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1、赣 南 医 学 院 2008届毕业生论文益母草干浸膏质量标准及方法学验证学校名称： 赣西医学院 学生姓名： 专 业： 药学 学 号： 班 级： 04药学本科班 完成日期： 2008年2月 益母草干浸膏质量标准及方法学验证摘要 建立用薄层色谱法鉴别益母草干浸膏和测定益母草干浸膏中盐酸水苏碱含量的方法。方法：采用日本岛津CS-9301PC双波长薄层扫描仪，939型薄层铺板器，以0.5%羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板，以正丁醇-盐酸醋酸乙酯(8：3：1）和丙酮-无水乙醇盐酸(10：10：1）为展开剂，试剂：稀碘化铋钾试液-碘化钾碘试液(1：1）混合溶液、乙醇、 甲醇等。该方法操作简便易行，专属
2、性强，准确可靠，可用于益母草干浸膏的质量控制。关键词 薄层色谱法 CS-9301PC双波长薄层扫描仪 益母草 盐酸水苏碱1 引言益母草为唇形科植物益母草的新鲜或干燥地上部分。鲜品春季幼苗期至初夏花前期采割；干品夏季茎叶茂盛、花未开或初开时采割，晒干或切段晒干，具有活血调经，利尿消肿，清热解毒。临床常用于治月经不调，胎漏难产，胞衣不下，产后血晕，瘀血腹痛，崩中漏下，尿血，泻血，痈肿疮疡等等。其主要有效成分是盐酸水苏碱。益母草干浸膏是依据中国药典2010版中抗宫炎片中益母草干浸膏制法，用益母草为原材料而提取浸膏提取物。薄层色谱法 （thin layer chromatography ，TLC）系将
3、供试品溶液点于薄层板上，在展开容器内用展开剂展开，由于各组分在薄层上的移动距离不同，形成互相分离的斑点，从而使供试品所含成分分离，所得色谱图于适宜的对照物按同法所得的色谱图对比，并可用薄层扫描仪进行扫描，测定各斑点的位置及其密度，用于鉴别、检查或含量测定。其原理是利用各成分对同一吸附剂吸附能力不同，使在移动相（溶剂）流过固定相（吸附剂）的过程中，连续的产生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，从而达到各成分的互相分离的目的。 薄层层析可根据作为固定相的支持物不同，分为薄层吸附层析(吸附剂)、薄层分配层析(纤维素)、薄层离子交换层析(离子交换剂)、薄层凝胶层析(分子筛凝胶)等。一般实验中应用较多的是以
4、吸附剂为固定相的薄层吸附层析。吸附过程是可逆的，被吸附物在一定条件下可以解吸出来。在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡，称为吸附平衡。吸附层析过程就是不断地产生平衡与不平衡、吸附与解吸的动态平衡过程。例如用硅胶和氧化铝作支持剂，其主要原理是吸附力与分配系数的不同，使混合物得以分离。当溶剂沿着吸附剂移动时，带着样品中的各组分一起移动，同时发生连续吸附与解吸作用以及反复分配作用。由于各组分在溶剂中的溶解度不同，以及吸附剂对它们的吸附能力的差异，最终将混合物分离成一系列斑点。如作为标准的化合物在层析薄板上一起展开，则可以根据这些已知化合物
5、的Rf值对各斑点的组分进行鉴定，同时也可以进一步采用某些方法加以定量。 Rf=溶质移动的距离/溶液移动的距离，表示物质移动的相对距离。各种物质的Rf随要分离化合物的 结构，滤纸或薄层板的种类、溶剂、温度等不同而不同，但在条件固定的情况下，Rf对每一种化合物来说是一个特定数值。薄层层析有许多优点：它保持了操作方便、设备简单、显色容易等特点，同时展开速率快，一般仅需1530分钟；混合物易分离，分辨力一般比以往的纸层析高10100倍，它既适用于只有001g的样品分离，又能分离大于500mg的样品作制备用，而且还可以使用如浓硫酸、浓盐酸之类的腐蚀性显色剂。薄层层析的缺点是对生物高分子的分离效果不甚理想
6、。 薄层扫描法系指用一定波长的光照射在经薄层板上，对具有吸收或经激发后能发射荧光的层析斑点进行扫描，将扫描得到的图谱和积分数据用于物质的定性或定量的分析方法。测定时可根据不同薄层扫描仪的结构特点，按照规定方式扫描测定，一般选择反射方式，采用吸收法或荧光法。扫描方法可采用用单波长扫描或双波长扫描。双波长扫描：两个不同波长的光束交替扫描样品展开的通道区域，波长选择时，一个波长为样品最大吸收位置，另一是吸收极小值位置。这种方法可基本消除铺板不均产生的误差，因此扫描基线很稳定。本实验采用双波长锯齿反射法进行扫描。2 实验内容2.1实验材料日本岛津CS-9301PC双波长薄层扫描仪，939型薄层铺板器，
7、以0.5%羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板，以正丁醇-盐酸醋酸乙酯(8：3：1）为展开剂，试剂：乙醇 甲醇等；BT25S型电子分析天平（德国-赛多利斯科学仪器有限公司）；盐酸水苏碱对照品（供含量测定用，中国药品生物制品检定所提供）; 益母草干浸膏（江西心正药业有限责任公司）。益母草干浸膏提取生产工艺A 提取：取净益母草，置提取罐内加水煎煮二次，第一次加水量为药材重量的3倍，密闭煎煮2小时，第二次加水量为药材重量的2倍，密闭煎煮2小时，气压均恒定在0.20.5kg/平方厘米，温度恒定在100110。合并煎煮液滤过，静置24小时。B 浓缩：取静置滤液，用新型三效浓缩器浓缩。浓缩温度控制在75左
8、右，真空度/蒸汽压力为0.06/0.09Mpa，浓缩至流体相对密度为1.10-1.20左右（60）。C干燥：流体用不锈钢盘盛好放入真空干燥炬内进行减压干燥，水分控制在33.5%之间。检验合格后装入洁净内袋，再套入洁净外袋，扎严，称重，同时镇写中间产品检验申请单，连同检验报告单一起入净药材库存。（每1g干浸膏相当于原药材14.0g。水份不得过5.0%）。2.2实验方法鉴别（1）依据中国药典2010版抗宫炎片中益母草干浸膏的鉴别办法进行。（2）取益母草干浸膏1g，加乙醇20ml，超处理30分钟，滤过，滤液加在中性氧化铝柱（100-200目，5g，内径为1cm）上，用乙醇20 ml洗脱，收集滤液与洗
9、脱液，蒸干，残渣加乙醇5ml溶解，作为供试品溶液。另取盐酸水苏碱对照品，加乙醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液10 l、上述对照品的溶液4 l，分别点于同一以0.5%羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以丙酮-无水乙醇盐酸(10：10：1）为展开剂，展开，取出，晾干，先喷以10%硫酸乙醇溶液，再喷以稀碘化铋钾试液-碘化钾碘试液(1：1）混合溶液，冷风吹干，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。 含量测定仪器：薄层扫描仪 、硅胶G薄层板试剂：乙醇 甲醇取益母草干浸膏1g，精密称定，置具塞
10、锥形瓶中，加乙醇30ml，超声处理45分钟，滤过，药渣及滤器用乙醇15ml分3次洗涤，收集洗液和滤液，浓缩至约2ml加于已处理好的活性炭-氧化铝柱(内径1cm，活性炭1g，中性氧化铝4g，200300目，200活化2小时，干法装柱)上，先加乙醇2ml用甲醇5ml，分次洗涤容器，洗液加于柱上，再用甲醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，定量转移至5ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另精密称取在105C干燥至恒重的盐酸水苏碱对照品20mg，置5ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每lml中含盐酸水苏碱4mg的溶液，作为对照品溶液照薄层色谱法(中国药典2010年
11、版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各10l，分别点于同一以0.5%羧甲基纤维素钠溶液制备的硅胶G薄层板上：以正丁醇盐酸醋酸乙脂(8：3：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周围用胶布固定，照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB薄层扫描法)进行扫描，波长，s=525nm，R=600nm，测量供试品吸收度分 值与对照品吸收度积分值，计算，即得。本品每克含盐酸水苏碱(C7H13ClNO2)，不得少于0.9%。3 实验结果3.1色谱条件薄层扫描仪CS-9301PC双波长；薄层板：0.5%羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板；展开剂：正丁
12、醇-盐酸醋酸乙酯(8：3：1）和丙酮-无水乙醇盐酸(10：10：1）为展开剂；显色剂：稀碘化铋钾试液。3.2对照品溶液的制备取盐酸水苏碱对照品20mg，置5ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每lml中含盐酸水苏碱4mg的溶液，作为对照品溶液。3.3供试品溶液的制备取益母草干浸膏1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加乙醇30ml，超声处理45分钟，滤过，药渣及滤器用乙醇15ml分3次洗涤，收集洗液和滤液，浓缩至约2ml。加于已处理好的活性炭-氧化铝柱(内径1cm，活性炭1g，中性氧化铝4g，200300目，200活化2小时，干法装柱)上，用甲醇5ml，分次洗涤容器，洗液加于柱上，再用甲
13、醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，定量转移至5ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。3.4 线形关系考察 取盐酸水苏碱对照品适量，精密称定，置5ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每lml中含盐酸水苏碱4.05mg的溶液，作对照品溶液。分别精密吸取2 L、5 L、8ul、10 L、15 L、20 L分别点于同一以0.5%羧甲基纤维素钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以正丁醇盐酸醋酸乙脂(8：3：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周围用胶布固定，照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB薄层扫描法)进行扫描，
14、波长：s=525nm，R=600nm测量供试品吸收度积分值与对照品吸收度积分值，计算，结果表明，盐酸水苏碱在8.1g- 81g范围内其峰面积与吸取量呈良好的线形关系。见表1表1 盐酸水苏碱对照品线性范围测定结果样品号点样量m斑点面积积分值Aulug12 8.1832.2322520.252076.6533832.43342.29641040.54165.32551560.756252.218620818330.649A= 102.89m-0.496 r=0.99999线性范围： 8.1g- 81g 3.5 精密度试验（1）同板精密度测定 取样品（批号20091201）30g，研细，分别取3 g
15、，精密称定，提取，样品点于同一块薄层层析板上，按含量测定方法测定含量，结果见表2。表2 样品的精密度测定结果（同板）水苏碱百分含量（%）0.9150.9180.9260.9100.9290.921RSD（%）0.76%（2）异板精密度测定 同上法，将样品分别点于二块薄层层析板上，分别测定含量，结果见表3表3 样品的精密度测定结果（异板）水苏碱百分含量（%）0.9120.9230.931待添加的隐藏文字内容30.9220.9150.928RSD（%）0.79%以上结果表明同板与异板样品精密度均较好。3.6 稳定性试验取盐酸水苏碱对照品溶液10ul点于0.5%CMCNa硅胶G板上，展开，显色，每隔
16、15min或30min重复测定盐酸水苏碱的积分值，测定持续到360min，结果见表4、5。测定时间（min）15306090120150180斑点面积积分值（A）4175.3284142.2014105.2124020.3293929.3863801.3283702.856表4 盐酸水苏碱不同时间测定的试验结果表5 盐酸水苏碱显色90分钟后在30分钟内测定的试验结果测定时间（min）90100110120斑点面积积分值（A）4168.0234176.2354182.5624172.231结果表明：1.5h后，测定值趋于稳定。在0.5h内测定完毕误差较小。所以本法规定显色后1.5h开始进行测定，
17、0.5h内完成测定。表6 盐酸水苏碱含量测定试验结果样品编号12345测得含量(%)0.9210.9150.9060.9230.918平均值(%)0.9166RSD(%)0.723.7 加样回收试验取本品（批号 20100402 ）30g。研细，称取5份，精密称定。分别准确加入一定量水苏碱标准品。按样品方法测定含量计算回收率，结果见表7表7 加样回收试验结果称样量（g） 样品中水苏碱含量（mg/g）加入水苏碱的量（mg）测出水苏碱的量（mg）回收率1.523649.168.9616.3490.15%1.496989.0116.0588.35%1.510239.0316.5691.00%1.50
18、6588.9916.2689.61%1.510069.0416.5991.14%平均回收率=90.05% RSD（%）=0.76%结果表明本法回收率较好。3.8 样品测定取本品3批按正文操作，测得结果见表8 表8 样品含量测定结果批 号含量（%）平均含量（%）201001010.9160.921200912010.935200911030.909201004020.927201007030.920据上述实验结果，暂定本品含生物碱以盐酸水苏碱（C7H13CINO1）计。不得少于0.9%，折算成每克含盐酸水苏碱不得少于9mg。结论本品采用s=525nm, R=600nm,反射锯齿双波长薄层扫描法测
19、定益母草中有效成分水苏碱的含量，回归方程：A= 102.89m-0.496，r=0.9999.线性范围为8.1ug81ug；样品精密度，同板：RSD=0.76%（n=6）,异板：RSD=0.79 %（n= 6）；平均加样回收率90.05 %，RSD=0.76%（n= 5）。结论：该方法操作简便易行，专属性强，准确可靠，可用于益母草干浸膏的质量控制。参考文献1 巩长芹，张师愚，常筠.HPLC法测定益母草药材、益母草颗粒及复方益母草膏中益母草碱的含量.黑龙江医药,2007年6期.2 聂晶，余建清，邱国福，胡先明.高效液相法测定益母草中益母草碱含量研究简介.分析科学学报,ISTIC PKU -200
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