当归补血汤对糖基化终末产物诱导人脐静脉内皮细胞损伤的研究（可编辑） .doc

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1、当归补血汤对糖基化终末产物诱导人脐静脉内皮细胞损伤的研究 暨南大学硕士学位论文当归补血 汤对糖基化终末产物诱导人脐静脉内皮细胞损伤的研究摘 要 目的: 当归补血汤临床上常用于治疗糖尿病肾病, 能减少蛋白尿, 保护肾功能, 延缓糖尿病肾病的进程, 但其作用机制尚不明确。 本研究用糖基化终末产物诱导人脐静脉内皮细胞损伤, 从细胞膜负电荷、 细胞膜糖蛋白表达和细胞凋亡的角度研究当归补血汤治疗糖尿病肾病的作用机制。方法: 本研究通过超滤膜分离技术结合色谱分析方法, 对当归补血汤的有效成分进行分析,然后利用糖基化终末产物Advanced glycation end products ,AGEs 诱导人脐

2、静脉内皮细胞损伤, 结合阳离子剂阿利新蓝染色、 聚丙烯酰胺凝胶电泳和吖啶橙/ 溴化乙锭荧光染色以及膜联蛋白 V/ 碘化丙啶双染等方法,通过观察当归补血汤对细胞膜负电荷、 细胞膜糖蛋白表达量和细胞凋亡等的影响, 初步探讨当归补血汤的作用机制。结果:1.当归补血汤经高效液相色谱法分析并与混合标准品对照,其主要的 5 个特征峰分别为:1 号阿魏酸;2 号毛蕊异黄酮-7-O- 葡萄糖苷;3 号芒柄花素-7-O-葡萄糖苷; 4 号毛蕊异黄酮;5 号芒柄花素。 22.与正常对照组相比,AGEs 1 、10、10 g/ml 组的 平均光密度均有所降低(P 0.05) ,其中 10g /ml AGEs 组下降

3、更为显著。 3.模型组在给予 10 g/ml AGEs 后,与正常对照组相比,人脐静脉内皮细胞的平均光密度值明显下降 (P0.01) ; 当归补血汤原液组、 当归补血汤超滤液 A组、当归补血汤超滤液 B 组与模型组相比,平均光密度值均升高(P0.05) ,其中当归补血汤原液高剂量组、 当归补血汤超滤液 B 中剂量组平均光密度值显著升高(P0.01);当归补血汤超滤液 A 组、当归补血汤超滤液 B 组与当归补血汤原液组比较,组间无显著性差异(P0.05)。 4. 模型组在给予 10g/ml AGEs 后, 与正常对照组相比, 人脐静脉内皮细胞的 1酸性糖蛋白Alpha-1-acid glycop

4、rotein , AGP 和 抗生物素蛋白Avidin 的表达量I 暨南大学硕士学位论文当归补血 汤对糖基化终末产物诱导人脐静脉内皮细胞损伤的研究明显下降(P0.01); 肝素组与 当 归补血汤 高 剂量组 与模型 组相比 ,AGP 和Avidin 的表达升高(P0.05), 当归补血汤组与阳性对照肝素组间无显著性差异(P0.05)。 5. 模型组12.100.30 在给予 AGEs 刺激 48h 后, 与正常对照组5.160.20相比,细胞出现明显凋亡P0.01 ; 当归 补血汤中、 高剂量组与模型组比较, 细胞凋亡率降低P0.05 。结论 : 1.AGEs 能诱导人脐静脉内皮细胞损伤导致细

5、胞膜负电荷减少。 2.当归补血汤及其超滤液可抑制 AGEs 导致的人脐静脉内皮细胞膜表面负电荷的减少,其主要有效成分为分子量5kDa 的物质。 3.当归补血汤通过上调 AGP 和 Avidin 的表达,有抗 AGEs 引起的细胞膜负电荷减少作用。 4.当归补血汤能够抑制 AGEs 诱 导的人脐静脉内皮细胞细胞凋亡。关键词: 当归补血汤;糖尿病肾病;负电荷;糖基化终末产物;细胞凋亡II 暨南大学硕士学位论文当归补血 汤对糖基化终末产物诱导人脐静脉内皮细胞损伤的研究ABSTRACTObjectives:Danggui Buxue Tang DBT is a common used Traditio

6、nal Chinese Medicine in treating Diabetic Nephropathy while the active components are still unclear. The present studies will investigate that the effects of Danggui Buxue Tang whether a Chinese Medicinal decoction on negative charge to Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVECs and the related m

7、echanism Methods:DBT was isolated and Purified by using ultrafiltration membrane technology on the traditional recipe and analysised by high performance liquid chromatography HPLC.Alcian blue staining was established to evaluate the intensity of negative charge on HUVECs. Proteoglycan expressions of

8、 Alpha-1-acid glycoprotein AGP and avidin were determined by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE. The fluorescence detection with acridine orange/ethidium bromide AO/EB and annexin V/propidium iodide Annexin V/ PI analysis flow cytometry were used to evaluate the effec

9、ts of DBT in HUVECs apoptosis Results:1. Five common peaks in HPLC chromatograms appeared in DBT,compared with mixture standard,there were five peaks: 1,ferulicacid; 2,calycosin-7-O-glucoside; 3,ononin-7-O- glucoside; 4, calycosin; 5, ononin2. The mean optical density of AGEs groups was significantl

10、y lower than that of control group P 0.05, and the group of 10g/ml AGEs was significantly decreased3. The mean optical density of model group was significantly lower than that of control group P 0.01.Mean optical density of groups of DBTL,DBT-AH,III 暨南大学硕士学位论文当归补血 汤对糖基化终末产物诱导人脐静脉内皮细胞损伤的研究DBT-BH were

11、 sharply increased compared with that of model group P 0.05, and the mean optical density of DBTH and DBT-BM groups were significantly increased P 0.054. AGP and avidin are kinds of negatively charge glycoproteins that cover the surface of cells. AGP and avidin expression were significantly decrease

12、d in model group compared with control group P0.01 and significantly increased in DBT H and heparin groups compared with the model group P0.05,but there were no significantly difference in DBT treatment groups compared with the heparin group P 0.055. The apoptosis rate were significantly increased i

13、n model group compared with control group P0.01 and significantly decreased in DBT M group compared with model group P0.05 Conclusions1. AGEs can significantly decrease the negative charge of HUVECs and the dosage of 10g/ml showed a sharply decreased2. DBT can protect the negative charge from AGEs-i

14、nduced damage with the active components which the molecular weight was lower than 5kDa3. DBT can upregulated AGP and avidin expression in HUVECs and induced by AGEs4. DBT can obviously reduce the apoptosis of HUVECs Key words :Danggui Buxue Tang; diabetic nephropathy; AGEs; negative charge; apoptos

15、isIV 暨南大学硕士学位论文当归补血 汤对糖基化终末产物诱导人脐静脉内皮细胞损伤的研究 目录 摘 要I ABSTRACT. III 第一章 综 述. 1 1.1 前言 1 1.2 本课题的 创新点1 1.3 糖尿病肾 病的病理机制2 1.4 糖基化终 末产物的研究9 1.5 糖尿病肾 病的治疗. 11 1.6 当归补血 汤研究概况 13 第二章 实验 方法. 19 2.1 实验材料19 2.2 技术路线21 2.3 当归补血 汤主要成分分析. 22 2.4 糖基化终 末产物对细胞膜负电荷的影响23 2.5 当归补血 汤对细胞膜负电荷的影响 25 2.6 当归补血 汤对糖蛋白表达的影响. 26

16、 2.7 当归补血 汤对细胞凋亡的影响28 2.8 统计学分 析. 30 第三章 实验 结果. 31 3.1 当归补血 汤主要成分 31 3.2 糖基化终 末产物对细胞膜负电荷的影响. 32 3.3 当归补血 汤对细胞膜负电荷的影响 35 3.4 当归补血 汤对糖蛋白表达的影响. 39 3.5 当归补血 汤对细胞凋亡的影响41 讨 论45 结 论49 展 望50 参考文献51 在学期间发表论文清单 58 致 谢59V 暨南大学硕士学位论文当归补血 汤对糖基化终末产物诱导人脐静脉内皮细胞损伤的研究第一章 综 述1.1 前言 糖尿病肾病 Diabetic Nephropathy,DN 即糖尿病肾小

17、球硬化症,是糖尿病常见的慢性微血管并发症之一, 也是终末期肾病的最常见病因及心血管事件的独1立危险因素以及导致糖尿病死亡的主要病因 。DN 以肾 小球基膜增厚和细胞外基质积聚为主要病理变化, 引起弥漫性和结节性肾小球硬化。 早期多无症状, 血压可正常或偏高, 其发生率随着糖尿病的病程延长而增高。 糖尿病早期肾体积增大, 肾小球滤过率增加, 呈高滤过状态, 以后逐渐出现间隙蛋白尿或微量白蛋白尿, 随着病程的延长出现持续蛋白尿、 水肿、 高血压、 肾小球滤过率降低, 进而肾功能不全、 尿毒症。 蛋白尿是肾脏疾病常见的临床表现以及肾功能进行性恶化的原因之一, 也是判断疗效和预后的指标。 糖尿病肾病属

18、于慢性肾脏疾病, 中医药在治疗方面具有明显的优势。 近年来, 治疗该疾病的中药复方不断被运用于临床上, 应用中西医结合治疗已经成为了目前研究的重要方向。 目前, 尚未有切实有效的方法能阻止糖尿病肾病的发生和发展。 但有研究表明, 通过早期有效的药2物治疗可以预防和延缓 DN 的发 生 。 当归补血汤是由黄芪、 当归 5:1 组成的经典方, 基础和临床研究提示当归补血汤可减少蛋白尿, 保护肾功能, 延缓糖尿病肾病的进程, 但其作用机制不明确。本研究通过超滤膜分离技术结合色谱分析方法, 对当归补血汤的有效成分进行分析;然后利用糖基化终末产物诱导人脐静脉内皮细胞损伤,利用阳离子剂染色、电泳和 Ann

19、exin V/ PI 双染等方法,观察当归补血汤对细胞膜负电荷、细胞膜糖蛋白表达量和细胞凋亡等的影响,初步探讨当归补血汤的作用机制。 1.2 本课题的创新 点 以糖基化终末产物诱导人脐静脉内皮细胞损伤为基础, 研究当归补血汤对人脐静脉内皮细胞膜表面负电荷的影响, 试图从肾小球电荷屏障角度对当归补血汤治疗糖尿病肾病的机制作出分析, 为当归补血汤治疗糖尿病肾病的机制提供新的思路。1 暨南大学硕士学位论文当归补血 汤对糖基化终末产物诱导人脐静脉内皮细胞损伤的研究1.3 糖尿病肾病 的 病理机制 1.3.1 糖尿病与糖尿病肾病 随着经济发展和科学技术进步, 人们生活水平和方式发生剧大变化, 糖尿病的发

20、病率呈逐年上升趋势。 在发达国家, 糖尿病已成为严重危害人类健康的第 33位慢性非传染性疾病, 近年来 2 型糖尿病的发病呈现年轻化趋势 。 在发达国家糖尿病已成为导致肾功能衰竭的主要原因; 在发展中国家 DN 的发 病率也不断上升。 西方糖尿病病人有 20%-40% 并发 DN , 而亚洲 60% 糖尿病病人出现微量或大4量蛋白尿 ,DN 的发 生率在不同种族间存在着差异。 已证明严格控制血糖于正常或接近正常可明显改善或预防 DN 的发生和延缓其进展, 但不能完全阻止 DN5的发生发展 。由此可 见,全世界范围内糖尿病发病率正快速增高,DN 患者也迅速增加。 糖尿病肾病给患者带来的严重伤害,

21、 不仅使其生活质量降低, 而且还为国家的经济发展造成严重影响。 1.3.2 糖尿病肾病 病理机制 DN 是欧美 国家导致终末期肾病的首要原因, 严重威胁着患者的生活质量和6生命安全 。 在 DN 发 生时, 肾脏形态和功能发生明显改变, 早期肾小球高滤过,肾脏肥 大, 尿白蛋 白排 泄率增 高 ,肾小球 基底膜增厚,细胞外基质蛋白 如胶原蛋白、 纤维连接蛋白和层粘连蛋白 积聚; 晚期出现大量蛋白尿, 肾小球滤过率、肌酐清除率降低, 出现肾小球硬化和间质纤维化。 上述病理变化始终参与 DN 向7终末期肾病进展的整个过程,但最为关键的是渐进性肾小球硬化 。DN 发病机制复杂, 目前认为 DN 是易

22、感人群在长期高血糖的刺激下, 引起代谢紊乱导致糖基化终末产物、血流动力学、细胞因子、生长因子异常等多种因素综合作用下,引起的细胞异常增殖和细胞外基质异常积聚等一系列病理变化,如下图 Fig 1-1所示:2 暨南大学硕士学位论文当归补血 汤对糖基化终末产物诱导人脐静脉内皮细胞损伤的研究 Fig 1-1. Various mechanisms relevant to hyperglycemia-induced and angiotensin II?induced activation of different signaling pathways with altered expression o

23、f various genes and8 cellular dysfunctions, leading to diabetic nephropathy and chronic renal failure9在众多因素当中, 遗传因素是 DN 发生的启动因素 , 非 遗传因素主要包括细胞凋亡、 代谢、 血流动力学、 细胞因子异常等, 其中代谢异常主要是指糖和 脂肪代谢异常, 这与多元醇通路激活和肌醇代谢紊乱所致糖基化终末产物增多、脂质过氧化物等 因素有关 。 血管紧张素系统是重要的参与因素,调节 DN 的 血流10动力学 , 血管紧张素系统不仅能造成肾小球内高压, 还能影响 DN 的发生和发展。

24、正常情况下, 机体代谢活动能产生活性氧, 活性氧的产生与抗氧化酶及自由11基清除系统保持平衡,高血糖能打破这种平衡 。 3 暨南大学硕士学位论文当归补血 汤对糖基化终末产物诱导人脐静脉内皮细胞损伤的研究1.3.3 细胞凋亡 1.3.3.1 细胞凋亡机制细胞凋亡又称程序性细胞死亡, 在一定的生理或病理条件下, 细胞遵循自身12程序 , 脱落 、 裂解 成 若干凋亡小体被其他细胞吞噬 的过程 。 生理 条件下的 细胞凋亡可发生于胚胎发育的各个时期。 细胞凋亡是维持机体细胞平衡的重要因素之一, 作为一种防御机制, 清除机体危险以及有潜在危险的细胞。 根据细胞类型凋亡可分为两大类,即靶细胞凋亡和淋巴细

25、胞 包括细胞毒性 T 淋 巴细胞、自然杀伤细 胞 等 凋亡。细 胞凋亡特征 : 细胞形态变圆,脱离 周 围 细胞,胞浆浓缩,内质网扩张与细胞膜融合, 核染色质密度增高, 在核膜周边凝聚, 核仁裂解, 胞12膜内陷 , 将细胞 分割 成 多个有膜包裹的 凋亡小体 。 此 过程不发生 线粒体、 溶酶体及细胞膜破裂,不引起周围组织的损伤。 细胞凋亡途径因不同刺激因素而各不相同, 膜死亡受体途径和线粒体途径研究居多,其中“ 线粒体途径” 是最重要的途径之一,Bcl-2 家族蛋白是该途径的关13键调节因素 。Bcl-2 为 B 细胞淋巴瘤/ 白血病 2 基因,Bcl-2 是 一个多基因家族,包括 Bcl

26、-2 、Bcl-x、Bax、Bad 等成员。Bcl-2 是重要的细胞生存基因, 其主要生14理功能是抑制细胞凋亡, 延长细胞寿命 。Bax 为拮抗 Bcl-2 的促凋 亡因子, 具有促进凋亡作用,Bcl-2/Bax 比率直接决定了细胞的存亡。Bcl-2 抗凋亡可能与以13下 几种 机制 有关 : 一是 直接抗氧化 , 干扰过氧化物的产生,抑制氧化应激 诱导的细胞凋亡;二是抑制促凋亡蛋白 Bax 的细胞毒作用;三是维持细胞膜稳定2+ 2+性,Ca 可以激活内源性核内切酶,Bcl-2 通 过改变胞内 Ca 而抑制凋亡;四是抑制促凋亡蛋白产生;五是直接与凋亡蛋白活化因子结合, 阻止凋亡蛋白酶激活。

27、1.3.3.2 细胞凋亡和糖尿病肾病肾脏正常的结构和功能维持有赖于细胞增殖和细胞凋亡之间的平衡。 肾小球硬化的进展取决于肾小球细胞外基质合成与降解、 固有细胞和炎症细胞增生与死亡以及细胞凋亡之间的平衡, 前者决定肾小球细胞外基质是否积聚, 后者决定肾15小球细胞的数量 。 随着对细胞凋亡的基因调控、信号转导及其与疾病关系的16深入研究, 提示细胞凋亡密切参与了 DN 的发 生机制 。 在肾脏生理和疾病状态下,细胞凋亡对调节肾脏细胞数量都起着重要作用, 在 DN 或其他肾脏疾病, 细胞凋亡在早期对清除增生的细胞有利, 晚期则与肾小球的凋亡细胞数目及肾功能4 暨南大学硕士学位论文当归补血 汤对糖基

28、化终末产物诱导人脐静脉内皮细胞损伤的研究17恶化密切相关 。DN 早期肾小球细胞增生伴细胞外基质增多, 随病程发展, 肾脏实质细胞 (肾小球固有细胞和肾小管上皮细胞) 逐渐减少, 细胞外基质逐渐递18增,导致 肾小球硬化。 在整个 DN 发生和发展的病程中伴有细胞凋亡数的增加 ,随着凋亡细胞增多, 蛋白尿程度加重、 肾功能恶化, 提示细胞凋亡可能是导致肾15小球硬化、肾功能损害的原因之一 。 在 DN 肾小 球系膜细胞基质的产生过程中, 肾小球系膜细胞的增殖与凋亡之间失衡,肾小球对细胞凋亡的抑制增强,导致细胞过度增殖和细胞外基质增加,从而引起细胞坏死和间质纤维化, 最终导致肾脏功能衰竭。 肾间

29、质成纤维细胞异常增殖与凋亡可能参与肾间质纤维化的发生。DN 晚期, 细胞凋亡数与肾功能恶化程度成正比, 对于 DN 的治疗 需要控制细胞凋亡与细胞增殖之间的平衡,在DN 进展过 程中, 过度的细胞凋亡可以通过阻断肾素- 血管紧张素系统而得以控制19。 肾小 球硬化所涉及的凋亡细胞 包括 有浸润到肾小球的炎症细胞和肾小球固18有细胞等 。 细胞凋亡与早期 DN 的 发生有着密不可分的关系, 机制可能是高血糖造成血浆渗透压增高,导致 Bax 凋亡调控基因的改变,高血糖下大鼠肾皮质细胞凋亡的增加可能由 Fas 介 导。DM 大鼠 Fas/Fas-L 表达增加,同时伴凋亡细胞增加/肾小球细胞外基质增多

30、、 蛋白尿程度加重以及肾功能恶化, 表明肾脏的 Fas/Fas-L13系统参与了 DM 肾脏细胞凋亡的调控, Fas/Fas-L 的表达 与细胞凋亡呈正相关 。20研究发现 ,Bax 在肾小球和肾小管均有表达, 而 Bcl-2 主要在肾小管表达, 糖尿病大鼠的 Bax、Bcl-2 蛋白和 mRNA 的表达显著增强,随着病程延长,肾功能 逐渐 恶化 , 凋亡 细胞逐渐 增多 ,Bax 表达逐渐 增强 ,Bcl-2 表达逐 渐减弱 ,Bax/Bcl-2 比增加,肾小球、肾小管的凋亡细胞数与 Bax/Bcl-2 比呈 正相关,说明 Bcl-2 基因家 族参 与了糖 尿病 时肾脏 细胞 凋亡的 调控

31、。高糖 状态 下 细 胞 凋亡增加, Bax 基因 mRNA 水平相对增高, Bcl-2 和 Bcl-x 基因表达下调, 然而用 D-甘露醇 造成 高渗状 态则 无此现 象 , 说明高 糖 抑制 凋亡 调节 基因 Bcl-2 的表 达 ,促进 Bax 基因表达的上调,提示高糖状态改变了凋亡调节基因的表达,诱导细21胞凋亡的发生,促进 DN 的发生 发展 。5 暨南大学硕士学位论文当归补血 汤对糖基化终末产物诱导人脐静脉内皮细胞损伤的研究1.3.4 肾小球滤过屏障 1.3.4.1 肾小球滤过屏障结构 肾小球滤过屏障也称为肾小球滤过膜,传统观点认为肾小球滤 过 屏 障Glomerular filt

32、ration barrier , GFB 由内 向外由内 皮细胞、 肾小球基 底 膜Glomerular basement membrane ,GBM 以及足细胞三层结构组成。最新发现内皮细胞表层Endothelial surface layer ,ESL 参与肾小球滤过膜的组成, 对肾小球22滤过功能具有重要影响 。肾小球 滤过膜结构如下图 Fig.1-2 所示:Fig.1-2 Schematic drawing of the glomerular barrier.Podo, podocytes; GBM, glomerular basement membrane;Endo, fenestr

33、ated endothelial cells; ESL, endothelial cell surface layer 22often referred to as the glycocalyx 肾小球滤过膜是肾小球选择性滤过功能的物质结构基础, 对保持机体内环境的稳态发挥重要的作用。 肾小球滤过屏障对血液进行超滤使其在肾小囊内形成原尿。 在超滤过程中, 低分子量及带正电荷的物质较易通过滤过屏障, 而大分子和带负电荷的物质, 特别是大部分的血浆蛋白基本上不能滤过。 滤过屏障各层结构共同发挥作用以维持肾小球滤过膜的完整性, 其中, 任何一层结构受到破坏都会导致滤过屏障完整性受到影响, 从而产生蛋

34、白尿, 滤过屏障完整性破坏是以蛋白尿为主要表现的肾小球疾病共同机制。 1.3.4.2 肾小球 电荷屏障 肾小球毛细血管内皮细胞表层、 足细胞表面以及基底膜有带负电荷的多糖蛋白复合物覆盖 如图 Fig.1-3 。 多糖 蛋白复合物由内皮细胞分泌, 是构 成肾小球滤22过膜 电荷屏障 的 物质基础 。细 胞表面的多糖蛋白复合物是 包括 蛋白多糖、糖6 暨南大学硕士学位论文当归补血 汤对糖基化终末产物诱导人脐静脉内皮细胞损伤的研究蛋白、 糖胺多糖、 血浆蛋白、 硫酸肝素、 硫酸软骨素及皮肤素等物质。 肾小球 内皮细胞表层是指覆盖于肾小球内皮细胞、 窗孔表面的多糖蛋白复合物以及附着的22部分血浆蛋白,

35、 其实质就是多糖蛋白复合物 。GBM 中 蛋白多糖以硫酸肝素蛋白聚糖 Heparan sulfate proteoglycan,HSPG 为主,分布于外疏松层,核心多糖和硫酸肝素链构成了 HSPG ,其侧 链是由硫酸肝素和硫酸软骨素及皮肤素组成。GBM 中 HSPG 的基质 蛋白核心包括基膜蛋白聚糖、 集聚蛋白、 胶原 XV III,随着肾单位的发育,GBM 中基膜蛋白聚糖、 胶原 XV III 减少, 而 集聚蛋白表达增加, 构成 GBM 中主要的 HSPG 。 蛋白多糖是 ESL 的 中心蛋白, 有研究认为 GBM 电荷屏障的主要组分是集聚蛋白相连的 HSPG ,HSPG 的 减少是蛋白尿

36、产生的原因。 肾脏蛋白尿的发生过程中,HSPG 不仅仅是依赖于其负电荷作用, 还因为硫23酸肝素 介导足细胞与基膜黏附、结合并 介 导 生长因子信号 转导 等 作用 。 肾小球滤过膜通过表面的负电荷和孔径筛网结构发挥电荷屏障和机械屏障的功能。Fig.1-3 Schematic drawing of the glomerular barrier with components of the glomerular endothelium and the endothelial cell surface coat ESL ;Endotheliual Cell ;Glomerular 22Baseme

37、nt Membrane ;Podocyte; Glysocalyx多糖蛋白复合物是滤过膜电荷选择通透性的物质基础。 这些多糖蛋白复合物由内皮细 胞 自身合成 分 泌,并结 合 于细胞膜 表 面或填充 于 内皮窗孔 间 形成网 塞24。 电荷屏 障通过同性电荷相斥的原理, 阻止带有负电荷的物质 如白蛋白 通过,允许带有正电荷的物质通过。 血浆白蛋白带负电荷, 在正常情况下, 白蛋白受到7 暨南大学硕士学位论文当归补血 汤对糖基化终末产物诱导人脐静脉内皮细胞损伤的研究电荷屏障的排斥, 不易通过滤过屏障。 在病理状态下, 滤过屏障电荷丢失时, 尿中的蛋白质排除量明显增加。 此外, 滤过膜的负电荷在维

38、持上皮细胞足突和保持25肾小球正常结构也起着重要作用 。1.3.5 负电荷与蛋白尿 细胞膜表面的各种糖蛋白和蛋白聚糖等多糖蛋白复合物带有大量的负电荷,通过与细胞外的带电粒子发生作用, 在膜外形成一定厚度的负电荷层,如 Fig.1-4所示:Fig.1-4 The negative charge distribution of glomerular filtration membrane.Endotheliual cell END ; Lamina densa of glomerular basement membraneLD ; Podocyte ; Glysocalyx ;Epithelial

39、 cellE 此图片来自 eylshen蛋白尿与电荷屏障的负电荷量的变化密切相关。HSPG 经 肝素酶 III 或人肝素酶选择性裂解后, 使内皮细胞的对白蛋白通透性增加, 而电荷阻力无变化, 提26示 ESL 特 别是 HSPG 在肾小球滤过中起着重要作用 。 多糖蛋白复合物对维持血管的通透性起重要作用, 用透明质酸酶处理后, 多糖蛋白的厚度减少, 血管渗27透性 增加 ,血管周围 出现 水 肿 。 糖尿病 患者 产生蛋白尿的主要原因 是由于 肾小球内皮细胞受损, 导致其合成多糖蛋白复合物的能力下降, 从而使内皮细胞所带负电荷下降; 经透明质酸和硫酸软骨素酶处理后的小鼠, 白蛋白的滤过率增加,

40、肾小球滤过膜表面的负电荷显著减少, 而且肾小球细胞结构在酶处理后发现无任8 暨南大学硕士学位论文当归补血 汤对糖基化终末产物诱导人脐静脉内皮细胞损伤的研究何损害,认为酶降解了细胞表面的多糖蛋白复合物, 而且已证实胎牛肾小球内皮28细胞可产生带负电荷的蛋白多糖,包括肝素、软骨素、硫酸皮肤素 等 。 另有研究发现, 红细胞膜电荷的减少与 DN 病人 尿蛋白的增加有关, 之后证实, 肾病29-30 31-32综合征时机体多种细胞的生物膜电荷均有丢失 。 陈氏等 发现, 在肾病综合征中,肾小球滤过膜负电荷变化与红细胞膜负电荷的变化有关而且呈正相关,且二者的负电荷均与尿蛋白排泄量呈负相关, 为进一步证实

41、, 测定了肾病综合征患儿红细胞负电荷及肾小球多阴离子含量以及两种生物膜电荷变化的关系。 结果表明, 红细胞负电荷与疾病的活动情况有关, 其负电荷量明显下降, 肾小球多阴离子量也显著下降并与红细胞负电荷的变化平行, 认为, 在肾病蛋白尿的发生中肾小球负电荷的变化起了重要作用。 以上研究表明, 肾小球滤过膜负电荷与肾小球疾病的发病机制密切相关。 因而, 研究肾小球细胞负电荷的机制和临床的关系具有重要的意义。 检测电荷屏障的方法有阳离子染色法、 免疫组织化学法、 生物化学测定法、 同位素法等。 阿利新蓝是从植物中提取的含有铜离子的阳离子染料,分子量为 500Da , 带有 多个正电荷, 能与细胞表面

42、的负电荷结合, 是一种研究细30胞膜表面负电荷的常用染色方法 。 1.4 糖基化终末产 物的研究 1.4.1 糖基化终 末 产物的形成与特性 糖基化终末产物Advanced glycation endproducts ,AGEs 是持续高血糖引起的体内蛋白质、 脂质、 核酸等大分子非酶糖基化反应 (Maillard 反应 ) 的终末期产物。 在生理条件下, 机体组织 AGEs 含量低, 在糖尿病中高血糖和氧化应激作用下, 糖基化反应显著加速,AGEs 形成明显增加, 与 DN 等慢性并发症密切相33关 。自从 在糖尿病患者的血液当中发现糖化血红蛋白 HbA1c 后,认为体内有33Maillar

43、d 反应发生 。AGEs 在体 内产生是一个必然的过程,AGEs 形成过程复杂, 糖基化反应分为两个阶段, 早期阶段: 在无酶的条件下, 葡萄糖分子游离 醛基和蛋白质、氨基酸残基结合,迅速生成不稳定的中间产物醛亚胺即 Schiff 碱;经结构重排, 形成性质稳定的 Amadori 产物; 晚期阶段:Amadori 产物经过多步脱水和分 子 重排产生 羰 基化合物 即 羰基代谢 中 间体化合 物 ,最后形 成 不可 逆 的AGEs 。AGEs 的形 成 受 蛋白 寿命 长短、 血糖 浓度以 及高 血糖持 续时 间等因 素 影9 暨南大学硕士学位论文当归补血 汤对糖基化终末产物诱导人脐静脉内皮细胞

44、损伤的研究响。 整个人体碳水化合物, 脂类和氨基酸代谢不断产生的活性羰基化合物, 所有大量这些物质都是体内 AGEs 的 前体。 氧化应激反应能增加活性羰基化合物的生34成,可通过糖氧化和抗坏血酸,微生物氧化作用,糖酵解等过程产生 。 AGEs 对蛋 白质、脂质、核酸的修饰作用是不可逆的,AGEs 存在很广泛,呈棕褐色、 具有荧光性、 特殊的吸收光谱、 交联性、 对酶稳定不易被降解、 且 有结构的异质性, 具有至少一个共同的结构成分和共同的抗原决定簇, 能与多种细34胞膜表面的特异性受体结合发挥生物学效应 。 正因为 AGEs 具有以上特性, 故其沉积于组织后能引起一系列病理生理变化,导致细胞

45、组织的损伤。1.4.2 糖基化终 末 产物的 作用 高血糖状态下, 机体多数蛋白质均可发生 Maillard 反应, 导致蛋白质结构和理化特性改变, 从而影响蛋白质的功能。AGEs 修饰的蛋白对蛋白水解作用有高度抵抗性, 其溶解度下降, 使组织结构发生改变。 半衰期越长的蛋白质, 如基质35和组织结构蛋白等, 越易被 AGEs 修饰 。 血 红蛋白发生非酶糖基化变成糖化血红蛋白, 使血红蛋白和氧的亲和力下降。AGEs 与体内物质代谢相随而生, 在机体生理的老化过程中形成, 随着老化过程即年龄的增长而生成增多, 在各种与年龄相关的慢性疾病如糖尿病、 动脉粥样硬化、 阿尔茨海默氏症和肾功能衰竭等疾

46、病中蓄积增加。AGEs 通过直接作用和间接作用损伤机体组织, 其直接作用,导致组织结构完整性受到改变和破坏。AGEs 主 要通过间接作用即受体介导途径对多种细胞、基质、脂质等造成损伤,与其受体结合参与血管和肾脏疾病的发病,且与氧化应激关系密切。AGEs 特 定受体存在于多种细胞表面, 它与 AGEs 的吸36收和清除以及细胞活性的调节有关 。 在所有 与 AGEs 结合的蛋白中,AGEs 的受体即 RAGE 最广为人知,AGEs 与 RAGE 结合,经过一系列信号转导通路造成组织损伤,通过 趋化和活化单核巨噬细胞、激活核转录因子-B 、促 进 生长 因37子和细胞因子的合成以及诱导氧化应激等途径造成组织细胞损伤 。 RAGE 与高血糖与和机体状态有关如在糖尿病, 肾功能衰竭, 炎症反应时,RAGE 表达增加37。 10 暨南大学硕士学位论文当归补血 汤对糖基化终末产物诱导人脐静脉内皮细胞损伤的研究1.4.3 糖基化终 末 产物和 糖尿病肾病 AGEs 主要 在肾脏代谢, 肾脏在 AGEs 的代谢中发挥着重要作用, 相对分子质量较低的 AGEs 肽 (AGEs 的 降解