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1、2014届本科毕业论文(设计)棉花根际土壤中拮抗大丽轮枝菌芽孢菌筛选及鉴定学 院：生命科学学院专业班级：生物科学10-2班学生姓名：毛云指导教师：赵惠新答辩日期：2014年5月17日新疆师范大学教务处 目 录1 引言11.1 棉花黄萎病的分布和危害11.2 生物防治的概念11.3 枯草芽孢杆菌与黄萎病的关系21.4 拮抗细菌的作用机制21.5 棉花黄萎病生物防治存在的问题和展望22 材料43 方法43.1 土壤中芽孢菌的分离纯化实验43.2 拮抗实验43.2.1 大丽轮枝菌的扩大培养43.2.2 大丽轮枝菌拮抗芽孢菌的筛选43.2.3 拮抗菌保存实验53.2.4 芽孢菌的胞内胞外拮抗实验53.
2、3 菌株的革兰氏染色实验53.4 拮抗菌的生理生化鉴定实验53.4.1 淀粉水解的测定53.4.2 明胶液化53.5 分子鉴定实验63.5.1 拮抗菌菌体的提取63.5.2 拮抗菌的测序63.5.3 拮抗菌的分析64 实验结果与分析74.1 土壤中芽孢菌的分离与纯化74.2 棉花黄萎病拮抗菌的筛选74.3 棉花黄萎病拮抗细菌的鉴定结果104.3.1 菌落特点104.3.2 革兰氏染色结果114.3.3 拮抗菌的生理生化鉴定114.3.4 拮抗菌分子坚定结果115 鉴定结果12讨论13参考文献14附录15致谢21棉花根际土壤中拮抗大丽轮枝菌芽孢菌筛选及鉴定摘要：大丽轮枝菌(Verticilliu
3、mdahaliaeKleb )引起的的棉花黄萎病是棉花的主要病害，对棉花生产危害极大。该病为土传真菌病害，防治难度大，目前主要采取选育抗病品种为主的综合治理措施，但由于缺乏理想的高抗丰产品种和有效药剂，生物防治日益受到重视。为了寻找生防菌株资源，进而研制开发防治棉花黄萎病的新型生防制剂，本论文对棉花黄萎病菌拮抗微生物的筛选、鉴定及拮抗作用进行了研究。从连作棉田采集土样，经室内分离共获得细菌32株，经室内初步平皿对峙试验，发现其中有6株细菌菌株对大丽轮枝菌具有很强的抑制作用。参照常见细菌鉴定手册，对细菌菌株的形态特征观察，生理生化试验及16SrDNA鉴定，最终该菌株鉴定为短小芽孢杆菌。关键词：棉
4、花黄萎病；大丽轮枝菌；拮抗作用；生物防治Cotton rhizosphere soil dahlia wheel branch bacteria antagonism spore bacteria screening and identificationAbstract：By dahlia wheel branch bacteria (VerticilliumdahaliaeKleb) caused by Verticillium wilt of cotton is one of the main problems of the cotton, the great harm of cotton
5、 production. The disease for soil fungi disease,the prevention and control is very difficult,at present the main breeding disease-resistant varieties mainly comprehensive control measures,but because of the lack of ideal varieties of high fertility and effective drugs, Biological control is becoming
6、 more and more attention, In search of bio-control strain resources, further research and development of new bio-control agents, prevention and control of cotton verticillium wilt of cotton verticillium wilt fungus antagonist microbial this paper screening, identification and antagonism effect were
7、studied. From cotton continuous cropping soil samples collected, through indoor separation, a total of 400 strains bacteria strains,With cotton verticillium wilt pathogens. Strain for target strain, Primary AGAR confrontation by the indoor test, Found that there are 6 strains of bacteria strains whi
8、ch have a strong inhibitory effect. Manual provided by common bacteria identification of bacterial strains morphology observation, physiological and biochemical test and appraisal of 16 SrDNA, eventually the strain identified as Bacillus pumilus.Key words:cotton verticillium wilt fungus; Dahlia whee
9、l branch bacteria;Antagonism effect; Biocontrol1 引言1.1 棉花黄萎病的分布和危害棉花黄萎病（VerticilliumdahliaeKleb）是继棉花枯萎病之后人们发现的又一重要棉花病害。该病是一种土传性的维管束系统病害，广泛分布于世界五大洲的各产棉区。1914 年，Carpenter 首次报道在美国弗吉尼亚州发现棉花黄萎病，随后在密西西比、阿肯色、得克萨斯、新墨西哥和加利福尼亚等洲陆续报道了黄萎病的发生和危害情况。目前，这一病害已遍布美国、秘鲁、巴西、阿根廷、委内瑞拉、前苏联和中国等地1。其中，在美国、原苏联和中国等地该病的发生及造成的损失尤
10、为严重2,3。我国棉花黄萎病是自1935 年由引进美国棉花品种而传入，先后在陕西泾阳、山西运城、山东高密和河南安阳等地发生危害。1973 年进行的全国普查，我国的枯、黄萎病发病面积33.33 余万公顷，1978 年为56.67 万公顷，1982 年枯、黄萎病发病面积达148.2 万公顷，占当年植棉总面积的31.26%，其中纯黄萎病田面积为13 万公顷，占病田面积的8.7%。截止上世纪80 年代末，我国棉花黄萎病分布已遍及18 个省（市、自治区）478 个县（市）。进入90 年代，黄萎病的发生有加重的趋势，发生范围也日趋扩大。1993 年是我国棉花黄萎病大发生的一年，全国发病面积270 万公顷，
11、遍及各主要产棉区，损失人民币10亿元。其中北方棉区爆发成灾的程度更重，重病棉田棉花病株率在80%以上，其中落叶成光杆的病株，有的高达52%26。黄萎病给世界植棉业造成了严重的威胁，成为棉花生产的主要障碍，被称为“棉花的癌症”79。1.2 生物防治的概念在自然界中，任何植物个体都和其体内、外的微生物存在着密切的关系。这些微生物从对植物的作用上分为植物病原微生物和非病原微生物。在农林经济作物生产过程中，病原微生物侵害常会造成植物生长缓慢、停滞，影响果实的外观和品质，甚至引起作物毁灭性死亡，颗粒无收，造成巨大的经济损失。长期以来，为了挽回这些经济损失，防治病害，农药特别是化学农药发挥了巨大的作用。由
12、于采用化学农药进行植物病害防治见效快，杀菌谱广，成本低，使用简便等优点，其在农业防治中迅速发展，成为防病丰产的有效手段之一。但是长期、反复和大量使用化学农药存在着潜在的危害，它引起土壤、水体和大气的污染，农副产品中农药残留增加，直接危害了人类的健康及生存。而且化学农药在杀病原菌的同时也杀伤了其他有益微生物、昆虫和畜禽，破坏了生态平衡。同时由于导致植物病原真菌和细菌的抗药性不断加深和扩大，人们又不得不加大农药的施用量和频度，从而会造成化学农药应用的恶性循环10。随着人们环保意识的增强，以及对化学农药负面影响更深入的了解，如何既能达到高效杀死作物病原物又能维护生态平衡和获得优质、安全的农产品成为人
13、们日益关注的焦点11,12。利用生物防治不仅避免了化学农药带来的一系列问题，而且安全、有效和持久，已经发展成为植病防治中十分重要且日益得到重视的有效措施之一13。植物病害的生物防治是指通过除人以外的一种或多种生物及其有关因子来降低病原菌数量或减弱病原菌的致病活力，从而减少病原菌所致病害的发生14。拮抗微生物由于具有不易使病原菌产生耐药性，对人畜安全无毒，不污染环境，无残留，能保持生态平衡，生产工艺较简单以及不少拮抗微生物同时具有对作物的促生作用等特点而引起越来越多的人们的关注和重视，在植物病害的生物防治中发挥着重要的作用。1.3 枯草芽孢杆菌与黄萎病的关系Schreiber 等发现枯草芽孢杆菌
14、（B. subtilis）能够抑制黄萎菌菌丝的生长，通过测定发现B. subtilis 可以产生环状肽类的抗生素。Berg 等观察到拮抗细菌可造成黄萎病原菌菌丝顶端膨大；菌丝不正常分支和生长；菌丝内液泡增加；菌丝破裂并伴有细胞质溢出；产生不正常的微菌核现象。更为主要的结构异常是菌丝内线粒体的膨大。Berg 和Lottmann 以Stenotrophomonasmaltophilia 为模式菌，研究了拮抗细菌对油菜黄萎菌（Verticilliumlongisporum）的作用机制，发现S. maltophilia可以产生抗菌素（Maltophilin）、嗜铁素（Siderophore）、几丁质酶
15、和-1，3-葡聚糖酶等物质，证实了抗生素的产生是拮抗细菌对黄萎病原菌生长抑制的主要作用机制 15。1.4 拮抗细菌的作用机制拮抗细菌中研究较多的是芽孢杆菌（Bacillus sp.）。芽孢杆菌是自然界广泛存在的一类细菌，可以产生杆菌肽、环脂、氨基酸类、核酸类、类噬菌体颗粒等多种抗菌物质来抑制植物病原菌16-18。1.5 棉花黄萎病生物防治存在的问题和展望黄萎病原菌的生物防治效果不稳定，可能有各种因素所引发，其中有生防菌的原因；有的拮抗菌对营养有一定的要求，如黄蓝状菌（Talaromycesflavus）受环境影响大，防效不稳定，不彻底等。也有病原菌方面的原因，如黄萎菌本身发生变异17，也给黄萎
16、菌的生防增加了难度；同时还有环境的影响，环境条件的改变不利于生防因子发生作用或使生防因子失活等等。因此，要想得到理想的生防菌，应该注意以下特点：对病原菌具有较强的拮抗能力(抗生、重寄生、竞争等)；并且菌株在土壤中还要具有较强的竞争能力；对作物、高等动物以及环境一定要安全；可在一般的环境条件(pH 值、温度、湿度和光照等)下正常生长及有较强的定殖能力；可在人工合成培养基上生长繁殖，适合工厂化生产；明确拮抗菌的作用方式；具有方便的使用剂型。每种生防菌均有自己适宜的生存条件，为了更好的应用拮抗菌，下一步研究工作应弄清生防因子在土壤中最适宜的存活、繁殖条件。目前已有防治其他作物黄萎病的生防制剂商品，但
17、登记注册的防治棉花黄萎病的生防菌还未见报道。现代生物技术为黄萎病的生物防治提供了新的契机：现在对生防菌的防病机理研究已达到分子水平，若将遗传学、分子生物学和生态学方法结合使用，利用分子生物学等方法改造生防菌，研制基因重组生物制剂，提高其防治黄萎病的能力，同时使其具有对环境高抗逆性，对农药高抗性，高繁殖力，稳定性强等特性，从而切实发挥生物防治的优势。对生防菌进行定向改良，不仅可真正明确生防菌的防病机理，提高防治效果，而且会取得稳定的防治效果，使棉花黄萎病的生物防治和其他作物病害的生物防治被社会和生产者所接受，在今后持续农业发展中发挥更重要的作用。本研究拟从新疆主要棉区采集冻封后棉花根际土样，筛选
18、对棉花黄萎病原菌有较好拮抗效果的拮抗微生物，进一步鉴定其种类，为研制开发防治棉花黄萎病的新型生防制剂提供生防菌株资源及实验依据。2 实验材料与主要试剂菌种：大丽轮枝菌(VerticilliumdahaliaeKleb )土样：采集新疆连作棉田冻封后的棉花根际土样培养基：牛肉膏蛋白胨培养基，查氏培养基，LB液体培养基，淀粉培养基，明胶培养基配方（见附录）试剂：革兰氏染液 3 实验步骤3.1 土壤中芽孢菌的分离纯化实验在冻封后的连作棉田中选九个点每个点都取距地表515cm的棉花根际土壤，每三点的土样充分混合，风干后保存于牛皮纸袋中,记录采样时间、地点等信息。每种各取土样5 g,加入装有60mL无菌
19、水的试管中摇匀,100水浴10min, 然后取1.0mL进行10倍梯度稀释至10-6,分别取10-1、10-2、10-3 3个梯度的稀释液0.04mL涂布在牛肉高蛋白胨培养基平板上,37倒置培养15h。挑取形态、大小、色泽不同的单菌落分别划线转接至牛肉膏蛋白胨培养基上,并分别进行菌株编号,37培养,挑单菌落转接于LB液体培养基,常温下在摇床摇菌培养15h,然后置于4冰箱保存备用。同时将细菌涂布于牛肉膏蛋白胨培养基上备用。3.2 拮抗实验3.2.1 大丽轮枝菌的扩大培养用接种环轻轻刮取大丽轮枝菌斜面的孢子加入到含有1.0m无菌水,摇匀, 形成孢子悬液。用移液枪吸取0.04mL孢子悬液涂布于查氏培
20、养基，于28培养箱培养5d后再用同样的方法涂布扩大至六个平板上。3.2.2 大丽轮枝菌拮抗芽孢菌的筛选把直径0.5cm的圆形滤纸片放在刚涂布好的大丽轮枝菌培养基上,然后用移液枪吸取0.001mL菌液滴在滤纸片上，28培养7d，检查抑菌圈有无并测量其大小,挑选出抑菌圈的拮抗菌株备用。拮抗细菌的分级19：抑菌带D-D0=细菌抑菌圈直径（mm）细菌菌落直径(mm） 零级（0）：D-D0=0（无透明带产生）无拮抗性一级（）：0mmD-D03.9mm弱拮抗性二级（）：4mmD-D07.9mm中等拮抗性三级（）：D-D08.0mm强拮抗性3.2.3 拮抗菌保存实验对分离出的所有的菌，进行甘油保存，总共32
21、种菌株，对每种菌的平板进行挑菌，至于LB培养基中摇菌15h，再用移液枪移取0.8mL的菌液，加入0.2mL的甘油，摇匀后先后至于4、-20、-80以此保存，对有拮抗做用的菌株进行重复两次保存。3.2.4 芽孢菌的胞内胞外拮抗实验 对挑选出的7种拮抗菌，分别重新涂布在牛肉膏蛋白胨培养基上培养24h后, 用直径0.5cm的打孔器在长满菌苔的牛肉膏蛋白胨培养基上打孔，做一组对照实验，对照实验把打孔的小圆块去除顶端，把基部转移至刚涂布好的大丽轮枝菌培养基上，实验组不处理直接转移培养，28培养3 d，检查抑菌圈有无并测量其大小，观察胞内外拮抗作用有无不同。 3.3 菌株的革兰氏染色实验将出现拮抗现象的细
22、菌挑选出来，按常规方法涂布、涂布和固定，滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位，染色1min，水洗至流出水无色。再用卢卡氏碘液覆盖1min，水洗至无色，用吸水纸吸干，滴加95%乙醇脱色，水洗后，滴加番红染色2min，水洗吸干,显微镜下观察其菌体的形态20 。3.4 拮抗菌的生理生化鉴定实验3.4.1 淀粉水解的测定将固体淀粉培养基融化后冷却至50左右，无菌操作制成平板。取斜面培养的菌划线接种于平板，37培养24h，观察各种细菌的生长情况，打开平板盖子，滴入少量卢卡氏碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。如果菌落周围如有不变色透明圈，表示淀粉水解阳性；若是蓝黑色为阴性。3.4.2 明胶液
23、化取6支明胶培养基试管，用记号笔标明各管欲接种的菌名，用接种针分别穿刺接种6种接抗菌，于37温箱中培养，2-5d，在室温下观察生长情况和明胶是否液化。如菌已生长，明胶表面无凹陷且为稳定的凝块，则为明胶水解阴性。如明胶凝块部分或全部在37以下变为可流动的液体，则为明胶水解阳性。如菌已生长，明胶未液化，但明胶表面菌苔下出现凹陷小窝也是轻度水解，按阳性记录。若细菌未生长，则或是不在明胶培养基上生长，或是基础培养基不适宜。3.5 分子鉴定实验3.5.1 拮抗菌菌体的提取(1)对分离出的6种具有强拮抗作用的拮抗菌至于LB培养基中摇菌15h(2)对摇菌后的菌液进行革染氏鉴定，判断是否属于纯菌(3)吸取1.
24、6mL的摇菌培养物于2.0mL EP管中，12000r/min 离心30min收集菌体，吸取上清，保留细胞沉淀(4)再加入1.6mL的摇菌菌液于上(3)中的EP管中，12000r/min 离心30min，反复这一操作4次，获得一定量细胞沉淀3.5.2 拮抗菌的测序将提取的菌体送去鼎国生物公司测序部对16SrDNA测序。3.5.3 拮抗菌的分析测序结果在NCBI上进行blast分析。运用DNAman、clustalx1.83、Mega2对侧得的菌种进行系统树的制作。4 实验结果与分析4.1 土壤中芽孢菌的分离与纯化对土样进行沸水浴10min后，经牛肉膏蛋白胨培养基分离，筛选得到32株芽孢菌菌株。
25、4.2 棉花黄萎病拮抗菌的筛选32株芽孢菌经与大丽轮枝菌的平板对峙实验，筛选得到10株拮抗菌株：1、6、10、12、21、31、35、36、39、42。其中6、10、12、35、36、39六个菌株对棉花黄萎病菌的拮抗作用较强，抑菌圈试验结果见表1、图1-1、1-2、1-3。Table 1 Inhibitory tests of 12 strains of bacteria against V. dahliae拮抗细菌菌株Strains of antagnisticbacteria 6 10 12 35 3639 1 21 31 42 抑菌带(mm)9.718.611.29.610.19.3 6
26、.2 3.6 2.7 1.9抑菌带级别+10+10+ + + + +1212图1-1 对棉花黄萎病的拮抗图3535 6636363939图1-2 对棉花黄萎病的拮抗图21424221 1 13131图1-3 对棉花黄萎病的拮抗图4.3 棉花黄萎病拮抗细菌的鉴定结果4.3.1 菌落特点 6356单个菌落突起,表面光滑、不透明，淡黄色；10单个菌落突起,表面光滑、不透明、白色；12菌落乳白色、边缘褶皱、规则；35单个菌落突起,表面光滑、乳白色、边缘透明；36淡黄色、边缘褶皱、不透明；39乳白色、中间凸起、光滑、边缘褶皱、不透明、不规则。结果如图2-1。39121036图2 拮抗菌的菌落形态Figu
27、re 2 inhibitory action of colony morphology4.3.2 革兰氏染色结果表2 生理生化特征菌株（strains）610123536 39革兰氏染色(Grams stain）+ +4.3.3 拮抗菌的生理生化鉴定淀粉水解、明胶液化结果见表3。表3生理生化特征table 3Physiological and biochemical characteristics试验项目拮抗细菌菌株(Strains of antagnisticbacteria)61210353639淀粉水解+-明胶液化+4.3.4 拮抗菌分子坚定结果对筛选出拮抗菌6、10、12、35、36、
28、39六株菌和J-2菌进行16SrDNA测序后的结果不对和分析，绘制出进化树结果如图3：图3 六株菌和J-2菌的进化树5 鉴定结果根据菌株在牛肉膏蛋白胨平板上培养性状、革兰氏染色反应、芽孢染色、生理生化反应，细菌的16SrDNA鉴定，将12菌株鉴定为短小芽孢杆菌属（Bacillus pumilus）；将菌株6鉴定为芽孢杆菌属菌种、10菌株鉴定为芽孢杆菌属菌种、将35菌株鉴定为芽孢杆菌属菌种、36菌株鉴定为芽孢杆菌属菌种、39菌株鉴定为芽孢杆菌属菌种。讨论利用微生物之间的拮抗作用防治植物病害进行生物防治国内外已有较多的研究。鉴于棉花黄萎病对棉花的危害，筛选出对棉花黄萎病致病菌具有抗性的生物活性物质
29、正逐渐成为国内外专家研究的热点。10、12菌株具有较强的抗棉花黄菱病菌的能力。是非常适宜研究拮抗棉花黄萎病苗机制的实验材料。这两种菌株有望为培育出高抗棉花黄萎病的转基因棉花提供良好的基因资源。具有潜在的生态效益和社会效益。本研究表明，6、10、12、35、36、39在室内对棉花黄萎病致病菌大丽轮枝菌具有较强的拮抗作用，但这两株菌在棉田的环境中是否具有的同样强的拮抗作用,以及拮抗机制的研究工作正在进行中。根据芽孢杆菌耐酸、耐盐、耐高温及耐挤压的特性，试验采用的100水浴中热处理10 min的样品处理方式，从一定程度上简化了细菌分离的繁琐性，使分离细菌的操作简单化。本实验从土壤中分离得到10株拮抗
30、阳性芽孢菌，其中菌株12形态特征以及生理生化特性与文献报道的短小芽孢杆菌属（Bacillus pumilus）的特性是一致的，但是由于细菌生理生化性状的可变性以及某些细菌生理生化特性的相似性，而且实验中芽孢染色效果不好，就更难准确鉴定菌种，生理生化实验项目少，因此只得到初步结果。为进一步证实分离得到的细菌为短小芽孢杆菌，在生理生化鉴定的基础上又进一步做了分子生物学鉴定。16S rDNA基因序列分析在微生物种群分析方面应用广泛，已成为细菌分类和鉴定的一个有力工具。得到的结果是短小芽孢杆菌属（Bacillus pumilus）。参考文献1 沈其益，棉花病害基础研究与防治M. 北京：科学出版社，19
31、922 殷锡圣，刘润进. 棉花黄萎病研究进展J. 中国棉花，1996，23（5）：26.3 杨华,蔡立旺,潘群斌,等. 棉花黄萎病研究进展浅述J.江西棉花, 2006,(06).4 马平.棉花枯黄萎病生物防治研究进展J. 河北农业科学，2003, 7(3): 3844.5 房卫平，祝水金，季道藩. 棉花黄萎病菌与抗黄萎病遗传育种研究进展J. 棉花学报， 2001，13（2）：116120.6 石磊岩，冯洁，王莉梅，等. 北方植棉区棉花黄萎病菌生理分化类型研究J. 棉花学报， 1997，9（5）：273280.7 杜威世，杜雄明，马峙英. 棉花黄萎病抗性遗传和分子生物学研究进展J. 棉花学报，
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36、Cl 5.0 g 琼脂 15.020 g 水 1000 mLpH 7.27.4 121 蒸气灭菌20 min。2查氏培养基：硝酸钠(NaNO3) 3.0g 磷酸二氢钾(KH2PO4) 10.0g 硫酸镁(MgSO47H2O) 0.5g 氯化钾(KCl) 0.05g 硫酸亚铁(FeSO47H2O) 0.01g 蔗糖30.0g 琼脂15.0g 水1000mL pH 自然 121 蒸气灭菌20 min。3LB培养基:蛋白胨 10g酵母膏 5gNaCl 10g 蒸馏水 1000 mL摇动容器直至溶质溶解.用5mol/LNaOH调pH至7.0.在121高压下蒸汽灭菌20min.4.淀粉培养基牛肉膏 5.
37、0 g 蛋白胨 10.0 g NaCl 5.0 g 琼脂 15.020 g 可溶性淀粉 2g 蒸馏水1000 mL摇动容器直至溶质溶解分装试管中，121蒸汽灭菌20min，倒平板备用。5.明胶培养基牛肉膏蛋白胨液 100mL 明胶 1218g pH 7.27.4 按上述配方配制后分装试管，培养基高度约45cm，间歇灭菌或121 蒸气灭菌30 min。6.革兰氏染色染剂 结晶紫的混合液甲液：结晶紫 2.0g 乙醇（95%） 20mL 乙液：草酸铵 0.8g 蒸馏水 80mL将甲、乙两液相混，静置48h 后过滤使用。 卢卡氏碘液碘 1.0g 碘化钾 2.0g 蒸馏水 300mL先用少量（35mL）
38、蒸馏水溶解碘化钾，再投入碘片，待碘全部溶解后，加水稀释至300mL。脱色液 95%乙醇 丙酮乙醇溶液：95%乙醇 70mL，丙酮 30mL复染液 95%的番红（Safranine O）水溶液 取配好的番红-乙醇溶液 10mL与蒸馏水 80mL混匀即可7.芽孢染色液孔雀绿染液 孔雀绿(malachite green) 5g 蒸馏水 100mL番红水溶液 番红 0.5 蒸馏水 100mL附录2A6CTATCATGCAGTCGAGCGGACAGAAGGGAGCTTGCTCCCGGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTC
39、CGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAGTTCCTTGAACCGCATGGTTCAAGGATGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCcTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGG
40、GAAGAACAAGTGCAAGAGTAACTGCTTGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTG
41、TAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTTCCCTTCGGGGACAGAGTGAC
42、AGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCTGCGAGACCGCAAGGTTTAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCT
43、AGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGTGGTCAA10GGGGCGTGCTATACATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGCTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATA
44、AAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAA
45、GCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTCCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTG
46、GTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGgTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACG
