估计，全球植物每年通过绿色光合作用生产的纤维素大约为4.01010 吨1。它们是自然界中存在量最大的一类可再生资源，然而大部分纤维素性的资源由于难以消化被白白浪费掉，甚至成为数量最大的一类环境污染物。我国是农业生产大国，每年都会产生大量的农业秸秆，而这可以很好的作为反刍动物的饲料。这些秸秆中的纤维素对于反刍动物来说，利用率很低，如何有效地利用纤维素类物质发展粮
8、食节约型畜牧业已经成为广大畜牧工作者共同的目标。2010年全国食用菌产量突破2200万吨，达2201.6万吨2。据国家统计局数据显示，每生产1 kg的食用菌，大约可产生5 kg的菌糠废弃物3。菌糠是指经栽培食用真菌菌后的废弃物，主要含有大量可利用率低的粗纤维、木质素和具有较高利用价值的菌丝体，还含有丰富的蛋白质、氨基酸、碳水化合物、维生素和微量元素4。虽在食用菌的初次发酵后可作为饲料来饲喂动物，并且通过动物饲养试验肯定了其饲料级价值，但是其营养物质含量仍较低，粗纤维含量相对较高，动物利用量较少，目前绝大部分菌糠被作为农业生产废料丢弃，白白浪费。瘤胃真菌是一类具有产较高纤维素降解酶活性的厌氧性微
9、生物，因其能够分泌羧甲基纤维素酶、微晶纤维素酶、-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、果胶酶、蛋白酶、淀粉酶等多种酶类，越来越受到科研工作者的重视。如何提高瘤胃真菌的体外适应性和产酶活性是一项亟待解决的问题。另外，瘤胃真菌所产纤维素降解酶的体外作用条件及饲料降解的实际作用效果也有待验证。据了解虽然许多高校试验室都在做瘤胃真菌体外液态发酵产酶试验，但是测得的酶活性普遍较低，根本不能满足生产需要。本试验参考国内外采用生物膜技术来治理水污染的成熟的方法来进行瘤胃真菌体外固态发酵试验，以求找到能够提高酶活力的有效发酵方法。生物膜技术在国内饲料营养学上还较少运用，主要是以惰性载体（如沸石、珍珠岩、膨润土等）作为菌体生
10、长的依附面，使菌体迅速繁殖，快速形成一层生物膜，提高其对外界环境的适应性。该试验采用二因素试验设计，探讨不同惰性载体（珍珠岩、沸石、膨润土）、不同添加量（0.2%、0.4%、0.6%）及发酵时间对瘤胃真菌产羧甲基纤维素酶、-葡萄糖苷酶、微晶纤维素酶、滤纸酶酶活的影响。1 材料与方法1.1 试验材料从瘤胃厌氧菌分离纯化的一株真菌菌株，由青岛农业大学动物科技学院动物营养与饲料科学试验室提供；玉米粉、麸皮、菌糠、花生蔓、珍珠岩、沸石、膨润土均为市售。玉米粉、麸皮、菌糠、花生蔓采用德国Henneherg和Stohmann7饲料概略养分分析方案对原料的概略养分进行分析。分析结果见表1。表1 原料常规养分
11、表Table 1 Nutrients compositions of materials in substrate原料 Crud material粗蛋白（%）CP粗脂肪 （%）CE中性洗涤纤维（%）NDF酸性洗涤纤维（%）ADF干物质（%）DM玉米7.813.1540.273.9687.93麸皮16.83.1846.137.9289.03菌糠9.330.3064.2436.4586.90花生蔓12.712.2155.4349.3091.31固体底物10.802.4049.1020.3088.60注：固态底物为玉米:麸皮:菌糠:花生蔓=4:2:2:2混合后的底物。1.2 试验仪器电子分析天平（上
12、海精科天美贸易有限公司，型号FA1204B）、电热恒温培养箱（龙口先科仪器公司）、高速离心机（EPPENDORF 5415D）、电热恒温水浴锅（浙江市三和仪器仪表公司，型号SY21-Ni）、电热鼓风干燥箱（吴江宏成电热设备有限公司，型号202B）、PHS-3C型pH计、二氧化碳罐、马弗炉（东莞市豪邦仪器设备有限公司，型号SX2）、立式压力蒸汽灭菌器（上海波迅实业有限公司医疗设备厂）、电子调温万用电炉（1KW4，龙口市先科仪器有限公司）、专用单向发酵袋。1.3 培养基的制备1.3.1 种子培养基制备本试验种子培养基的制备参照朱崇淼5的方法，见表2。1.3.2 平板培养基的制备：每升种子培养基中加
13、入琼脂15 g，配制而成。置于立式压力蒸汽灭菌器中经121高温高压灭菌后倒板冷却备用。1.3.3 固体发酵底物制备：按照玉米：麸皮：菌糠：花生蔓=4:2:2:2的比例配合发酵底物120 Kg，均匀混合后装袋备用。表2 液体培养基配方（每升含量）Table 1.1 Composition of culture medium (Every litres of content)成分Composition碳酸氢钠NaHCO3葡萄糖Glucose酵母膏Yeast cream蛋白胨Pepton缓冲液ABuffer A缓冲液BButter B 无细胞瘤胃液Cell-free rumen- fluid蒸馏水D
14、istilled water含量5.0 g1.0 g1.0 g1.0 g165 mL165 mL170 mL500 mL注：表中所用蒸馏水需要煮沸冷却后再使用，以便排除水中溶解的氧气。培养基在配置完成后，要加入1 mL 0.1%的刀天青水溶液作为厌氧指示剂。每升缓冲液A中，需含有硫酸铵3.9 g、氯化钠6.0 g、二水氯化钙0.4 g、磷酸二氢钾3 g和七水硫酸镁0.6 g，倒入已煮沸排除氧的蒸馏水溶解备用。每升缓冲液B中，需含三水磷酸氢二钾4 g，倒入已煮沸排除氧的蒸馏水溶解备用。制备无细胞瘤胃液的方法：在每天下午4点采取安装永久瘤胃瘘管的崂山奶山羊B的新鲜瘤胃液，静置沉淀半小时后，置于40
15、00 r/min离心机中离心25 min，取上清液于烧杯中保存在-20冰箱中以备用。上诉培养基配制好后需通入二氧化碳23 h至饱和，再加入0.15%的L-半胱氨酸盐酸盐，以便使溶液尽可能的保持厌氧环境。以上步骤都完成后，采用高温高压经121灭菌15 min，常温冷却后备用。1.4 试剂配制1.4.1 制取pH=4.8醋酸-醋酸钠缓冲溶液pH=4.8醋酸-醋酸钠缓冲溶液的制备,本试验参照王建等6方法，将0.1 mol/L醋酸溶液9.2 mL和0.1 mol/L醋酸钠溶液10.8 mL混合。1.4.2 制取羧甲基纤维素钠溶液羧甲基纤维素钠溶液的制备，本试验参照王建等6方法，称取1.0 g羧甲基纤维
16、素钠盐溶于100 mL pH=4.8醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，待使用时需摇匀。1.4.3 制取pH=6.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液取737 mL 0.1 mol/L的柠檬酸溶液，加入1263 mL 0.2 mol/L的磷酸氢二钠溶液，加热混匀即可。1.4.4制取3,5-二硝基水杨酸（DNS）溶液准确称取酒石酸钾钠盐182.0 g于1000 mL烧杯中，加入蒸馏水500 mL，水浴加热溶解（不超过50），溶解后再依次加入已称量好的3,5-二硝基水杨酸6.30 g、氢氧化钠21.09 g、重结晶苯酚5.09 g，无水亚硫酸钠盐5.09 g，用玻璃棒搅拌至完全溶解，冷却后定容至1000 mL棕色容量
17、瓶内，避光保存，放置一周后取上清液使用。1.5 菌种扩繁1.5.1 菌种活化将保存在-20中的B菌种平板培养基取出，置于39下解冻备用。在超净台中进行无菌接种，右手取接种环在酒精火焰上灼烧灭菌，先将环烧热至发红，然后将整个细金属丝烧红，再将接种环倾斜，沿着环向上依次烧，直到烧至可能碰到培养基的部分，如此返回在烧到环端，来回通过火焰数次。待接种环自然冷却（或蘸取平板内水珠冷却）后，刮取已在室温下解冻的平板上的菌落，左手持琼脂平板，在靠近酒精灯火焰处略开盖。右手持已取标本的接种环伸入到琼脂平板表面一侧边缘，利用腕力将接种环在平板上来回划线。1.5.2 传代培养上述菌株培养三天后，进行菌体传代扩繁。
18、将已配好的2 L液体种子培养基分别均分于10个1725 cm封口袋中（即每袋200 mL），再把已活化的菌接种到封口袋中，仍置于39的温箱中进行传代培养3天，观察菌体生长情况，此操作依旧需要在超净台中进行。菌体一般传3代后可满足试验需要量。1.6 试验设计本试验采用二因素试验设计，载体类型为珍珠岩、沸石、膨润土，载体添加量分别0.2%、0.4%、0.6%。1.7 试验方法及酶活测定每个固态培养基重200 g，其中添加固态底物80 g，其余为水分（包含菌体培养液）。固态底物和已与菌体培养液20 mL混合的载体混合物拌匀后装袋，经抽真空后置于39温箱中发酵，每隔2天采样测酶活。取固态培养物1 g左
19、右于15 mL离心管中，用移液枪向离心管中加入10 mL pH=6.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，震荡混匀后，静置30 min，然后置于4000 r/min高速离心机离心30 min，取上清液于10 mL离心管中，置入4的冰箱中冷藏备用，测定其中的羧甲基纤维素酶（Carboxymethyl cellulose, CMC）、微晶纤维素酶（Microcrystalline cellulose, MCC）、-葡萄糖苷酶（-glucosidase, BGL）、滤纸酶（filter paper enzyme, FPA）活性。1.7.1 羧甲基纤维素酶（CMC）活性测定葡萄糖标准曲线的绘制参照朱崇淼等5的
20、方法稍加改进，分别称取已经烘干恒重的葡萄糖0.04 g、0.08 g、0.12 g、0.16 g、0.20 g，分别溶于5个25 mL的小容量瓶中，配成用于绘制标准曲线的葡糖糖标准溶液，然后分别再取0.2 mL上述标准溶液于10 mL离心管中，空白组加入0.2 mL蒸馏水代替标准溶液，再向每个离心管中加入1 mL蒸馏水和1.8 mL缓冲液，混匀后置于50水浴中加热5 min，最后加入3 mL DNS溶液，沸水浴5 min后迅速置于冷却，将紫外分光光度计设置在550 nm波长处测取吸光值。绘制标准曲线，如图1。本试验参照Lowe等8方法稍加改良，取已配好的羧甲基纤维素钠（CMC）溶液1 mL于1
21、0 mL离心管中，再加入1.8 mL pH=6.0的柠檬酸-磷酸氢二钠溶液，置于50水浴锅预热5 min后，后加入稀释10倍的发酵液0.2 mL，混合均匀，50水浴加热30 min后，加入DNS溶液3 mL，沸水浴5 min后迅速置于冷水冷却，置550 nm波长读取吸光值。对照组发酵液上清液经煮沸灭活后作对照。以葡萄糖标准曲线为标准，计算所测的上清液释放的葡萄糖具体含量。酶活力定义为在上述条件下，每分钟释放1 mol葡萄糖的酶量为一个酶活单位（U），换算成每克干物料含有的酶活，以U/g（干物质）。图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose酶活力计算：酶活
22、力(U/g)=WN1000/(TmM)。W-酶解反应产生得葡萄糖量，从葡萄糖标准曲线上查得，单位：g；T-反应时间，30 min；N-酶液得稀释倍数；50M-葡萄糖分子量，180.16 g/mol；m-样品干物质质量，g。1.7.2 微晶纤维素酶(MCC)活性的测定本试验此方法根据Hossam M9的方法改良。取1 mL微晶纤维素的溶液于10 mL离心管中，加入1.8 mL pH=6.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，50水浴预热5 min后，加入0.2 mL稀释10倍的发酵液上清，50水浴保温30 min后，加3 mL DNS溶液，100沸水浴5 min显色冷却后，置于紫外可见光光度计中550 n
23、m波长读取吸光值，对照组以经煮沸灭活的发酵液上清作对照，然后以葡萄糖标准曲线为标准，计算所测上清液释放的葡萄糖含量。酶活力的定义同上文所述的羧甲基纤维素酶。1.7.3 -葡萄糖苷酶(BGL)活性测定取1 mL水杨素溶液于10 mL离心管中，加入1.8 mL pH=6.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，50水浴预热5 min，加入0.2 mL稀释10倍的发酵液上清，50水浴加热30 min，然后加入3 mL DNS溶液，100沸水浴5 min后，置于冷水中流水冷却，于紫外可见光光度计中550 nm波长处读取吸光值，对照组以经煮沸灭活的发酵液上清作对照，最后参考葡萄糖标准曲线为标准，计算所测上清液释放的
24、葡萄糖大致含量。酶活力定义同上文羧甲基纤维素酶活。1.7.4 滤纸酶(FPA)活性测定本试验滤纸酶活的测定参考赵玉萍10等的方法稍加改良。加1.8 mL pH=6的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液于10 mL离心管中，水浴加热到50，预热5min后，加入一条16 cm新华滤纸（501 mg），再加入稀释10倍的0.2 mL酶液后，50水浴加热30 min，再加入3 mL DNS溶液。沸水浴5 min后，置于冷水中流水迅速冷却，于紫外可见光度计中550 nm波长处读取吸光值，空白组以经煮沸灭活的发酵液上清作对照,最后参考葡萄糖标准曲线，计算所产葡萄糖的含量。酶活力定义同上文已述的羧甲基纤维素酶。1.8
25、数据统计分析试验数据采用Excel初步处理后，用SAS9.3软件的MIXED过程，分别对载体类型、载体添加量以及二者互作效应进行方差分析，计算最小二乘均数及标准误，用Tukey法对最小二乘均数进行多重比较。2 试验结果由表3可知，载体类型及载体与添加量互作对纤维素酶活影响显著（P0.05），沸石和膨润土添加组的酶活均显著高于珍珠岩添加组（P0.05），但对MCC、BGL和FPA酶活影响显著（P0.05），0.2%载体添加组的纤维素酶活显著高于0.6%载体添加组（P0.05）。沸石的添加量为0.2%时，产酶活性最高。表3 载体类型、添加量对瘤胃真菌产纤维素酶活的影响Table 3 The eff
26、ects of inert carrier types and supplements on cellulase activities项目珍珠岩沸石膨润土SEP值0.20%0.40%0.60%0.20%0.40%0.60%0.20%0.40%0.60%P载体类型P添加量P载体类型*添加量CMC0.07gi0.03i0.10egi0.37a0.26abc0.19cehj0.24bcf0.31abd0.34ab0.03.00010.4313.0001MCC0.24dfi0.16fh0.13h0.41a0.32abcd0.25cdf0.29bcdg0.37ab0.36abce0.02.00010.0
27、0480.0002BGL0.13eg0.08g0.17ceg0.50a0.31bd0.23bceh0.25bcf0.33b0.31b0.02.00010.0062.0001FPA0.28egh0.18h0.21gh0.62a0.45bd0.31ceg0.41bcf0.49ab0.47b0.03.0001.0001.0001注：同行同效应数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05)，含相同字母表示差异不显著（P0.05）。图2 CMC酶活变化图Fig.2 CMC cellulase activities at different time points据图2可知，沸石、膨润土添加组对CMC酶活
28、均显著高于珍珠岩添加组（P0.05）。发酵第10天的酶活显著高于第2、4、6天的酶活（P0.05）。在沸石添加组中，发酵第10天的CMC酶活显著高于第2、4、6天的酶活，并在发酵第8天时，达到产酶峰值；在膨润土添加组中，发酵第4、6、8、10天的CMC酶活显著高于第2天的酶活（P0.05），并在第4天达到产酶峰值。对于珍珠岩添加组，发酵时间对CMC酶活影响不显著。图3 FPA酶活变化图Fig.3 FPA cellulase activities at different time points据图3可知，发酵时间对FPA酶活具有显著影响（P0.05），在发酵第8天时，滤纸酶酶活达到最高峰。在沸
29、石添加组中，发酵第8天的FPA酶活与第2、4、6、10天的酶活差异显著（P0.05）。在膨润土添加组，发酵第8天的FPA酶活与第2、4天的酶活差异显著（P0.05）。在珍珠岩添加组中，发酵第4、6、8天的FPA酶活与第2、10天的酶活差异显著（P0.05）。图4 BGL酶活变化图Fig.4 BGL cellulase activities at different time points据图4可知，发酵时间对BGL酶活有显著影响（P0.05）。在沸石添加组中，发酵第8天的BGL酶活与第2、6天的酶活差异显著（P0.05）；在发酵第4天时，BGL酶活达到最高峰。在膨润土添加组中，发酵第4、6、8
30、、10天的BGL酶活与发酵第2天酶活差异显著（P0.05）。在珍珠岩添加组中，BGL酶活在发酵第4天时达到峰值，且发酵第4天BGL酶活与发酵第2、6、8、10天的酶活均差异显著（P0.05）。在发酵第4天时，沸石添加组的BGL酶活与膨润土添加组、珍珠岩添加组的酶活均差异显著（P0.05）。图5 MCC酶活变化图Fig.5 MCC cellulase activities at different time points根据图5可以得出，载体类型、发酵时间均对MCC酶活具有显著影响（P0.05）。在沸石添加组中，发酵第10天的MCC酶活与第2、4、6天的酶活差异显著（P0.05）；在发酵第4天、
31、第8天时，均出现峰值，但第8天的峰值显著高于第4天的峰值（P0.05）。3 讨论纤维素酶作为一种新型饲料添加剂，已成为目前动物饲料生产中的研究热点11。我们将外源纤维素酶添加到猪、禽等单胃动物的饲料中，可以通过改善胃肠道内微生物生态环境，提高胃肠道的消化能力，刺激肠粘膜释放纤维素消化酶，不仅可以有效的解决饲料中粗纤维消化率低的问题，还可以改善动物产品的品质。本试验之所以采用菌糠、花生蔓作为粗纤维添加物，是因为二者在农业生产中的产量相当大，其中大部分以农业生产废物丢弃，不仅浪费还造成一定的环境问题，尤其在山东省突出。瘤胃真菌可以产生一系列的酶，据大量相关研究表明，瘤胃真菌可以产生酶活最高的超级酶
32、，加拿大学者已经成功的从瘤胃真菌中分离到具有超高活性的木聚糖酶，并通过相关的现代化技术手段使之酶活性达到目前市场所有酶活性的7倍12。瘤胃真菌对体外发酵环境要求较低，采用固态发酵便于大规模操作生产、节约生产成本，对场地、设备要求较低。通过本试验探索出一条提高纤维素酶活的新方法，这样就可以将菌糠等农业废弃物变废为宝，以其作为固态发酵的底物大量生产在动物饲料上运用广泛的纤维素酶，提高饲料消化率，改善动物产品品质。由图2、图3、图4、图5对比可知，在发酵第8天时，沸石添加组的酶活值普遍较高；但是部分酶的酶活折线图出现两个峰值，可能与采样、称量等误差有关，亦可能是由于采样时不能保证无氧环境，导致发酵袋
33、中进入空气，致使菌群生长出现应激反应。生物膜技术已在污水治理上得到广泛运用，并取得了理想的效果。该技术主要是使菌体依附在载体上不断生长，形成一层菌膜，可以提高菌体对外界的适应性，迅速繁殖13。本试验创新处在于利用广义上的生物膜技术为瘤胃真菌提供较大的附着表面积，有利于提高对不良环境的适应能力，不仅可以使菌体在培养基中分布更广泛，而且产纤维素酶活较高。生物膜技术可提高产酶活性的机理推测为：一、真菌在载体表面生长形成菌膜层；二、个体间相互联系，形成一个统一的整体来增强对环境的适应性；三、真菌通过形成的菌膜来增加与底物接触的表面积。本试验为以后从事相关科学研究的工作者提供一个参考。4 结论在本试验条
34、件下，载体为沸石、添加量为0.2%、培养8天，CMC、MCC、BGL、FPA活性最高。参考文献：1 张海生,张同亮,陈德兆.纤维素酶对纤维素的作用机理及其在纺织上的应用J.四川纺织技术,2003,（6）:3-5.2 张俊飚,李波.对我国食用菌产业发展的现状与政策思考J.华中农业大学学报(社会科学版),2012,（5）:13-21.3 Paredes C, Medina E, Moral R, et al.Characterization of the Different Organic Matter Fractions of Spent Mushroom Substrate J. Commun
35、ications in Soil Science and Plant Analysis, 2009,40（1-6）:150-161.4 陈君琛,沈恒胜,汤葆莎等.食用菌菌糠再利用技术研究J.中国农学通报.2006,22（11）:410-412.5 朱崇淼.产纤维降解酶厌氧真菌菌株的筛选及其粗酶性质的研究D.江苏南京卫岗,南京农业大学,2003.6 王建,贾斌,郭丽萍.饲用酶制剂中羧甲基纤维素酶等5种酶活力的测定方法研究J.粮食与饲料工业,2006,9:42-44.7 韩友文.饲料常规概略养分分析方案J.饲料博览,2002,（2）:48.8 Lowe S E, Theodorou M K, Tr
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