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1、昆布多糖对 LOVO 细胞凋亡过程中 caspase-9、caspase-3、caspase-6 活性的影响孙蓉1,2,3，汲晨锋1,2,3，高世勇1,2,3，邹翔1,2,3，季宇彬1,2,35（1. 哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心，哈尔滨 150076；2. 国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心，哈尔滨 150076；3. 哈尔滨商业大学药物所博士后科研工作站，哈尔滨 150076） 摘要：目的：探讨昆布多糖对人结肠癌 LoVo 细胞增殖的影响以及凋亡相关的半胱氨酸天门 冬氨酸蛋白酶 9、3、6(Caspase-9、Caspase-3、Caspase-6)活性的变化。方法：分别以不
2、同浓10度的昆布多糖处理 LoVo 细胞，采用 Hoechst 33258 染色在荧光倒置显微镜下观察细胞形态 变化；Caspase-9、Caspase-3、Caspase-6 活性检测试剂盒检测 Caspase-9、Caspase-3、Caspase-6 活性。结果：昆布多糖作用 LoVo 细胞 72h 后，随着昆布多糖浓度的增高(400，800，1600g/mL)，凋亡的细胞数也随之增加。昆布多糖作用 LoVo 细胞 24h 后，随着昆布多糖浓度的增高(400，800，1600g/mL)，Caspase-9、Caspase-3、Caspase-6 的活性逐渐升高并存在15剂量依赖性(P0.
3、05)。结论：昆布多糖具有明显的诱导细胞凋亡的作用，且伴随 Caspase-9、 Caspase-3、Caspase-6 活性升高通过 Caspase 信号传导通路诱导 LoVo 细胞凋亡。 关键词：昆布多糖；LoVo 细胞；Caspase；细胞凋亡中图分类号：Q28520Study on the effect induced by Laminaria on caspase-9 , caspase-3 and caspase-6 in LOVO apoptosis prosessSun Rong1,2,3, JI Chenfeng1,2,3, GAO Shiyong1,2,3, ZOU Xia
4、ng1,2,3, JI Yubin1,2,3 (1. Center of Research on Life Sciences and Environmental Sciences, Harbin University of Commerce, Harbin, 150076;252. Engineering Research Center of Natural Anticancer Drugs, Ministry of Education, Harbin, 150076;3. Postdoctoral Research Station of Institute of Medicine, Harb
5、in University of Commerce, Harbin,150076)Abstract: In this paper we investigated the effect of Laminaria on proliferation of human colon cancerLoVo cell and activity of apoptosis-related Caspase 9,3,6 (Caspase-9,Caspase-3,Caspase-6). LoVo30cells were treated under different concentrations of laminar
6、in and dyed by Hoechst 33258 staining, observed under fluorescence microscope ; Caspase-9,Caspase-3, Caspase-6 activity assay kit was used to determine Caspase-9,Caspase-3,Caspase-6 activity. Results showed that after 72h,with the laminarin concentration increased (400,800,1600 g/mL), apoptotic cell
7、s also increased. Laminarin role in LoVo cells after 24h, with the laminarin concentration increased , Caspase-9,Caspase-3,Caspase-6 activity35increased gradually and in a dose dependent manner (P0.05). Laminarin significantly induce apoptosis,and with Caspase-9,Caspase-3,Caspase-6 activity increase
8、d Caspase signaling pathwaysinduced by LoVo cells.Key words: Laminaria; LoVo cells; Caspase; apoptosis400引言昆布（Ecklonia kurome Okam.）是褐藻的一种，主要成分为多糖、脂肪、纤维素、天然 蛋白质、矿物质和核酸等。昆布多糖又称褐藻淀粉，在海带中的含量约为 1%。具有较强的 免疫调节活性及明显的抗肿瘤的作用1。国外，尤其是日本对从褐藻中提取的岩藻聚糖的抗基金项目：教育部博士点基金（20070240081）作者简介：孙蓉，女，教授，活性药物研究. E-mail: smilej
9、cf001肿瘤活性做了很多研究，结果表明无论在抗增生，增强免疫功能还是抗肿瘤转移方面都表现45出很强的抗肿瘤活性2。 用体外细胞的培养技术进行药效学研究能稳定、方便、经济地进行药物筛选；准确地选择药物作用的靶位；稳定地控制药物作用时间、剂量和其它条件；将实验药物直接加入到细 胞中，使之直接作用于细胞，容易区分药物的直接作用和体内的间接作用。荧光显微镜，能 不同程度地观察到细胞凋亡的变化。细胞凋亡除染色质发生变化外，其亚结构也出现相应的50变化，如：核破裂凋亡小体形成等。Caspase 是一种特异性的蛋白酶，由于执行细胞凋亡而受到学者的广泛关注。Caspase8、 Caspase-3、Caspa
10、se-7 都属于 caspase 家族的主要成员，而且在凋亡过程中起到很重要的作用 3。在各种细胞凋亡信号的刺激下，由细胞色素 c 激活 Caspase-9，进一步激活下游的 Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7，最终诱导细胞凋亡4,5。55本实验探讨昆布多糖诱导 LoVo 细胞凋亡的作用及对 Caspase-9、Caspase-3、Caspase-6活性的影响，为阐明昆布多糖诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制提供理论依据。1材料与方法1.1主要试剂LoVo 细胞株由本实验室保存；DMEM 培养液购自 HyClone 公司；胎牛血清购自杭州四60季青生物工程材料有限公司；昆布多糖
11、（纯度 98.5%）购自 Sigma 公司；羟基喜树碱（HCPT） 购于哈尔滨圣泰药业，批号 20080930；Hoechst 33258 染色液购自 Sigma 公司；Caspase-9、 Caspase-3、Caspase-6 活性检测试剂盒购自碧云天生物公司；考马斯亮蓝试剂盒购于南京建 成试剂公司；CO-150 CO2 培养箱为美国 NBS 公司产品；倒置显微镜为日本 Olympus 公司产 品；酶标仪为美国 Bio-Rad 公司产品；DL-CJ-1N 超净工作台为北京东联哈尔仪器制造有限65公司产品； -80 冰箱为 日本 SANYO 公 司 产品； Allegra 64R 冷冻离 心
12、机为 美国 BECK-MAN-COULTER 公司产品；P 型移液器为法国吉尔森公司产品。1.2细胞传代培养细胞生长至高密度（90%融合）时，吸去原培养液，用 PBS 洗涤细胞 2 次，加 1mL 胰酶 (0.25%)后，在倒置显微镜下观察，当一半以上的细胞呈现圆粒状时，弃胰酶，加入 2mL 含7010%胎牛血清的 DMEM 培养液，用吸管将细胞从培养瓶壁吹下，并混合均匀，按 1：4 至 1：6 的比例转移至新培养瓶后，加适量含 10%胎牛血清的 DMEM 培养液，置于 37、5%CO2 培养箱 中培养。1.3给药处理1.3.1荧光显微镜观察昆布多糖对 LoVo 细胞形态的影响75将对数生长期
13、细胞接种于 100mL 培养瓶中培养，每瓶加 3mL，细胞浓度为 3105 个/mL， 以每孔 1mL 接种于已放入盖玻片的 6 孔板中，放在 37、CO2 培养箱中培养。培养 24h 后， 每孔加 1mL 的药液，每孔总液体量为 2mL，昆布多糖的浓度分别为 400，800，1600mg/L， 阳性药 HCPT 的浓度为 5mg/L，空白对照组每孔加 1mL 的 DMEM 培养液，置于 37、5%CO2 培养箱中培养。801.3.2昆布多糖对 LoVo 细胞凋亡过程中 Caspase9、Caspase-3、Caspase-6 活性的影响 将对数生长期细胞接种于 100mL 培养瓶中培养，每瓶
14、加 3mL，细胞浓度为 3106 个/mL，置于 37，5%CO2 湿化的培养箱中培养，24h 后给药组每瓶加入不同浓度的昆布多糖各 3mL，使药物中浓度分别为 400、800、1600mg/L。阴性对照组，加 DMEM 培养基 3mL。每个剂量组设 3 瓶作为平行样，置 37、5%湿化的 CO2 培养箱中分别继续培养 24h。851.4实验方法1.4.1LoVo 细胞形态观察药物作用 72h 后，吸去培养液，用 PBS 洗贴壁细胞 1 次，每孔加 800L 固定液（甲醇： 冰醋酸=3：1），4放置 60min，弃固定液，用 PBS 洗，加 Hoechst 33258 染色液，37避 光孵育
15、30min 后，取出盖玻片，用滤纸吸干底部后，在荧光显微镜下观察。901.4.2Caspase-9、3、6 相对活性的测定实验步骤按照试剂盒的说明书进行操作。1.5统计学处理采用统计学软件 SPSS 15.0 统计分析软件处理数据，所有数值采用均值标准差( x s) 表示，两组间比较采用 t 检验，P0.05，差异有统计学意义。952结果1002.1荧光显微镜观察昆布多糖对 LoVo 细胞形态的影响荧光显微镜下对各剂量组细胞进行观察的结果，由图 1 可以看出空白对照组细胞界限清 晰，细胞核呈现弥散均匀荧光；昆布多糖作用于 LoVo 细胞 72h 后，随着昆布多糖浓度的增 加，细胞凋亡量也不断加
16、大，凋亡细胞特征形态明显。低剂量组细胞形态不整齐，部分细胞 胞核染色质分布不均匀；中剂量组细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒状荧光，细胞的凋 亡小体逐渐增多；当昆布多糖达到最大浓度时细胞数量很少，多数细胞死亡，并呈现大量凋 亡形态。阳性对照组有明显的凋亡小体出现。105A. control groupB.LoVo cells treated with 400 mg/LC.LoVo cells treated with 800 mg/LD.LoVo cells treated with 1600 mg/L110115E. LoVo cells treated with HCPT图 1 荧光显微镜
17、对 LoVo 细胞凋亡形态的观察（400）Fig. 1 Morphological appearance of LoVo cells by fluorescence detection（400）2.2昆布多糖对 LoVo 细胞凋亡过程中 Caspase9、Caspase-3、Caspase-6 活性的影响2.2.1昆布多糖对 Caspase-9 活性的影响浓度为 400、800、1600g/mL 的昆布多糖对 LoVo 细胞作用 24h 后，Caspase-9 相对活 性分别为 117.28%、276.41%、387.06%，与阴性对照组比较有显著性差异（P0.01）。表 1 昆布多糖作用 2
18、4 h 后 LoVo 细胞中 caspase-9 的相对活性( x s) Tab. 1 Effect of Laminaria on Caspase-9 activity of LoVo cells at 24hGroupsDose(g/mL)OD value( x s) pNA value(mM)Caspase-9activity (%)Control 0.0480.003 13.14 HCPT 5 0.0680.006* 22.23 69.18400 0.0530.005* 15.41 17.28Laminaria800 0.0990.004* 36.32 176.411600 0.131
19、0.003* 50.86 287.06与空白组比较*P0.011201252.2.2昆布多糖对 Caspase-3 活性的影响浓度为 400、800、1600mg/L 的昆布多糖对 LoVo 细胞作用 24h 后 Caspase-3 的相对活性 随着药物浓度的升高而升高，Caspase-3 相对活性分别为 202.84%、215.77%、222.92%，与 阴性对照组比较有显著性差异（P0.01）。表 2 昆布多糖作用 24h 后 LoVo 细胞中 Caspase-3 的相对活性( x s) Tab. 2 Effect of Laminaria on Caspase-3 activity of
20、 LoVo cells at 24h130GroupsDose(g/mL)OD value( x s) pNA value(mM)Caspase-3activity (%)Control 0.0850.003 28.53 135140HCPT 5 0.1220.006* 43.67 153.06Laminaria 400 0.0870.005* 29.34 102.84800 0.0960.004* 33.03 115.771600 0.1010.003* 35.07 122.92145与空白组比较*P0.011502.2.3昆布多糖对 Caspase-6 活性的影响浓度为 400、800、1
21、600g/mL 的昆布多糖对 LoVo 细胞作用 24h 后，Caspase-6 相对活 性分别为 137.04%、253.77%、383.49%，与阴性对照组比较有显著性差异（P0.01）。表 3 昆布多糖作用 24h 后 LoVo 细胞中 Caspase-6 的相对活性( x s) Tab. 3 Effect of Laminaria on Caspase-6 activity of LoVo cells at 24hGroupsDose(g/mL)ODvalue( x s)pNAvalue(mM)Caspase-6activity (%)Control 0.1270.003 49.06
22、HCPT 5 0.2050.006* 84.5 72.24Laminaria 400 0.1670.005* 67.23 37.04800 0.2930.004* 124.5 153.771600 0.4330.003* 188.14 283.49与空白组比较*P0.011551601651701753讨论采用 Hoechst 33258 染色，荧光显微镜下观察不同浓度昆布多糖作用于 LoVo 细胞 72h 后，随着昆布多糖浓度的增加，细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒状荧光，细胞的凋亡 小体逐渐增多，说明昆布多糖有诱导 LoVo 细胞凋亡的作用。Caspase 是存在于胞质溶胶中的半胱氨酸蛋
23、白酶，这些酶类的一个重要共同点是能够特异性 地剪切天冬氨酸残基后的肽键，进而诱导细胞凋亡6。Caspase 的激活途径目前研究得出， 可以有 2 种途径：一种途径是死亡信号与 Caspase-8 结合后，使 Caspase-8 自我水解活化后， 再激活 Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7 等。Lamins、Gas2，Actin，Fodrin 等，为细胞骨架 和结构蛋白，都是 Caspase 的底物，Caspase-6 作用于 Lamin-A 后会导致核塌陷；Caspase-3作用于 Gas2，Actin，Fodrin 后，使细胞发生膜皱缩、凋亡小体出现等形态学的改变；R
24、ock-1 被 Caspase-3 活化后将引起凋亡细胞形态学改变；Caspase-3 将 Acinus 剪切成为一个 23kDa 的片段，可以引起染色质聚集；Caspase-3 能够灭活 ICAD，使其不能发挥它对 CAD 的抑制 作用，CAD 从胞浆中进入胞核，降解 DNA；PARP 是 DNA 修复酶，被 Caspase-3 和 Caspase-7 剪切后，失去了对 DNA 的修复功能，引起 DNA 的降解，诱导细胞凋亡；另一条途径是由 细胞色素 c 激活 Caspase-9，然后再激活其它 Caspases，进而导致细胞凋亡7，8。在正常状况 下，细胞质中的 Caspase-8 和 C
25、aspase-3 它们是以没有活性的酶原讯在于胞质中，只有当细 胞收到凋亡刺激时，它们会被一系列反应激活，诱导细胞发生凋亡9。本实验中 Caspase-9， Caspase-3，Caspase-7 活性与凋亡的程度呈正相关，与上述报道一致，说明 Caspase 级联机 制是昆布多糖诱导人结肠癌肿瘤细胞凋亡的重要途径。通过对 Caspase-6 活性测定，可以进一步了解肿瘤发生、发展的特点，这一作用机制的明确为昆布多糖的进一步实验研究和临床 应用提供了重要的理论指导和实验依据。参考文献 (References)1801851901 YAMAMOTO I. Laminaria and health
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